劉 瀟 李 明

（中國人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心骨科醫(yī)學(xué)部，國家骨科與運(yùn)動康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100853）

骨缺損是骨科醫(yī)師面臨的臨床棘手難題，隨著近年來骨組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，生物材料植入成為骨缺損修復(fù)最具潛力的治療手段［1］。生物材料植入體內(nèi)后，會立即引起免疫系統(tǒng)的異物排斥反應(yīng)，植入的材料與血液相互作用在材料表面形成臨時基質(zhì)，包括纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)、血小板和炎癥細(xì)胞，之后由炎癥細(xì)胞觸發(fā)急性炎癥，特征為中性粒細(xì)胞或多形核白細(xì)胞的招募和激活［2-6］，多形核白細(xì)胞在降解材料的過程中會釋放蛋白水解酶和活性氧，腐蝕材料的表面，并在48 h 后迅速衰竭凋亡［7］。與此同時，部分免疫細(xì)胞被招募到生物材料中，進(jìn)一步誘發(fā)宿主和局部組織的炎癥反應(yīng)，這時宿主免疫系統(tǒng)中的單核細(xì)胞黏附于植入的生物材料表面，并分化為M1/M2 巨噬細(xì)胞［8-10］。巨噬細(xì)胞開始對生物材料進(jìn)行吞噬和清除，在其周圍形成纖維蛋白基質(zhì)，進(jìn)而形成纖維包膜包裹生物材料［4］，將其與周圍組織分離，形成僅有機(jī)械支撐功能的惰性材料，割斷了骨微環(huán)境中骨髓與材料間的相互作用，成骨細(xì)胞無法附著材料表面形成新骨，而此時骨缺損部位完全被纖維組織填充，最終導(dǎo)致植入材料無法降解、新骨無法長入替代，骨缺損修復(fù)失?。?1］。

近年來隨著骨免疫在骨再生領(lǐng)域的研究不斷深入，研究者逐漸發(fā)現(xiàn)在局部骨微環(huán)境的形成中，生物材料植入體內(nèi)后引起局部骨微環(huán)境中免疫應(yīng)答的變化是決定誘導(dǎo)成骨、骨重塑成功與否的核心因素之一［12-13］。良好的免疫應(yīng)答可通過調(diào)節(jié)生長因子、趨化因子、炎癥因子等多種因子表達(dá)，調(diào)控骨再生中成骨分化、破骨分化、纖維化和血管化等多個與骨再生密切相關(guān)的過程，在骨再生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［14］。因此，本文就主要參與骨移植材料微環(huán)境中免疫應(yīng)答的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子間的作用機(jī)制進(jìn)行綜述，從而明確骨微環(huán)境免疫應(yīng)答調(diào)控缺陷的關(guān)鍵難題，進(jìn)而為開發(fā)具有良好骨免疫調(diào)節(jié)特性的生物材料提供一些啟示與思考。

1 免疫細(xì)胞在骨微環(huán)境免疫應(yīng)答中的作用和機(jī)制

1.1 中性粒細(xì)胞 生物材料植入體內(nèi)后，臨時基質(zhì)中的炎癥細(xì)胞立即招募中性粒細(xì)胞對生物材料進(jìn)行吞噬降解，中性粒細(xì)胞成為最先被激活到達(dá)材料周圍血液中的免疫細(xì)胞［4］，然后分泌趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1β（macrophage inflammatory protein-1β，MIP-1β），誘導(dǎo)募集單核巨噬細(xì)胞到達(dá)損傷部位［3，15］。一些學(xué)者也認(rèn)為早期炎癥中性粒細(xì)胞的浸潤和分泌趨化因子的行為是骨微環(huán)境中控制骨折愈合的關(guān)鍵限速步驟［16］。此外，中性粒細(xì)胞也可表達(dá)NF-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL），并通過RANKL/NF-κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成，觸發(fā)骨吸收調(diào)節(jié)［17］。還有研究表明中性粒細(xì)胞還可通過在骨折后48 h 內(nèi)快速合成纖維連接蛋白促進(jìn)骨折愈合［18］。中性粒細(xì)胞的募集與蛋白質(zhì)和巨噬細(xì)胞在生物材料上的募集吸附密切相關(guān)，影響材料的生物相容性，因此調(diào)控中性粒細(xì)胞功能成為生物材料設(shè)計(jì)的重要關(guān)注點(diǎn)。

1.2 單核/巨噬細(xì)胞 單核/巨噬細(xì)胞是生物材料誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中最重要的效應(yīng)細(xì)胞之一，材料植入體內(nèi)后立即啟動急性炎癥反應(yīng)，急性炎癥后單核細(xì)胞黏附于損傷部位，并分化為巨噬細(xì)胞和多核巨細(xì)胞進(jìn)入慢性炎癥過程，巨噬細(xì)胞可隨著骨微環(huán)境的變化而改變?yōu)椴煌硇?，這種表型變化對骨缺損修復(fù)的成敗具有至關(guān)重要的作用［19-20］。一般來說，巨噬細(xì)胞表型分為M1 型（經(jīng)典活化）和M2 型（交替活化），M1表型被稱為促炎型，產(chǎn)生一系列促炎細(xì)胞因子、趨化因子等，通過誘導(dǎo)骨微環(huán)境的炎癥反應(yīng)保護(hù)組織免受外來物質(zhì)的侵襲，同時上調(diào)RANKL 增強(qiáng)破骨細(xì)胞分化和骨吸收［21］；而M2 表型被稱為抗炎型，產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子，抑制炎癥，并促進(jìn)血管生成、組織愈合和骨組織的再生［4］。值得注意的是，巨噬細(xì)胞表型的變化并不是單純從M1 向M2 的變化，而是在不同的免疫應(yīng)答過程中形成不同比例的混合表型［22］。目前研究普遍認(rèn)為理想的生物材料應(yīng)當(dāng)充分誘導(dǎo)M1 向M2 轉(zhuǎn)換，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)骨組織重建修復(fù)［23-24］。但也有文獻(xiàn)報道，過度激活M2型巨噬細(xì)胞會增加促纖維化因子（TGF-β1、TGF-β3等）釋放，反而導(dǎo)致生物材料被炎性纖維組織包裹而修復(fù)失?。?5-26］。因此只有充分理解巨噬細(xì)胞表型在不同免疫應(yīng)答階段的變化規(guī)律，才能更好地調(diào)控骨微環(huán)境向有利于成骨的方向變化，進(jìn)而促進(jìn)骨愈合，修復(fù)骨缺損。

1.3 淋巴細(xì)胞 淋巴細(xì)胞包括T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞，在骨微環(huán)境中承擔(dān)不同功能。生物材料植入后，隨著時間的推移，由急性炎癥逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y，慢性炎癥激活的T 細(xì)胞可增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的成骨分化，參與慢性炎癥下的骨再生［27］。T 細(xì)胞也分為不同亞群，其中Th1和Th2均通過分泌INF-γ和IL-4抑制破骨細(xì)胞形成，而Th17 細(xì)胞和Th17 相關(guān)細(xì)胞因子可導(dǎo)致RANKL 水平明顯升高，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成［28］。另一方面，CD4+T 細(xì)胞通過IL-4、IL-10 和CTLA-4 抑制破骨細(xì)胞分化，NKT 細(xì)胞表達(dá)巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，MCSF）和RANKL 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成［29］。B 淋巴細(xì)胞是骨髓源性O(shè)PG 的主要來源，約占64%［30］。B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的OPG在Th1細(xì)胞因子存在的情況下抑制破骨細(xì)胞功能，并通過Th2 細(xì)胞因子發(fā)揮催化作用。B 淋巴細(xì)胞與T 淋巴細(xì)胞通過CD40/CD40L 共刺激通路協(xié)同上調(diào)OPG，因此B 淋巴細(xì)胞被認(rèn)為是破骨細(xì)胞形成的主要抑制劑之一［31］?？傮w而言，當(dāng)前對于淋巴細(xì)胞在骨再生中的作用研究尚缺乏，鮮有文獻(xiàn)闡明不同階段T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞在骨再生中的具體作用，該領(lǐng)域有待進(jìn)一步探索［16］。

1.4 其他免疫細(xì)胞 還有一些免疫細(xì)胞也參與了骨微環(huán)境中的免疫調(diào)控，包括肥大細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）等。肥大細(xì)胞主要參與破骨細(xì)胞形成，因此肥大細(xì)胞數(shù)量的增多會導(dǎo)致骨丟失增加，而肥大細(xì)胞數(shù)量減少則會影響骨重塑［32-34］。DCs 影響T 淋巴細(xì)胞的免疫功能，成熟的DCs 可激活并上調(diào)Th17 細(xì)胞促進(jìn)破骨形成［35］。與此同時，DCs 在與CD4+T 細(xì)胞的相互作用中，通過MCSF 和RANKL 通路轉(zhuǎn)分化為破骨細(xì)胞［36］。另一方面，DCs可以攝取抗原（例如壞死的組織和細(xì)胞、引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的生物材料等），然后將其呈遞給T淋巴細(xì)胞，同時釋放細(xì)胞因子，改變局部免疫微環(huán)境，調(diào)控下一步的抗原特異性免疫反應(yīng)［37-38］。當(dāng)前對于這些免疫細(xì)胞發(fā)揮成骨調(diào)節(jié)作用的詳細(xì)過程報道較少，對其在骨免疫應(yīng)答不同階段所起的調(diào)節(jié)作用仍有待進(jìn)一步研究。

2 細(xì)胞因子在骨微環(huán)境免疫應(yīng)答中的作用和機(jī)制

2.1 促炎細(xì)胞因子 生物材料植入體內(nèi)后誘導(dǎo)的代表性促炎細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-1α/β和IL-6［39-40］，這些細(xì)胞因子主要由促炎M1 巨噬細(xì)胞分泌，多種促炎細(xì)胞因子間的交叉作用在維持早期骨免疫環(huán)境、招募MSCs 至骨缺損部位、刺激MSCs 增殖和分化等方面極為重要［16］。其中TNF-α、IL-1α/β 和IL-6可通過RANKL/RANK/OPG 系統(tǒng)增強(qiáng)破骨細(xì)胞分化和吸收活性，抑制成骨細(xì)胞活性和骨形成［22，41］。但有研究表明，低劑量的TNF-α（1 ng/ml）可將肌源性基質(zhì)細(xì)胞招募到骨缺損部位，增強(qiáng)其成骨分化，促進(jìn)骨修復(fù)［42］。促炎細(xì)胞因子含量在高表達(dá)幾天后迅速下降，值得注意的是，TNF-α 和IL-1β 的表達(dá)水平呈現(xiàn)雙峰模式，即在炎癥初期前24 h 和骨重塑末期出現(xiàn)高峰［43］。另一些研究則表明在早期炎癥中，低劑量的TNF-α 和IL-6 能促進(jìn)MSCs 向損傷部位招募，并刺激其向成骨細(xì)胞分化，有利于新骨的形成［44-45］。而持續(xù)性炎癥時這些促炎細(xì)胞因子則會發(fā)揮其原本的促破骨抑制成骨作用，對骨再生產(chǎn)生負(fù)面影響［46］。SCHMIDT-BLEEK 等［47］對正常和延遲骨愈合模型中細(xì)胞因子分泌譜進(jìn)行的研究表明，延遲骨愈合模型中促炎細(xì)胞因子較正常骨愈合模型顯著增加。因此筆者認(rèn)為在生物材料誘導(dǎo)的骨微環(huán)境中，早期促炎因子低劑量釋放有利于MSCs 的招募，促進(jìn)成骨；而促炎因子高劑量釋放或持續(xù)釋放導(dǎo)致的長期炎癥環(huán)境則阻礙成骨。提示骨微環(huán)境中不同細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞、成骨/破骨細(xì)胞、MSCs的相互作用需要動態(tài)的視角進(jìn)行認(rèn)識與分析。

2.2 抗炎細(xì)胞因子 生物材料植入體內(nèi)后誘導(dǎo)的代表性抗炎細(xì)胞因子包括IL-1RA、IL-4、IL-10、TGF-β，除IL-4 外，這些細(xì)胞因子主要由抗炎型M2巨噬細(xì)胞分泌［4］。IL-1RA 是IL-1（促炎細(xì)胞因子）的抑制劑，通過調(diào)節(jié)IL-1 的成骨不良作用促進(jìn)骨形成［39］。IL-4也是巨噬細(xì)胞M2表型的強(qiáng)誘導(dǎo)因子，可加速成骨細(xì)胞增殖，但一定程度上會抑制成骨細(xì)胞分化，而IL-10 則可增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化，并具有抗破骨細(xì)胞作用［26，39，48］。CHA 等［49］通過對IL-4 誘導(dǎo)三維水凝膠中M2 巨噬細(xì)胞的研究認(rèn)為，不良免疫反應(yīng)是導(dǎo)致生物材料植入和臨床轉(zhuǎn)化失敗的關(guān)鍵因素，盡管炎癥是組織再生的重要組成部分，但慢性炎癥的產(chǎn)生最終會導(dǎo)致骨修復(fù)失敗。HACHIM 等［50］進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)證明IL-4 涂層處理的生物材料促進(jìn)了M2 表型的極化，體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn)證明，在免疫應(yīng)答的早期階段，使用IL-4涂層植入物的小鼠在組織-植入物界面的M2 巨噬細(xì)胞百分比增加，M1 巨噬細(xì)胞百分比減少，促進(jìn)早期巨噬細(xì)胞向M2 轉(zhuǎn)化，有利于生物材料周圍纖維包裹的減少和后期骨整合能力的改善。TGF-β 是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號通路的上游成骨細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)MSCs 向成骨細(xì)胞分化［51］。與此同時，TGF-β還是纖維化過程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，通過成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）途徑誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖［52］。綜上所述，生物材料介導(dǎo)的骨微環(huán)境中的抗炎細(xì)胞因子對成骨多發(fā)揮有利作用，但TGF-β 的過表達(dá)可能導(dǎo)致材料表面纖維化，形成纖維包裹，影響后期的骨整合，因此將TGF-β 作為減少纖維化的靶點(diǎn)細(xì)胞因子可能成為未來生物材料設(shè)計(jì)的關(guān)鍵點(diǎn)。

2.3 其他細(xì)胞因子 另一些細(xì)胞因子也被報道參與生物材料誘導(dǎo)的骨微環(huán)境免疫調(diào)控，通過調(diào)節(jié)成骨與破骨平衡、骨重塑等途徑對骨缺損修復(fù)產(chǎn)生影響。MSCF 由成骨細(xì)胞表達(dá)，通過Akt 和MAP 激酶途徑與受體（c-Fms）結(jié)合，刺激RANK 表達(dá)，誘導(dǎo)破骨前細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的存活和凋亡［53］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是內(nèi)皮細(xì)胞高度特異性的有絲分裂原，與酪氨酸激酶受體結(jié)合導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和新血管生成，是骨再生過程中最重要的血管生成因子之一［54］。研究表明，VEGF 在各種動物模型中通過耦合調(diào)節(jié)骨生成與血管生成實(shí)現(xiàn)骨再生［55-56］。IL-33是破骨細(xì)胞的抑制劑，與IL-4 結(jié)合后可促進(jìn)單核細(xì)胞向DCs 和巨噬細(xì)胞分化，抑制破骨前體細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化，干擾破骨細(xì)胞形成［57-58］。其他細(xì)胞因子如IL-10、IL-17、IFN 家族等也通過不同途徑在骨再生中發(fā)揮重要作用。IL-10 可通過干擾活化T 細(xì)胞胞漿核因子表達(dá)抑制骨吸收，而核因子是破骨細(xì)胞分化的重要因素［59］。IL-17可引起局部炎癥、刺激RANKL 表達(dá)，并通過誘導(dǎo)TNF-α和IL-1激活破骨前體細(xì)胞［60］。IFN家族主要包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ，均可抑制破骨細(xì)胞分化［61］。除上述細(xì)胞因子外，IL-11、IL-8、CXCL12、CCL2 也可能參與破骨細(xì)胞的形成［57，62-63］。但目前對于這些細(xì)胞因子在骨免疫微環(huán)境中的相互影響和具體機(jī)制報道較少，尚待進(jìn)一步研究。

3 發(fā)展與展望

目前的研究雖然對骨微環(huán)境中免疫應(yīng)答的機(jī)制有了一定的了解，但許多問題仍然沒有解決，一些免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的作用機(jī)制尚未闡明，研究者需要進(jìn)一步探索不同免疫細(xì)胞在免疫調(diào)控不同階段的動態(tài)變化，深入理解各種免疫細(xì)胞因子在不同修復(fù)時期發(fā)揮的作用和相互影響。本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為誘導(dǎo)新骨生成和實(shí)現(xiàn)完整功能的新骨填充骨缺損部位的關(guān)鍵點(diǎn)應(yīng)該在合理調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能上，包括抑制炎癥性巨噬細(xì)胞活性、促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，其他免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子應(yīng)動態(tài)協(xié)同調(diào)控該過程，進(jìn)而改善局部微環(huán)境的成骨效應(yīng)，增強(qiáng)骨整合并促進(jìn)新骨形成。同時由于免疫細(xì)胞具有自分泌、旁分泌特點(diǎn)，應(yīng)將骨微環(huán)境中參與免疫應(yīng)答的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子看作一個彼此獨(dú)立、相互影響的整體進(jìn)行評估和分析。當(dāng)前生物材料正在從傳統(tǒng)誘導(dǎo)免疫耐受的惰性材料向誘導(dǎo)主動免疫應(yīng)答并具有“免疫調(diào)節(jié)”能力的生物材料方向發(fā)展。闡明生物材料誘導(dǎo)的骨微環(huán)境中的免疫應(yīng)答機(jī)制是突破當(dāng)前材料的“免疫應(yīng)答調(diào)控缺陷”瓶頸的“金鑰匙”，探索材料“適度誘導(dǎo)”免疫調(diào)控、“精準(zhǔn)調(diào)控”目標(biāo)因子、與不同階段的免疫微環(huán)境“交互反饋”及對成骨和破骨細(xì)胞實(shí)時“動態(tài)調(diào)控”的改性策略將是未來材料的研究方向。隨著學(xué)者們的深入研究與不斷探索，利用具有主動免疫調(diào)節(jié)特性并且能根據(jù)不同階段骨微環(huán)境變化而自主響應(yīng)的“智能化”生物材料，實(shí)現(xiàn)新骨的再生和臨界尺寸骨缺損的良好修復(fù)終將成為現(xiàn)實(shí)。