廖晗婧 郭 冉 羅揚淦 盧姿含 郝逗逗 朱枝祥（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029）

肥大細胞是引起過敏性疾病的重要效應(yīng)細胞，過敏反應(yīng)又稱為Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，主要由患者體內(nèi)肥大細胞激活而誘發(fā)。目前認為肥大細胞驅(qū)動的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)主要通過肥大細胞表達IgE 高親和力FcεRⅠ受體，與過敏原特異性IgE 抗體結(jié)合形成IgE-FcεRⅠ復(fù)合物，過敏原刺激后，肥大細胞被活化，導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)和細胞因子釋放，從而引起Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)［1-3］。因此，獲取大量高質(zhì)量的肥大細胞對進一步研究其在Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)進程中的作用及抗過敏藥物的藥效和作用機制具有重要意義。

目前過敏反應(yīng)研究的體外細胞模型大多使用大鼠腫瘤化RBL-2H3 細胞株，這種細胞雖保留了肥大細胞和嗜堿性粒細胞的多種功能，能夠用于抗過敏藥物初步篩選，但仍與原代細胞有很大差異，不能完全滿足抗過敏藥物藥效評價和機制研究需求［4-5］。體外原代培養(yǎng)的肥大細胞具備更完整的成熟肥大細胞特性，因此獲得大量原代培養(yǎng)的肥大細胞對肥大細胞及抗過敏藥物研究至關(guān)重要［6］。通過體外誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取高質(zhì)量的肥大細胞還缺乏系統(tǒng)性的方法學(xué)研究，已有方法學(xué)研究缺乏細胞表型和功能鑒定，嚴重制約了抗過敏藥物的研發(fā)進程［7-9］。本研究通過體外培養(yǎng)骨髓造血干細胞和祖細胞，利用不同細胞因子誘導(dǎo)肥大細胞分化，比較各種誘導(dǎo)方法對肥大細胞分化的影響，初步建立一種高效可行的原代肥大細胞培養(yǎng)方法，從而為肥大細胞功能調(diào)節(jié)藥物的藥效和作用機制研究提供高質(zhì)量的肥大細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡SPF 級雄性C57BL/6小鼠9 只，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動物合格證號：1100112011044776，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物房屏障環(huán)境。飼養(yǎng)環(huán)境恒溫恒濕，室溫（24±1）℃，濕度（50±5）%，光照黑暗交替12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。所有動物實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會審批（BUCM-4-2020082503-3075）。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640 細胞培養(yǎng)液購自美國Cytiva 公司；青霉素和鏈霉素混合液、胎牛血清購自美國Corning 公司；Hank′s 平衡鹽溶液（Hank′s balanced salt solution，HBSS）購自美國ThermoFisher公司；紅細胞裂解液購自北京佰瑞達生物科技有限公司；FITC 標記的大鼠抗小鼠CD117 抗體、PE 標記的大鼠抗小鼠CD49b 抗體、APC 標記的大鼠抗小鼠FcεRⅠ抗體、7-氨基放線菌素D（7-AAD）死細胞染色液購自美國BD Biosciences 公司；干細胞因子（stem cell factor，SCF）、IL-3 購自美國PeproTech 公司；牛血清白蛋白、偶聯(lián)牛血清白蛋白的二硝基苯（DNP-BSA）、抗DNP 的IgE 抗體、β-己糖胺酶底物4-硝基苯基N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖購自美國Sigma-Aldrich 公司；磷脂酶C（phospholipase C，PLC）抑制劑U73122、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）抑制劑Staurosporine購自美國Selleck Chemicals公司。

1.1.3 主要儀器 MCO-18AIC CO2細胞培養(yǎng)箱購自日本三洋公司；DM500倒置顯微鏡購自德國Leica公司；FACSCantoTMⅡ流式細胞儀購自美國BD 公司；Enspire多功能酶標儀購自美國PerkinElmer公司。

1.2 方法

1.2.1 肥大細胞誘導(dǎo)培養(yǎng) 頸椎脫臼處死C57BL/6小鼠，75%乙醇浸泡小鼠全身5 min，超凈臺無菌取小鼠股骨骨髓，利用1 ml 注射器吸取含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基將骨髓細胞沖至15 ml 無菌離心管，室溫300 g 離心5 min，棄上清；加5 ml 紅細胞裂解液裂解紅細胞，室溫300 g 離心5 min，棄上清；加5 ml 含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基清洗細胞，室溫300 g 離心5 min，棄上清；加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸細胞，經(jīng)細胞計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為2×106個/ml，接種至24 孔板（500 μl/孔）；設(shè)置3 種不同刺激孔：SCF 孔（終濃度50 ng/ml）、IL-3 孔（終濃度20 ng/ml）及SCF（終濃度50 ng/ml）和IL-3（終濃度20 ng/ml）聯(lián)合刺激孔，培養(yǎng)基總體積1 ml；37 ℃、5%CO2培養(yǎng)4 周，每3.5 d 半量更新培養(yǎng)基，并重新添加1次細胞因子。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細胞生長 第1、2、3、4 周取上述細胞在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況并進行拍照。

1.2.3 細胞計數(shù)和傳代 第1、2、3、4周重懸細胞，取各孔細胞懸液10 μl與等體積臺盼藍染色液混合，吸取到細胞計數(shù)板，倒置顯微鏡下進行活細胞計數(shù)，根據(jù)細胞增殖情況按適當(dāng)比例傳代培養(yǎng)。

1.2.4 流式細胞術(shù)分析肥大細胞 第1、2、3、4 周取各孔部分細胞至2 ml 離心管，4 ℃、300 g 離心5 min 后棄上清，并利用200 μl 流式染色緩沖液（含0.2%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，pH=7.2）重懸；各樣本中加入FTIC標記的大鼠抗小鼠CD117抗體、PE 標記的大鼠抗小鼠CD49b 抗體、APC 標記的大鼠抗小鼠FcεRⅠ抗體和死細胞染色液7-AAD，終濃度均為1 μg/ml，冰浴染色30 min；加入1 ml 流式染色緩沖液清洗細胞，4 ℃、300 g 離心5 min 后棄上清，加入400 μl流式染色緩沖液重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞表面FcεRⅠ和CD117表達。

1.2.5 肥大細胞功能測定 將上述各孔誘導(dǎo)培養(yǎng)4 周的細胞收集至15 ml 離心管，離心去上清，利用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1.5×106個/ml，100 μl/孔接種至96 孔板，設(shè)置對照組、模型組及模型+給藥組；將細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，6 h后模型組及模型+給藥組50 μl/孔加入抗DNP 的IgE 抗體，其余孔加入等體積含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2孵育過夜；棄上清，100 μl/孔加入HBSS緩沖液孵育10 min，模型+給藥組50 μl/孔加入U73122（終濃度1 μmol/L）或Staurosporine（終濃度1 μmol/L），其余孔加入等體積HBSS，孵育15 min，模型組及模型+給藥組各孔加入50 μl DNP-BSA 至終濃度1 μg/ml，孵育1 h，取出96孔板，每孔吸50 μl細胞上清至另一96孔板，向上清中50 μl/孔加入4-硝基苯基N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖（pH=4.5 的0.05 mol/L 檸檬酸緩沖液配制，濃度為1 mmol/L）孵育1 h，加入200 μl 0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH=10.0）終止反應(yīng)，酶標儀于405 nm處測定OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 利用FlowJo 7 軟件分析流式細胞檢測的源文件，分析活細胞中肥大細胞和嗜堿性粒細胞比例。定量數(shù)據(jù)利用表示，GraphPad Prism 5.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析及后續(xù)Dunnett 檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞生長狀態(tài) 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)3 d 時，開始鋪板的部分細胞死亡碎片化，SCF 刺激孔僅剩余少量細胞，IL-3 單獨刺激孔、SCF和IL-3 聯(lián)合刺激孔有明顯細胞增殖；1 周時，SCF 刺激孔細胞有少量增殖，IL-3 單獨刺激孔、SCF 和IL-3聯(lián)合刺激孔出現(xiàn)較快細胞增殖；2 周時，SCF 刺激孔細胞仍有少量增殖，IL-3 單獨刺激孔、SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔細胞增殖很快，體積較大的增殖期細胞較多；3周時，SCF 刺激孔細胞基本停止增殖，IL-3單獨刺激孔、SCF 和IL-3聯(lián)合刺激孔細胞增殖仍很快，體積較大的增殖期細胞較多；4 周時，SCF 刺激孔細胞明顯減少，細胞碎片增多，IL-3 單獨刺激孔、SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔細胞增殖仍很快，SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔細胞相比IL-3 單獨刺激孔增殖期細胞比例更高（圖1）。

圖1 細胞體外培養(yǎng)照片（×100）Fig.1 Pictures of cultured cells in vitro（×100）

2.2 活細胞計數(shù) 根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果和傳代數(shù)量及比例統(tǒng)計不同培養(yǎng)時間各刺激組細胞總數(shù)，結(jié)果顯示不同細胞因子處理孔細胞增殖情況存在較大差異，SCF 刺激孔細胞增殖速度最慢，SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔細胞增殖速度最快。體外培養(yǎng)2 周后，IL-3刺激孔細胞數(shù)量相比SCF 單獨刺激孔顯著增加（P<0.05）；體外培養(yǎng)1 周后SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔細胞數(shù)量相較SCF 刺激孔和IL-3 刺激孔顯著增加（P<0.05，圖2）。

圖2 各誘導(dǎo)條件對活骨髓細胞總數(shù)的影響Fig.2 Effects of different induction conditions on total numbers of live bone marrow cells

2.3 BMMC 分化 骨髓細胞培養(yǎng)的第1、2、3、4 周，收集經(jīng)各種誘導(dǎo)條件處理的細胞進行流式分析，F(xiàn)lowJo 軟件分析7-AAD-細胞中CD117 和FcεRⅠ表達，結(jié)果顯示隨著誘導(dǎo)時間增長，SCF刺激孔、IL-3刺激孔、SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔中7-AAD-CD117+FcεRⅠ+肥大細胞在7-AAD-細胞中占比也逐漸升高。細胞培養(yǎng)4 周流式圖可見，SCF 單獨刺激孔和IL-3 單獨刺激孔仍具有明顯分群的雜細胞，SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔中主要為單一細胞群，根據(jù)統(tǒng)一的設(shè)門標準，BMMC 比例為52%左右，其他細胞可能為幼稚期肥大細胞（圖3A）。根據(jù)各刺激孔中活細胞總數(shù)和7-AAD-CD117+FcεRⅠ+BMMC 比例，計算各孔中BMMC 總數(shù)，結(jié)果顯示3 種誘導(dǎo)條件均可使BMMC 比例及總數(shù)上升，IL-3 單獨刺激孔BMMC 比例最高（P<0.05），SCF 和IL-3 聯(lián)合孔BMMC 總數(shù)顯著高于SCF 單獨刺激孔和IL-3 單獨刺激孔（P<0.05，圖3B、C）。

圖3 流式細胞術(shù)分析BMMC分化Fig.3 Analysis of BMMC differentiation by flow cytometry

2.4 嗜堿性粒細胞分化 分析BMMC 分化同時，本研究也分析了嗜堿性粒細胞分化，通過分析7-AAD-細胞CD49b和FcεRⅠ表達，分析不同誘導(dǎo)條件下7-AAD-CD49b+FcεRⅠ+嗜堿性粒細胞在7-AAD-細胞中的占比，結(jié)果顯示SCF 刺激孔嗜堿性粒細胞比例始終非常低；IL-3 刺激孔嗜堿性粒細胞比例最高，但隨著誘導(dǎo)時間增長，嗜堿性粒細胞比例不斷下降；SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔同樣是初期有一定比例嗜堿性粒細胞，但隨著時間增長比例逐漸降低（圖4A）。根據(jù)各種誘導(dǎo)條件刺激孔活細胞總數(shù)和7-AAD-CD49b+FcεRⅠ+嗜堿性粒細胞比例，計算各孔嗜堿性粒細胞總數(shù)，結(jié)果顯示在3 種誘導(dǎo)條件下的嗜堿性粒細胞比例及總數(shù)有顯著差異，IL-3 刺激孔嗜堿性粒細胞比例1 周起即顯著高于SCF 刺激孔及SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔（P<0.05）；SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔嗜堿性粒細胞比例一開始顯著高于SCF刺激孔（P<0.05），但4周后嗜堿性粒細胞比例降低，與SCF 刺激孔差異無統(tǒng)計學(xué)意義。IL-3 刺激孔嗜堿性粒細胞總數(shù)從1 周起顯著高于SCF 刺激孔（P<0.05）；SCF 和IL-3聯(lián)合刺激孔嗜堿性粒細胞總數(shù)從1 周起即顯著高于SCF 刺激孔，2 周起顯著高于IL-3刺激孔（P<0.05，圖4B、C）。

圖4 流式細胞術(shù)分析嗜堿性粒細胞分化Fig.4 Analysis of basophil differentiation with flow cytometry

2.5 BMMC的釋放功能 根據(jù)流式分析，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 周，SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔細胞主要為BMMC，收集該細胞，利用抗DNP 的IgE 抗體致敏BMMC，加入DNP-BSA 刺激BMMC 釋放顆粒，測定β-己糖胺酶釋放量評價BMMC 釋放功能，結(jié)果顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)4 周后，SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔BMMC 經(jīng)抗DNP 的IgE抗體致敏和DNP-BSA 刺激后β-己糖胺酶釋放量較對照組顯著升高（P<0.05）。同時分析了BMMC 活化和顆粒釋放中需要的PLC 和PKC 抑制劑對其釋放β-己糖胺酶的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示PLC 抑制劑U73122 和PKC 抑制劑Staurosporine 處理組相比模型組均能顯著抑制β-己糖胺酶釋放（P<0.05，圖5）。

圖5 BMMC釋放β-己糖胺酶分析Fig.5 Analysis of β-hexosaminidase release of BMMC

3 討論

SCF 及其受體c-Kit 在造血干細胞和祖細胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用，對肥大細胞發(fā)育發(fā)揮不可替代的作用，SCF 或c-Kit 基因突變均會導(dǎo)致肥大細胞大幅度減少，皮下注射外源SCF 則會導(dǎo)致注射部位肥大細胞大幅度增加［10-12］。IL-3 同樣對早期造血祖細胞和部分晚期祖細胞發(fā)育發(fā)揮重要作用，體內(nèi)注射IL-3 能夠?qū)е路蚀蠹毎褪葔A性粒細胞顯著增加［13］。目前常用的肥大細胞原代培養(yǎng)方法有SCF/IL-3 單獨誘導(dǎo)以及SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)，肥大細胞的原代培養(yǎng)方法尚無確定標準［14-18］，因此本研究比較了不同誘導(dǎo)方式對肥大細胞分化的影響，確定肥大細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的最適宜方法和時間，初步建立了一種高效可行的原代肥大細胞培養(yǎng)方法。

本研究顯示SCF 單獨誘導(dǎo)可促進肥大細胞分化，提高肥大細胞比例，但對肥大細胞分化過程中的細胞增殖促進作用較弱，獲得的肥大細胞總數(shù)較少，表明SCF 單獨誘導(dǎo)可能僅能促進晚期肥大細胞祖細胞增殖和分化，獲得的肥大細胞純度和數(shù)量均有限。IL-3單獨誘導(dǎo)相較于SCF 單獨誘導(dǎo)不僅促進了肥大細胞分化，提升肥大細胞比例，同時也促進了肥大細胞分化過程中的細胞增殖，培養(yǎng)4 周獲得的肥大細胞總數(shù)是SCF 單獨誘導(dǎo)培養(yǎng)的10 倍，可能由于IL-3 對能夠分化為肥大細胞祖細胞的早期造血細胞增殖和分化具有促進作用。SCF 和IL-3聯(lián)合誘導(dǎo)相對于SCF單獨誘導(dǎo)肥大細胞純度和總數(shù)均有顯著提高；SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)相對于IL-3 單獨誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的肥大細胞純度有所降低，但總數(shù)是IL-3 單獨誘導(dǎo)的100 倍，表明SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)能夠促進多個層次造血祖細胞增殖和分化為肥大細胞，顯著提高獲得的肥大細胞質(zhì)量和數(shù)量。雖然SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)4 周獲得的肥大細胞中有較多幼稚細胞，但獲得的肥大細胞純度和數(shù)量非?？捎^。

IL-3能夠誘導(dǎo)嗜堿性粒細胞產(chǎn)生［13］。本研究同時分析了嗜堿性粒細胞分化，結(jié)果表明SCF 單獨誘導(dǎo)未提高嗜堿性粒細胞比例和總數(shù)。IL-3單獨誘導(dǎo)可較強地促進骨髓細胞向嗜堿性粒細胞分化，嗜堿性粒細胞比例最高的時間為誘導(dǎo)后第1周。隨著體外培養(yǎng)時間延長，嗜堿性粒細胞比例不斷下降，總數(shù)增加幅度也非常有限，可能由于IL-3 僅能促進晚期造血祖細胞分化為嗜堿性粒細胞，同時嗜堿性粒細胞存活時間較短。SCF 和IL-3聯(lián)合誘導(dǎo)各時間點嗜堿性粒細胞比例均低于IL-3單獨誘導(dǎo)，SCF和IL-3聯(lián)合誘導(dǎo)的嗜堿性粒細胞總數(shù)在第2 周后高于IL-3單獨誘導(dǎo)，但數(shù)量遠低于肥大細胞。因此，SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓細胞4 周可獲得大量高純度的肥大細胞。

獲得大量高純度的肥大細胞后，本研究進一步利用抗DNP 的IgE 抗體致敏和DNP-BSA 刺激肥大細胞脫顆粒反應(yīng)，通過檢測釋放的β-己糖胺酶活性評價肥大細胞功能［14-15］，結(jié)果表明SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓細胞4 周獲得的肥大細胞經(jīng)抗DNP 的IgE抗體致敏和DNP-BSA 刺激后，β-己糖胺酶釋放量較對照組顯著升高，表明SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)4 周的肥大細胞具有完整功能。另外本研究分析了PLC 抑制 劑U73122 和PKC 抑制劑Staurosporine 對肥大細胞β-己糖胺酶釋放的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示兩種陽性抑制劑均能顯著抑制肥大細胞釋放β-己糖胺酶，表明SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)4 周的肥大細胞可用于抗過敏藥物的藥效和作用機制研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓細胞4 周能夠獲得大量高純度且功能完整的肥大細胞，可用于后續(xù)通過調(diào)節(jié)肥大細胞功能用于抗過敏藥物的藥效和作用機制研究。