王紫薇，李成濤，劉希玲

1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，江蘇 蘇州 215123；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室 司法部司法鑒定重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063

DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾形式，主要是指基因組DNA 上的胞嘧啶C-5 號碳原子在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，以共價鍵結(jié)合的方式獲得一個甲基基團，從而形成5-甲基胞嘧啶的化學(xué)修飾過程。DNA 甲基化在動、植物基因組中廣泛存在，可隨DNA 復(fù)制遺傳給子代，且其修飾模式對基因調(diào)控、轉(zhuǎn)座子沉默及基因印記至關(guān)重要[1-3]。

研究[4-7]表明，個體年齡與DNA 甲基化水平顯著相關(guān)。這類與年齡相關(guān)的DNA 甲基化位點被稱為年齡相關(guān)甲基化位點（age-related CpG site，AR-CpG）。通過對AR-CpG 甲基化水平的測定可實現(xiàn)對個體年齡的推斷，其預(yù)測精度較高，因而具有較高的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值[8]。國內(nèi)學(xué)者針對中國漢族人群也開展了一些探索性研究并構(gòu)建了相應(yīng)的DNA 甲基化年齡推斷模型[9-13]，其中PAN 等[11]研究構(gòu)建的模型年齡覆蓋范圍較廣且精度較高。

目前絕大多數(shù)DNA 甲基化檢測方法都是在亞硫酸氫鹽處理基因組DNA 的基礎(chǔ)上進行的，其基本原理是將非甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不受影響，在后續(xù)PCR 過程中將尿嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，繼而將化學(xué)修飾差異轉(zhuǎn)化為序列差異信息。相較于PAN 等[11]所用的多重甲基化SNaPshot 技術(shù)，焦磷酸測序通過酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)可對單個CpG 位點的甲基化程度同時進行定性和定量分析，其精確度和可重復(fù)性相對較高且檢測周期短[14]。目前已有商業(yè)化試劑盒能夠完成焦磷酸測序，且從亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA 起始量到上樣量的靈敏性、穩(wěn)定性均有研究[15-16]。除此之外，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，多重目的區(qū)域甲基化富集測序技術(shù)可以獲得目標(biāo)區(qū)域內(nèi)所有甲基化胞嘧啶的甲基化數(shù)據(jù)，能精確計算甲基化程度且可同時對大量樣本進行多區(qū)域DNA 甲基化水平的并行檢測和分析[17]。

已有DNA 甲基化年齡推斷模型大多依托單一檢測技術(shù)或單一人群構(gòu)建，對于其是否適用于其他檢測技術(shù)或其他人群仍需進一步研究。為了探討PAN等[11]開發(fā)的DNA 甲基化年齡推斷模型在中國華東漢族人群中的可重復(fù)性以及是否適用于焦磷酸測序和多重目的區(qū)域甲基化富集測序平臺，本研究基于該模型[11]中包含的AR-CpG 位點，使用焦磷酸測序和基于下一代測序（next-generation sequencing，NGS）的多重目的區(qū)域甲基化富集測序技術(shù)在中國華東漢族人群中進行檢測，評估該模型在不同人群以及不同技術(shù)平臺中的年齡推斷效率，探索血液年齡推斷模型在不同DNA 甲基化檢測技術(shù)下用于法醫(yī)學(xué)年齡推斷的適用性。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究實驗對象來自中國華東地區(qū)48 例漢族無關(guān)個體，其中男性24 例，女性24 例，年齡覆蓋范圍為3～86 歲且年齡分布均勻（表1）。志愿者本人或其監(jiān)護人均在采集外周血樣本前簽署知情同意書。以上樣本的采集和使用均已獲得司法鑒定科學(xué)研究院倫理委員會批準(zhǔn)（審批號2022-5）。

表1 48 例樣本的年齡和性別組成Tab.1 Age and gender composition of the 48 samples（例）

1.2 DNA 提取與定量

使用QIAamp?DNA Blood Mini 試劑盒（德國Qiagen 公司），參照試劑盒操作說明對48 例外周血樣本進行DNA 提取，使用Qubit?2.0 熒光計、Qubit?ds-DNA HS Assay 試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）對DNA 進行定量。

1.3 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化DNA

使用EpiTect Fast Bisulfite 試劑盒（德國Qiagen公司），參照操作說明以每例樣本400 ng 的DNA 為起始量進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化后的DNA 溶液，并使用QubitTMssDNA 檢測試劑盒（美國Invitrogen 公司）進行濃度測定，置于-20 ℃條件下保存。

1.4 引物設(shè)計及PCR 擴增

參考文獻[11]中選取的6 個甲基化位點，使用Pyro-Mark Assay Design 2.0 軟件（德國Qiagen 公司）對位點進行引物設(shè)計。CpG 位點及引物信息如表2 所示。按照PyroMark PCR 試劑盒（德國Qiagen 公司）操作說明，以10 ng 轉(zhuǎn)化后的DNA 為起始量進行PCR 擴增：95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)45 次；72 ℃ 10 min。

表2 6 個AR-CpG 的引物信息Tab.2 Primer information of 6 AR-CpG

1.5 焦磷酸測序

基于焦磷酸測序數(shù)據(jù)，對同一個樣本的6 對引物進行3 次重復(fù)實驗。在PyroMark?Q48 自動焦磷酸測序軟件（德國Qiagen 公司）上進行程序設(shè)置，包括測序序列的生成和測序樣本的相關(guān)信息。使用軟件中的內(nèi)部質(zhì)量控制設(shè)置進行質(zhì)量控制，并設(shè)置3 個重復(fù)樣本，按照默認(rèn)參數(shù)進行甲基化位點分析。將10 μL PCR 產(chǎn)物、測序引物和測序用試劑PyroMark?Q48 Advanced CpG Reagents（德國Qiagen 公司）按照儀器操作提示分別加入PyroMark?Q48（德國Qiagen 公司）中，待程序運行結(jié)束，導(dǎo)出測序結(jié)果。將焦磷酸測序結(jié)果文件導(dǎo)入軟件，軟件自動進行CpG 數(shù)據(jù)分析。導(dǎo)出內(nèi)含測序峰圖和目的位點的甲基化水平信息的測序結(jié)果文件。

1.6 NGS 數(shù)據(jù)分析

使用1.4 節(jié)所得PCR 產(chǎn)物，將同一樣本的多個位點產(chǎn)物混合，利用TruSeq?Nano DNA Library Prep試劑盒（美國Illumina 公司）進行文庫構(gòu)建，向各個樣本添加特異性分子標(biāo)簽，再將所有樣本進行混合，接著進行文庫瓊脂糖凝膠純化回收，經(jīng)過文庫質(zhì)量檢驗和定量后，進行樣本混合，在NovaSeq 6000 測序系統(tǒng)（美國Illumina 公司）上采用單端150 bp 測序模式進行文庫測序。測序數(shù)據(jù)使用TrimGalore v0.6.1 軟件（https：//github.com/FelixKrueger/TrimGalore/releases）進行質(zhì)量控制并去除測序接頭序列。經(jīng)過質(zhì)量控制后的測序數(shù)據(jù)通過Bismark v0.23.1 軟件（https：//github.com/FelixKrueger/Bismark/releases）比對到“bismark genome preparation”處理后的參考基因組[從UCSC（www.genome.ucsc.edu）上下載]上。此后，使用Bismark v0.23.1 軟件進行甲基化信息提取，并對唯一比對reads 比例值、平均測序深度進行測序質(zhì)量評估。

1.7 年齡相關(guān)性分析與推斷年齡

將焦磷酸測序、NGS 技術(shù)所得DNA 甲基化水平代入年齡推斷公式[11]中計算個體的DNA 甲基化年齡并將其與個體真實年齡比較。

由1.5節(jié)、1.6節(jié)所得DNA甲基化水平，使用Graph-Pad Prism v8.4.3 軟件（美國GraphPad Software 公司，http：//www.graphpad-prism.cn）進行皮爾遜相關(guān)性分析，檢驗6個AR-CpG 在2種檢測技術(shù)下所測甲基化水平與樣本年齡之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient，r），使用配對t檢驗對同一位點2種檢測方法的結(jié)果進行差異性分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

將DNA 甲基化水平代入年齡推斷模型[11]中計算DNA 甲基化年齡，參照文獻[11]對樣本年齡分組，計算不同年齡段以及不同性別模型中預(yù)測年齡的誤差。使用GraphPad Prism v8.4.3 軟件對推測的DNA 甲基化年齡與真實年齡的誤差進行比對，包括與年齡的r、R2、平均絕對誤差（median absolute deviation，MAD）、均方根誤差（root mean square error，RMSE）等，使用秩和檢驗對預(yù)測年齡和真實年齡進行誤差計算，以±5 歲的誤差評估推斷預(yù)測年齡的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

6 個位點在3 次重復(fù)實驗中的變異系數(shù)在0.003 0（CpG4）～0.062 9（CpG2），提示焦磷酸測序技術(shù)的可重復(fù)性好。

對于NGS 測序數(shù)據(jù)，通過將NGS 測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對，其唯一比對reads 比例在72.4%～83.1%。此外，6 個位點在不同樣本中的reads 數(shù)范圍為3 850～194 170條，其平均測序深度為8 414×（CpG4）～114 549×（CpG6）。

2.2 年齡相關(guān)性分析

對于每一個CpG 位點，得到焦磷酸測序和NGS 在不同樣本中的DNA甲基化水平與樣本年齡的r值，并與文獻[11]中相關(guān)參數(shù)進行對比。根據(jù)表3可以看出，CpG位點DNA 甲基化水平與年齡的r在不同檢測平臺存在一定差別。同時，將焦磷酸測序與NGS 在不同位點上的結(jié)果進行配對t檢驗，得到CpG1 的P值為0.000 8，CpG2～4 的P值均小于0.000 1，CpG5 的P值為0.000 1，只有CpG6的P值為0.101 1。

表3 CpG位點DNA甲基化水平與年齡的皮爾遜相關(guān)系數(shù)Tab.3 Pearson correlation coefficient between DNA methylation levels of CpG sites and chronological ages

2.3 推斷年齡的準(zhǔn)確性

基于兩種平臺預(yù)測的DNA 甲基化年齡與真實年齡的r均高于0.90（圖1），其中焦磷酸測序技術(shù)的r為0.92，R2為0.85，MAD、RMSE 分別為4.81、6.26 歲；NGS技術(shù)的r為0.91，R2為0.84，MAD 和RMSE 分別為4.41、6.72 歲。焦磷酸測序和NGS 預(yù)測的年齡與個體真實年齡之間的配對秩和檢驗顯示，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.538 3 和0.809 3）。

圖1 樣本年齡與使用焦磷酸測序和NGS 檢測技術(shù)所得推斷年齡的散點圖Fig.1 The scatterplot of chronological ages and predicted ages detected by pyrosequencing and NGS

不同年齡段下的年齡推斷誤差結(jié)果如表4所示：幼兒和中青年人群（≤39歲）年齡推斷相對更準(zhǔn)確；>60 歲人群中年齡推斷誤差增加，其中基于焦磷酸測序推斷誤差±5 歲的個體比例不足50.00%，在NGS 技術(shù)及文獻[11]中分別為54.00%和67.50%。

表4 不同年齡階段年齡推斷誤差比較Tab.4 Age prediction errors in different age groups （n=12）

性別分組結(jié)果（表5）顯示，基于男性年齡推斷模型在NGS技術(shù)下年齡推斷的MAD為3.50歲，對應(yīng)焦磷酸測序技術(shù)下MAD為5.00歲，而基于SNaPshot技術(shù)的文獻[11]中的男性樣本組中MAD 為4.18 歲；基于女性年齡推斷模型在NGS技術(shù)下年齡推斷的MAD為5.31歲，對應(yīng)焦磷酸測序技術(shù)下MAD 為4.74 歲，而基于SNaPshot技術(shù)的文獻中女性樣本組中MAD為4.30歲。

表5 不同性別年齡推斷模型下預(yù)測年齡的比較Tab.5 Comparison of predicted ages based on gender specific age prediction model

3 討論

本研究探討了依據(jù)SNaPshot 構(gòu)建的針對中國漢族人群的年齡推斷模型[11]在焦磷酸測序和NGS 技術(shù)下用于中國華東漢族人群年齡預(yù)測的適用性。在PAN 等[11]的研究中，使用多重甲基化SNaPshot 技術(shù)針對中國漢族人群檢測了310 份年齡為2～86 歲的血液樣本，其模型包含6 個CpG 位點，其中與年齡相關(guān)性最高的是cg19283806（r為-0.870 4），相關(guān)性最低的是cg04208403（r為0.535 5）。使用支持向量回歸（support vector regression，SVR）和逐步回歸算法構(gòu)建DNA 甲基化年齡推斷模型后，在驗證組其年齡推斷MAD 分別為4.56 歲和4.71 歲[11]。在本研究中，不論用焦磷酸測序還是NGS 技術(shù)，6 個CpG 位點均與年齡之間具有相關(guān)性。此外，基于PAN 等[11]逐步回歸算法構(gòu)建的模型，使用焦磷酸測序和NGS 技術(shù)在中國華東漢族人群用于年齡推斷的MAD 分別為4.81 歲和4.41 歲。由此可以看出，通過重新設(shè)計引物實現(xiàn)了PAN 等[11]的研究中的DNA 甲基化年齡推斷模型在焦磷酸測序和NGS 技術(shù)中的有效轉(zhuǎn)化。

總體來看，基于PAN 等[11]的研究中的SNaPshot 技術(shù)以及本研究中的焦磷酸測序和NGS 技術(shù)估計的DNA 甲基化年齡與個體真實年齡的MAD 多小于5歲，在3 種技術(shù)下檢測到的CpG 位點與年齡的相關(guān)性以及預(yù)測年齡的誤差除了受不同年齡段和性別影響之外，還可能存在其他因素。首先，由于本研究與PAN等[11]的研究中用的樣本來源不一樣，樣本來源人群對AR-CpG 可能會存在一定的影響，如CpG1（chr17：44，390，358）在本研究中與年齡的相關(guān)性r為-0.705 7（焦磷酸測序）和-0.726 1（NGS），而在法國人群中只有0.464[18]；CpG6（cg19283806）在本研究中與年齡的相關(guān)性r為-0.848 4（焦磷酸測序）和-0.839 4（NGS），而在韓國人群的研究中為-0.906 1[19]，在法國人群中為-0.672[18]。因此，本研究觀察到的CpG 位點與年齡的相關(guān)性與PAN 等[11]研究中的不一致可能與樣本來源不一樣有關(guān)，這是由于DNA 甲基化水平會受環(huán)境、個體差異的影響[20-21]。其次，PAN 等[11]的研究證實了性別對DNA 甲基化年齡推斷的影響。性別因素也可能是影響三組數(shù)據(jù)的原因之一。至于基于不同性別開發(fā)的DNA 甲基化年齡推斷是否能更精準(zhǔn)地推斷年齡還值得進一步探討。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)CpG 位點的甲基化水平還可能受到檢測平臺的影響。為驗證這一點，本研究對比了焦磷酸測序和NGS 技術(shù)兩種測序技術(shù)的結(jié)果，在對同一位點的DNA 甲基化水平的測定結(jié)果分析后，在6 個CpG 位點中，除了CpG6（P=0.101 1）外，其余5 個DNA甲基化水平在兩種檢測技術(shù)中表現(xiàn)出的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（配對t檢驗），但從對單個位點的差異趨勢來看，并未得到NGS 技術(shù)或焦磷酸測序技術(shù)檢測的DNA 甲基化水平明顯更高或更低的結(jié)論。代入模型后，對預(yù)測年齡的配對秩和檢驗結(jié)果提示，兩種檢測方法均可用于甲基化年齡預(yù)測，但同時應(yīng)注意兩種技術(shù)檢測的甲基化水平存在一定差異。對于NGS 技術(shù)而言，盡管本研究中不同CpG 位點在樣本中的測序深度均在3 000×之上，不同位點在不同樣本中的測序深度并非完全一致，這可能與多樣本混樣不均有關(guān)。

值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)，>60 歲人群的甲基化水平與整體變化趨勢的離散更明顯，焦磷酸測序在該年齡組的MAD 值為6.67 歲，使用NGS 技術(shù)在該年齡組的MAD 為4.66 歲。同時按照原文獻中對預(yù)測年齡的評估方法，以5 歲的誤差對各年齡段的預(yù)測效果進行對比，盡管基于NGS 技術(shù)有67.00% >60 歲個體其預(yù)測年齡與真實年齡的差異在5 歲以內(nèi)，但高于其他組的誤差（2.80～3.74 歲），提示年齡推斷模型在高齡樣本中用于年齡推斷有一定局限性。

受本研究樣本量較小及樣本來源、年齡分布與原始研究不同的影響，雖存在一定的偶然因素，與原模型的對比未必準(zhǔn)確。從法醫(yī)學(xué)實踐的角度來看，在保證模型預(yù)測準(zhǔn)確性的前提下，焦磷酸測序操作和分析時間短，更適用于小樣本實驗。目前，對于AR-CpG的篩選仍多依靠高通量測序，本研究雖樣本量有限，但仍能為基于DNA 甲基化的年齡推斷模型的應(yīng)用提供一定依據(jù)。