趙小芳 凌存保 顏聲祥 張虎

基金項目：鹽城市科技局項目（YK2018066）

作者簡介：趙小芳，女，碩士研究生，講師。

【摘要】 目的 基于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，分析內(nèi)吞適配蛋白Epsin3（EPN3）在乳腺癌中的表達及臨床意義。方法 應用TCGA數(shù)據(jù)庫門戶網(wǎng)站UALCAN、cBioPortal、Oncomine等分析EPN3在乳腺癌中的表達變化及預后關(guān)系；應用癌癥多組學分析數(shù)據(jù)平臺LinkedOmics分析在乳腺癌中EPN3的表達變化與臨床指標的關(guān)系。結(jié)果 乳腺導管癌中EPN3基因表達較正常乳腺組織顯著上調(diào)（P＜0.01）且EPN3高表達不利于患者預后；乳腺癌中EPN3的表達受組織學類型、病理階段、病理T階段、病理N階段、原癌基因人類表皮生長因子受體、雌激素受體、孕激素受體、PM50類型、患者種族、腫瘤純度、年齡和淋巴結(jié)數(shù)量的影響（P＜0.05）。結(jié)論 EPN3高表達不利于乳腺癌預后，可作為篩選和治療乳腺癌的相關(guān)靶點。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌；內(nèi)吞適配蛋白Epsin3；預后

Expression and prognosis of endocytic adaptor protein Epsin3 in breast cancer

Zhao Xiaofang，Lin Cunbao，Yan Shengxiang，Zhang Hu. Jiangsu Vocational College of Medicine，Yancheng， Jiangsu? 224005

【Abstract】 Objective To investigate the expression，prognostic significance and functional mechanism of Epsin3 （EPN3） based on TCGA analysis. Methods The expression and prognostic significance of EPN3 in breast cancer was analyzed by TCGA portal UALCAN.Analysis of the changes of EPN3 in breast cancer and its relationship with clinical prognosis through LinkedOmics. Results EPN3 is highly expressed in breast cancer （P＜0.01） and is not conducive to prognosis .The expression of EPN3 in breast cancer is affected by histological type，pathological stage，pathological T stage， pathological N stage， proto-oncogene human epidermal growth factor receptor， estrogen receptor， progesterone receptor， PM50 type， patient ethnicity， tumor purity ，age and the number of lymph nodes（P＜0.05）. Conclusion EPN3 is highly expressed in breast cancer and is not conducive to prognosis. EPN3 can be used as a target for screening and treatment of breast cancer.

【Key words】Breast cancer；Epsin3；Prognostic

中圖分類號：R581.9? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1672-1721（2023）31-0010-04

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.31.004

乳腺癌（breast cancer，BC）是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（international agency for research on cancer，IARC）

2020年發(fā)布的全球最新惡性腫瘤負擔數(shù)據(jù)顯示，全球乳腺癌新發(fā)病例高達226萬例，是全球第一大惡性腫瘤[1]。隨著醫(yī)療科技水平的提高，乳腺癌治療預后效果良好，但術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移仍是導致乳腺癌病人死亡的主要因素。我國乳腺癌發(fā)病率高達25.89/10萬，占所有女性惡性腫瘤發(fā)病率的 16.83%[2]。我國乳腺癌患病人數(shù)占總?cè)藬?shù)的比例不斷增加，且患病年齡呈下降趨勢，對女性的健康、生活造成嚴重威脅，給醫(yī)療保健和社會經(jīng)濟帶來巨大的挑戰(zhàn)。尋找和研究新的乳腺癌發(fā)生和預后相關(guān)靶分子對乳腺癌患者具有重要意義。

內(nèi)吞適配蛋白Epsin3（EPN3）是網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞適應蛋白家族Epsin的成員之一[3]。Epsin是一種保守的內(nèi)吞性網(wǎng)格蛋白適配器，其網(wǎng)格蛋白膜動力學中的重要功能尚不明確[4]。據(jù)報道，Epsin在皮膚癌、肺癌、前列腺癌幾種惡性腫瘤中被上調(diào)，且通過抑制內(nèi)吞網(wǎng)格蛋白包被小窩的肌動蛋白依賴性，抑制細胞內(nèi)吞作用[5]。重要的是Epsin的缺失或下調(diào)可減少腫瘤的發(fā)生，從而證明Epsin具有致癌作用[6]。已有研究表明，Epsin家族促進纖維肉瘤遷移和侵襲[7]，且其與Notch信號通路的激活有關(guān)[8]。

EPN3是一種蛋白質(zhì)編碼基因，又稱EPS-15相互作用蛋白3，它主要定位于細胞膜、細胞外與細胞核內(nèi)。有文獻報道，EPN3可作為一種細胞外基質(zhì)誘導的針對損傷上皮細胞的轉(zhuǎn)錄物[9]，且EPN3基因的異位表達可影響足葉乙甙誘導的衰老表型[10]。其相關(guān)途徑與PAK和上皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的內(nèi)吞有關(guān)。但是，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，EPN3的具體作用機制尚不清楚。通過研究乳腺癌中靶分子EPN3的作用，補充乳腺癌發(fā)生發(fā)展機制，為乳腺癌在患者預后時提供候選標志物和對于提高患者生存率至關(guān)重要。

1? ?材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 數(shù)據(jù)通過腫瘤基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）門戶網(wǎng)站UALCAN、cBioPortal，癌癥芯片數(shù)據(jù)庫Oncomine獲得，深入分析TCGA基因表達譜數(shù)據(jù)，可查詢腫瘤和正常組織中基因的差異表達。通過癌癥多組學分析數(shù)據(jù)平臺LinkedOmics可分析基因表達與臨床指標的相關(guān)性。

1.2 分析方法 打開cBioPortal網(wǎng)站首頁，選擇“breast invasive carcinoma （TCGA Provisional）”數(shù)據(jù)集，病例組選擇“tumor samples with mRNA data （RNA Seq V2）（1100）”，分別分析EPN3基因的突變、拷貝數(shù)畸變、mRNA水平變化以及EPN3表達上調(diào)與患者預后的關(guān)系。進入 UALCAN網(wǎng)站首頁，選擇“breast invasive carcinoma” 數(shù)據(jù)庫類型，輸入基因名稱“EPN3”，分析在乳腺癌中EPN3基因表達變化及它與預后生存率的關(guān)系。進入LinkedOmics網(wǎng)站首頁，癌癥類型選擇“TCGA_BRCA”，繼而選擇“HiSeq RNA”檢索數(shù)據(jù)集，輸入 基因“EPN3”，選擇“Clinical”數(shù)據(jù)集，統(tǒng)計方法選擇“non-parametrict test”，下載P＜0.05的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中EPN3基因的表達 cBioPortal篩選出EPN3基因在乳腺癌患者中呈高表達且不利于預后?；赥CGA多組學高通量數(shù)據(jù)篩選，研究發(fā)現(xiàn)乳腺導管癌EPN3基因的表達較正常乳腺組織明顯上調(diào)（P＜0.01）（圖1D）。其中，15%的乳腺癌患者中 EPN3（EXP≥2）基因呈高表達（圖1B），且EPN3高表達不利于患者預后（P＜0.01）（圖1C）；而16%的乳腺癌患者發(fā)生EPN3基因改變，包括基因突變（錯義突變、截斷突變）、拷貝數(shù)變化和 mRNA 的變化（圖1A）。

2.2 乳腺癌中EPN3表達與臨床指標的相關(guān)

性 通過篩選發(fā)現(xiàn)乳腺癌中EPN3的表達受到組織學類型、病理階段、病理T階段、病理N階段、患者種族、腫瘤純度、年齡和淋巴結(jié)數(shù)量的影響（P＜0.05）（圖2A、B、C、D、I、J、K、L）；原癌基因人類表皮生長因子受體陽性患者中EPN3的表達顯著高于陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖2E）；孕激素受體陽性患者中EPN3的表達顯著高于陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2F）；雌激素受體陽性患者中EPN3的表達顯著高于陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖2G）；不同PAM50亞型乳腺癌中EPN3的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖2H）。

2.3 基因拷貝數(shù)畸變和甲基化水平對EPN3表達的影響 Linkedomics篩選TCGA多組學高通量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，EPN3的表達與其基因拷貝數(shù)增加呈顯著正相關(guān)，而與其DNA甲基化水平呈顯著負相關(guān)（圖3）。

3 討論

Epsins作為內(nèi)吞輔助蛋白或替代受體（用于EGFR和VEGFR2等蛋白受體），在網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞和網(wǎng)格蛋白非依賴性的貨物內(nèi)化中起著關(guān)鍵的生理作用，作為內(nèi)吞作用的補充，Epsins還具有信號功能并參與多種細胞活動[11]。Epsins可參與包括細胞增殖、黏附、凋亡以及血管形成等，不僅在正常的組織生長發(fā)育過程中起重要作用，在各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。研究表明，Epsins與多種腫瘤的細胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學行為密切相關(guān)[4]。已有不少研究表明，Epsin蛋白家族可作為致癌調(diào)節(jié)因子參與惡性腫瘤的發(fā)生和進展過程[5]。Epsins家族成員EPN1、EPN2 在前列腺癌、肺癌及人類皮膚癌中的表達上調(diào)[6-7，12]，并發(fā)現(xiàn)在胃癌、結(jié)腸癌及基底細胞癌中EPN3的表達升高[13]。

另外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，EPN與P53存在相關(guān)性，Epsins可負向調(diào)節(jié)IFN-α-p53途徑下游的乙型肝炎病毒RNA的表達[14]，并且有促進細胞衰老的作用。然而另有研究指出，細胞的內(nèi)吞作用負向調(diào)控衰老是在細胞正常的生長狀態(tài)下進行的[15]，但Epsins介導的細胞內(nèi)吞作用可促進細胞自噬，有助于誘導細胞衰老[16-17]。有研究表明，EPN3通過激活轉(zhuǎn)錄因子Slug、Twist和ZEB1而不是Snail 1或ZEB2來增強膠質(zhì)母細胞瘤細胞的遷移和侵襲，從而在膠質(zhì)瘤細胞中誘導EMT[18]。

綜合以上研究，提示EPN3可能在細胞的增殖、侵襲以及遷移的過程中起著非常重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)EPN3在乳腺癌中呈高表達，其原因可能在于EPN3的高表達會促進乳腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移，并促進了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。有文獻指出，EPN3可通過調(diào)節(jié)ER陽性乳腺癌中的NF-κB信號通路促進細胞增殖并抑制細胞凋亡。另有文獻報道，在乳腺癌細胞中，乳腺癌復發(fā)的風險因素增加與Notch 信號通路的激活呈正相關(guān)，而EPN3可能參與膠質(zhì)瘤細胞Notch 1 信號的激活[18-19] ，從而激活相關(guān)信號通路。這與EPN3的高表達不利于患者預后結(jié)果相一致。

通過LinkedOmics數(shù)據(jù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌在不同的病理階段或不同的組織學類型中，EPN3的表達變化也不同。這提示EPN3可能在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的不同階段起作用。在乳腺癌患者中，原癌基因人類表皮生長因子受體陽性患者中EPN3的表達顯著高于陰性患者，雌激素受體陽性患者中EPN3的表達顯著高于陰性患者，這與Hellwig在非小細胞肺癌和雌激素受體陽性的乳腺癌中，EPN3的高表達與晚期轉(zhuǎn)移的風險增加相關(guān)的研究結(jié)果一致[6]。而不同種族和年齡的乳腺癌患者中EPN3的表達也具有差異，表明EPN3的表達可能具有地域和時間的特異性。乳腺癌在不同種族、不同年齡及不同病理表現(xiàn)中EPN3表達變化不同，提示乳腺癌發(fā)生和發(fā)展具有個體差異，即腫瘤的異質(zhì)性。

為了揭示靶分子EPN3表達增加的上游調(diào)節(jié)機制，研究分別進行了基因拷貝數(shù)畸變CNA、DNA甲基化的分析和驗證工作。結(jié)果顯示，基因拷貝數(shù)畸變CNA、DNA甲基化在腫瘤發(fā)展中起重要作用。腫瘤相關(guān)基因的拷貝數(shù)畸變可以激活癌基因促進或抑制抑癌基因的表達。基因的拷貝數(shù)畸變可使基因劑量發(fā)生改變或者調(diào)節(jié)基因的表達活性，從而促進或抑制基因的表達，在腫瘤的發(fā)生和進展中起作用[20]。研究表明，在表觀遺傳學中DNA的甲基化有重要作用，特別是基因啟動子區(qū)，其甲基化可影響基因的表達。DNA的低甲基化可以促進癌基因的表達，而DNA的高甲基化可以沉默腫瘤抑制基因。在臨床上，通過檢測特定癌基因的拷貝數(shù)畸變可以指導疾病的治療和預后，而藥物干預基因的甲基化也是惡性腫瘤治療中的重要研究方向。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者中，EPN3的基因拷貝數(shù)畸變與DNA甲基化具有相關(guān)性。

迄今為止，EPN3在癌癥的病理發(fā)展或?qū)M織和細胞特異性的具體作用仍未知。此次項目研究了EPN3在乳腺癌組織中的表達及EPN3在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的潛在作用。研究結(jié)果顯示，EPN3作為致癌基因編碼的蛋白質(zhì)可能促進腫瘤的生長和發(fā)展。抑制EPN3可能會激活或抑制某種機制，以抑制乳腺癌的發(fā)病及進展。盡管此次研究結(jié)果只是基于高通量數(shù)據(jù)庫的分析，但也為乳腺癌的治療及其預后復發(fā)風險的檢測提供了相關(guān)思路，后續(xù)將繼續(xù)研究臨床乳腺癌患者EPN3高表達的具體機制。

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