孫仲旭　張漢超　陳龍　曾章華

摘要：為克服外源基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化中進(jìn)入細(xì)胞過程復(fù)雜，轉(zhuǎn)染率低等問題，通過水熱法合成了一種粒徑較小、分散均一的類水滑石納米材料基因載體（layered double hydroxide nanosheets，簡稱LDHs）。通過傅里葉變換紅外光譜儀、透射電子顯微鏡、馬爾文納米粒度電位儀等對該硝酸根插層的類水滑石納米材料進(jìn)行了表征，LDHs呈現(xiàn)較規(guī)則的六邊形層板結(jié)構(gòu)、粒徑為20～80 nm，zeta電位是（39.8±2.5） mV，并借助瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該材料可有效地和外源基因結(jié)合，當(dāng)質(zhì)粒與LDHs質(zhì)量比為1 ∶3時(shí)可被完全負(fù)載，并保護(hù)核酸分子免受脫氧核糖核酸酶DNaseⅠ的消化水解作用。通過形成納米粒子-核酸復(fù)合體的方式，借助葉面無孔注射，將含有綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA滲入到生長4周的野生型本氏煙草葉片中，4 d后可在激光共聚焦顯微鏡下清晰地觀察到目的信號。表明，類水滑石有望通過不借助外力的簡易方法將外源基因高效率地遞送入植物體從而實(shí)現(xiàn)完整的基因釋放及表達(dá)，展現(xiàn)出了此納米材料在植物納米基因載體方面的應(yīng)用方面具備很大的潛力，對優(yōu)化外源基因遞送進(jìn)入植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化方面具有一定的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：類水滑石；基因載體；基因遞送；植物基因工程；納米材料

中圖分類號：TB383；S184文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）20-0049-09

植物基因工程是21世紀(jì)有關(guān)植物遺傳轉(zhuǎn)化和新品種培育的重要核心技術(shù)，是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)和重要手段。在傳統(tǒng)的植物遺傳育種中，需要通過對多個(gè)植物世代進(jìn)行多次雜交和篩選，以達(dá)到獲得具有目的性狀的植株品種。而植物基因工程通過與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合，借助一定的手段將體外分離的目的基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞并表達(dá)，從而使目的植物獲得理想的性狀，例如抗病、抗蟲、抗逆等，有力地推動了轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物技術(shù)的發(fā)展［1］。然而相較于動物基因工程來說基因工程在植物上的研究相對較為滯后。主要的研究壁壘是植物細(xì)胞壁對于外界核酸分子的阻礙作用，為體外遺傳物質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)的遞送轉(zhuǎn)運(yùn)提供了一個(gè)額外的物理屏障。這也是基因工程工具在植物研究中實(shí)施和使用速度較慢的關(guān)鍵因素之一［2］。

目前常用的植物外源基因遞送方式主要通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法以及花粉管通道等，轉(zhuǎn)化后可獲得理想的轉(zhuǎn)基因植株。但是目前常用的這幾種方法都存在各自的局限性，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是模仿或者利用天然的載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)形成，但是其受體物種有限，在單子葉植物中的轉(zhuǎn)化效果不理想，并且由于該基因轉(zhuǎn)化是通過T-DNA輸出、靶向和插入植物和基因組進(jìn)行的［3］，其所攜帶的外源分子僅限于DNA?；驑尫ㄊ且环N通用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的物理方法，雖然可以克服農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中所提到的宿主范圍和攜帶分子的限制，但該法轉(zhuǎn)化所需的外源分子量大并且對植物組織會造成比較嚴(yán)重的損傷［4］。借助植物花粉管來進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法則會受到作物本身花期的限制。目前為止，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)仍然缺乏一種成熟的手段和媒介來將不同的體外分子在不借助外力的情況下靶向高效地輸送到植物物種中，并盡可能地降低對于目標(biāo)植物組織的損傷程度。

近年來，由于納米材料多種獨(dú)特的理化性質(zhì)，納米技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力［5］。例如，納米顆粒具有體積極小，良好的生物相容性以及可被多種官能團(tuán)修飾等特性［6］，可以作為遺傳轉(zhuǎn)化中的分子轉(zhuǎn)運(yùn)載體，攜帶外界遺傳物質(zhì)繞過生物體的多道屏障以解決遺傳物質(zhì)的遞送問題，并提高植物基因工程的應(yīng)用水平。目前納米顆粒已被驗(yàn)證可于中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）和人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）等的亞細(xì)胞水平上進(jìn)行定位和一系列的操作［7］。并且通過對材料進(jìn)行一系列的修飾和功能化，可將不限于DNA、microRNA、siRNA的一系列生物分子以及各種蛋白有效運(yùn)輸?shù)缴锛?xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用［8-10］。而相較于動物細(xì)胞中較為廣泛深入地研究，納米基因載體在植物中的研究由于納米顆粒的大小、表面所帶電荷以及表面屬性的不同及宿主本身所存在的物理屏障，使得植物體中的生物分子遞送相較于動物細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系更具有挑戰(zhàn)性［11-13］。

目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道通過納米顆粒于外界基因結(jié)合通過直接轉(zhuǎn)化或者借助聚乙二醇（PEG）、磁場電場驅(qū)動、超聲波等外力的條件下將外源基因輸送到植物體中［14-15］，在煙草種子及原生質(zhì)體、擬南芥根、玉米以及水稻、小麥等組織或細(xì)胞中均成功實(shí)現(xiàn)了外源基因的表達(dá)［16-20］。在多種納米材料中，類水滑石納米顆粒因具有良好的生物相容性，并且制備相對簡單，同時(shí)基因的裝載量大，轉(zhuǎn)化效率高，相對穩(wěn)定，不易聚沉等特點(diǎn)為植物的遺傳轉(zhuǎn)化提供了一個(gè)新的思路和研究方向。2001年，Khan等通過借助類水滑石材料的理化特性，對多種藥物中的生物活性分子進(jìn)行吸附證明藥物分子可以在體外釋放這一性質(zhì)，為類水滑石材料作為生物分子的遞送載體奠定了基礎(chǔ)［21］。此外，Li等通過試驗(yàn)證明類水滑石可以很好地對所負(fù)載的核酸分子起到保護(hù)作用，避開體內(nèi)多種水解核酸酶的消化酶解作用，進(jìn)而為外源基因高效遞送到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用提供了可能［22］。而Mitter等借助類水滑石材料將雙鏈RNA分子運(yùn)送到植物體內(nèi)，對侵染作物的辣椒輕斑駁病毒（PMMoV）、黃瓜花葉病毒（CMV）同源基因沉默使得抗蟲效果得到顯著延長［23］。不少研究也表明，外源生物分子在無機(jī)械無外力輔助下也可通過納米材料跨越細(xì)胞壁以及質(zhì)膜等壁壘來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)化。例如，Bao等利用類水滑石納米片作為植物跨膜運(yùn)輸載體，成功將生物分子轉(zhuǎn)入完整植物細(xì)胞［24］。

本研究通過高速剪切以及水浴攪拌加熱的方式，合成了粒徑為50 nm左右的層狀氫氧化物納米片，并研究其作為植物基因運(yùn)載體的性能。通過編碼綠色熒光蛋白的pAN580質(zhì)粒DNA來驗(yàn)證其攜帶外源基因進(jìn)入成熟植株體內(nèi)的可能性，以期為納米基因載體在植物轉(zhuǎn)基因中的研究與應(yīng)用提供新的材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用的編碼綠色熒光蛋白（GFP）基因的質(zhì)粒pAN580以及擬南芥、日本晴水稻 （Oryza sativa）、本氏煙草 （Nicotiana benthamiana）種子來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所谷曉峰老師課題組，無內(nèi)毒素質(zhì)粒質(zhì)粒提取純化試劑盒購自天根生化科技有限公司；Mg（NO3）2·6H2O、Al（NO3）3·9H2O、NaOH、CaCl2、LB培養(yǎng)基和DNA ladder購自于賽默飛世爾公司；FDA染料購自上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶和離析酶購自日本Yakult公司，脫氧核糖核酸酶DNaseⅠ購自南京諾維贊生物科技股份有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，德國）；瓊脂糖凝膠電泳水平電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD 公司，美國）；搖床（Eppendorf Innova 42型，德國）；冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡（JSM 6700F型，日本）；透射電子顯微鏡（Hitachi公司，日本）；傅里葉紅外光譜儀（Bruker Optics公司，Vertex70型，美國）；X-射線衍射儀（Bruker公司，D8 Advance型，美國）；馬爾文激光粒度儀（Malvern公司，Zetasizer Nano ZS型，英國）；高速剪切機(jī)（HEVC公司，A25型，德國）；超微量分光光度計(jì)（Thermo公司，Nanodrop 2000型，美國）；激光共聚焦顯微鏡（Zeiss公司，LSM980型，美國）。

1.3 類水滑石納米粒子的制備

取1.6 g的NaOH溶于40 mL的去離子水中，配制溶液甲；稱取0.75 g的Al（NO3）3·9H2O與1.538 g的Mg（NO3）2·6H2O溶于10 mL去離子水中，使用渦旋混勻器混勻?yàn)槿芤阂摇Ｔ谑覝叵率褂酶咚偌羟袡C(jī)，開始剪切瞬間將配制的溶液乙加入溶液甲中，于B檔剪切 100 s，之后切換A檔繼續(xù)剪切20 s，得到納米材料原液。之后在室溫下將上述得到的材料原液在 8 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄上清液，用去離子水補(bǔ)充定容至初始體積后，將材料顆粒超聲分散均勻后以同樣條件離心，重復(fù)3次。然后將洗完補(bǔ)充至原體積的溶液置于80 ℃水浴鍋中加熱攪拌6 h，得到類水滑石納米粒子（layered double hydroxide nanosheets，簡稱LDHs），常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 材料表征

取2 μL的制備好的LDHs材料溶液溶解于 4 mL 的去離子水中，均勻分散后，取4 μL分別滴加在晾干的硅片和銅網(wǎng)上，室溫下自然干燥后利用掃描電子顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察該納米粒子的形態(tài)特征。

首先將制備好的LDHs溶液置于 -80 ℃ 的超低溫冰箱冷凍24 h，利用冷凍干燥機(jī)將其制作為干粉備用，稱取2 mg的LDHs材料與30 mg的KBr粉末研磨混勻，均勻分散在磨具中壓片，在室溫下利用傅里葉變換紅外光譜儀對材料進(jìn)行紅外光譜測試，其中掃描速度為32次/min，光譜范圍是4 000～400 cm-1。

在電壓及電流分別為40 kV與40 mA的條件下，X-射線衍射儀在5°～50°范圍內(nèi)掃描，對類水滑石納米顆粒的物相組成與晶型結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

將制備的LDHs材料使用去離子水稀釋50倍，然后取稀釋后的樣品1.3 mL加入比色皿中使用馬爾文激光粒度儀分析測試材料的粒度分布及zeta電位。

1.5 質(zhì)粒的擴(kuò)增與純化

將含有 pAN580 質(zhì)粒的大腸桿菌 DH5α 于 LB 液體培養(yǎng)基（每升含10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g NaCl）中按照 1 ∶100 的體積比活化，在 37 ℃ 恒溫?fù)u床中180 r/min培養(yǎng)過夜。按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取，通過瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)鑒定質(zhì)粒的大小、純度和濃度，將制備好的符合純度的質(zhì)粒DNA保存在 -20 ℃ 中備用。

1.6 LDHs與質(zhì)粒DNA的結(jié)合及對DNA 的酶切保護(hù)

為驗(yàn)證納米材料對DNA的負(fù)載和保護(hù)能力，本試驗(yàn)選用了5個(gè)梯度質(zhì)量比的組合。先配制1 μg/μL的LDHs單分散納米粒子溶液，向上述納米粒子懸浮液中加入質(zhì)粒溶液。按照一定質(zhì)量比例（1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5）與1 μg/μL的質(zhì)粒DNA結(jié)合，室溫放置30 min，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測納米粒子與DNA的結(jié)合情況。另外對LDHs-DNA復(fù)合物用DNaseⅠ于37 ℃消化10 min后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證納米粒子對DNA的保護(hù)能力。

1.7 煙草BY-2懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)

分別取10、25、50、100、200、500 μg的經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾除菌后的LDHs納米粒子加入配制成功的BY-2細(xì)胞培養(yǎng)基中，其中該細(xì)胞培養(yǎng)基包含4.3 mg/mL的 （2，3-二油?；?丙基）-三甲胺、1 μg/mL的維生素B1、0.2 μg/mL的2，4-D、100 μg/mL 的Myo-inositol、0.255 g/L的KH2PO4以及3%質(zhì)量比的蔗糖，均勻分散后于高壓滅菌鍋中121 ℃，滅菌20 min。然后取長勢均一的BY-2細(xì)胞在超凈工作臺中等量接種于已滅菌的各組培養(yǎng)基中，同樣的環(huán)境下在26 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床避光培養(yǎng)3～4 d。

1.8 水稻葉鞘原生質(zhì)體的制備

在生長2周的日本晴水稻幼苗葉鞘中提取原生質(zhì)體。即將水稻幼苗葉鞘切成 1 mm 的小段，放入酶解液中（每10 mL酶解液含 1.093 g甘露醇、0.1 g纖維素酶、0.08 g的半纖維素酶、0.1 g 的果膠酶、0.08 g 的離析酶和0.1 mol的MES溶液0.2 mol CaCl2溶液，0.4 mol KCl溶液）。然后置于28 ℃、80 r/min 的恒溫?fù)u床中避光酶解4 h。其后將釋放出的原生質(zhì)體用150目的篩子過濾到50 mL的離心管中，130 g離心5 min，并使用W5溶液洗滌2次，最后將純化的原生質(zhì)體重新懸浮于W5溶液中待用。為保持細(xì)胞活力須現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.9 LDHs對植物的毒性試驗(yàn)

1.9.1 對水稻葉鞘原生質(zhì)體的毒性試驗(yàn) 取過濾除菌后的LDHs納米懸浮液經(jīng)W5溶液離心洗滌3次備用，然后在超凈工作臺中將新鮮制備的水稻葉鞘原生質(zhì)體與不同質(zhì)量濃度梯度（0、25、50、100、300、500 μg/mL）的LDHs納米顆?；旌希笾糜谠嚬苤性?6 ℃恒溫?fù)u床上避光振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為40 r/min每組均含有2 mL W5 溶液，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)觀察3個(gè)視野。

1.9.2 對煙草BY-2細(xì)胞的毒性試驗(yàn)

取長勢均一的煙草BY-2細(xì)胞在超凈工作臺中加入到含有不同質(zhì)量濃度（0、25、50、100、300、500 μg/mL）LDHs 納米顆粒的培養(yǎng)基中，并記錄初始質(zhì)量。所有組均置于26 ℃恒溫?fù)u床上130 r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行避光培養(yǎng)，并記錄細(xì)胞每日變化質(zhì)量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.9.3 對擬南芥植株的毒性試驗(yàn)

用濃度為1.5%的NaClO溶液對擬南芥種子進(jìn)行殺菌消毒 10 min，使用滅菌后的雙蒸水（ddH2O）洗滌次后接種于含有不同質(zhì)量濃度（0、25、50、100、300、500 μg/mL）LDHs納米顆粒的固體培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種10粒飽滿的擬南芥種子。其中基礎(chǔ)的擬南芥植株培養(yǎng)基中包含2.2 mg/mL的 （2，3-二油?；?丙基）-三甲胺，3%質(zhì)量比的蔗糖和10%的植物凝膠（植物組培級）。所有組均置于22 ℃，光照16 h，黑暗8 h的人工氣候箱中培養(yǎng)，記錄種子萌發(fā)率，每個(gè)處理重復(fù)次。

1.10 LDHs-DNA的完整植株轉(zhuǎn)化

經(jīng)筆者前期預(yù)試驗(yàn)得知，LDHs納米片與pAN580質(zhì)粒的最佳負(fù)載質(zhì)量比為1 ∶3，按此比例取1 μg的質(zhì)粒DNA與質(zhì)量比為1 ∶3的LDHs納米顆?；旌希ㄟ^葉面無孔注射方式將此材料核酸復(fù)合物遞送到4周齡的本氏煙草葉片中，于24 ℃、光照 16 h、黑暗8 h的人工氣候箱中培養(yǎng)，共培養(yǎng)4 d后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察處理葉片中綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)觀察3個(gè)視野。

2 結(jié)果與分析

2.1 LDHs的表征

掃描電鏡（SEM）圖像顯示，經(jīng)過高速剪切法所合成的材料是較為規(guī)則的六邊形層板結(jié)構(gòu)，粒徑約為20～80 nm，且具與良好的分散性，符合類水滑石材料的基本特征；同時(shí)，透射電鏡（TEM）圖像中材料的層板結(jié)構(gòu)明顯，進(jìn)一步的驗(yàn)證了上述結(jié)果。且相較于掃描電鏡圖像上納米片聚集無法分辨其單層結(jié)構(gòu)來看，大部分的LDHs材料呈現(xiàn)出較為清晰透徹的圖像，這是因?yàn)楣P者所在實(shí)驗(yàn)室制備的LDHs材料較薄，具有典型的二級結(jié)構(gòu)。如圖1-D、圖1-E所示，該材料的水合粒徑為（63.6±1.8） nm，zeta電位為（39.8±2.5） mV。同時(shí)其粒徑分布強(qiáng)度（PDI）為0.173（<0.300），表明制備的類水滑石材料分散性良好。

2.2 LDHs的紅外光譜分析及XRD衍射圖譜分析

對LDHs采用紅外光譜分析及X射線衍射分析確認(rèn)類水滑石納米顆粒是否制備成功。從圖2-A可以看出，在3 498 cm-1處出現(xiàn)了氫氧化物層的特征寬帶，峰值在1 384 cm-1（水分子的彎曲振動）以及峰值在655 cm-1處的M—O—H拉伸振動均符合類水滑石的紅外光譜。從圖2-B可以看出，筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備的類水滑石具有明顯的片層結(jié)構(gòu)。在2θ=11.256°、2θ=22.65°這2處出現(xiàn)了較強(qiáng)的衍射峰為α（003）、α（006）衍射峰，其中第1個(gè)峰的d值為 0.78 nm，接近報(bào)道的LDHs（0.81 nm），第2個(gè)峰的d值為0.39 nm［25］。根據(jù)謝樂公式，（003）衍射峰的半最大寬度（0.38°）對應(yīng)c軸圖譜中的5.2 nm，所以每個(gè)LDHs納米粒子中具有6～7層輕氧化物。XRD的峰型規(guī)則，基本無雜峰出現(xiàn)，證明筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備的類水滑石納米材料具備規(guī)則的菱形（3R）模型。

2.3 LDHs對DNA的負(fù)載和保護(hù)能力分析

為了確定LDHs納米片對pAN580質(zhì)粒DNA（1 μg/μL）的負(fù)載能力，采用了幾個(gè)梯度質(zhì)量比的組合進(jìn)行制備LDHs-DNA復(fù)合物，即DNA ∶LDHs質(zhì)量比為1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5，同時(shí)設(shè)置2組對照分別是單質(zhì)粒DNA組和單納米顆粒組，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。如圖 3-A所示，由于LDHs-DNA復(fù)合物的粒徑增大，因此不能通過凝膠孔隙而滯留在上樣孔中，在此處清晰可見有明顯熒光條帶。而隨著LDHs濃度的提高，所結(jié)合的質(zhì)粒DNA增加，游離的DNA逐漸減少，上樣孔中的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)直至全部質(zhì)粒DNA被材料負(fù)載。結(jié)果表明LDHs可以有效負(fù)載DNA。當(dāng)質(zhì)粒DNA與LDHs的質(zhì)量比為1 ∶3及以上時(shí)，LDHs-DNA復(fù)合物全部滯留在上樣孔中，泳道內(nèi)對應(yīng)質(zhì)粒大小的位置未見任何條帶，證明此時(shí)DNA與 LDHs 的結(jié)合已經(jīng)達(dá)到飽和，為pAN580質(zhì)粒與LDHs納米顆粒的最佳結(jié)合負(fù)載比例。

將LDHs與pAN580質(zhì)粒DNA（1 μg/μL）按照質(zhì)量比1 ∶3混合制備LDHs-DNA復(fù)合物，用 DnaseⅠ在37 ℃酶解消化10 min，同時(shí)以添加 DnaseⅠ的等量質(zhì)粒DNA組作為對照，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)。圖3-B表明未添加LDHs的質(zhì)粒DNA組被DnaseⅠ酶完全消化，而與LDHs-結(jié)合的質(zhì)粒DNA組中條帶仍然保留在凝膠上樣孔中，而且相比未加核酸酶的組條帶亮度無明顯差異，說明LDHs納米基因載體能夠很好地保護(hù) DNA 免受 DnaseⅠ的降解。

2.4 LDHs-DNA納米基因載體復(fù)合物的表征

粒度分布和Zeta電位分析是衡量納米基因載體性能的重要參數(shù)。zeta電位是反應(yīng)納米顆粒在分散介質(zhì)中的聚集和穩(wěn)定程度的重要表征之一，即其zeta電位的絕對值越大，納米顆粒之間的斥力就越大，這個(gè)納米顆粒的分散體系就越穩(wěn)定；反之，則體系越容易聚集甚至析出［26］。同時(shí)，表面帶有正電荷的納米材料可以與攜帶負(fù)電荷的核酸分子上的磷酸骨架通過靜電吸附的作用結(jié)合，形成納米載體-基因復(fù)合物。載體-基因復(fù)合物在細(xì)胞膜表面的富集，可提高基因運(yùn)送到胞內(nèi)表達(dá)的概率，這對于提高基因的表達(dá)量具有重要的意義［27］。如圖4所示，LDHs-DNA復(fù)合物的粒徑（后簡稱質(zhì)粒）大于單材料（后簡稱材料）的粒徑；且質(zhì)粒的zeta電位為（-33.1±0.5） mV，材料的zeta電位為（39.8±2.5） mV，在材料結(jié)合了帶負(fù)電的質(zhì)粒DNA之后，LDHs-DNA復(fù)合物的zeta電位隨著材料結(jié)合比例的上升逐漸增加，表明LDHs能夠有效地負(fù)載質(zhì)粒DNA，形成穩(wěn)定的載體-基因復(fù)合物。

2.5 LDHs對植物的毒性試驗(yàn)

本試驗(yàn)應(yīng)用臺盼藍(lán)染色法及 FDA 染色法檢測不同濃度LDHs對煙草BY-2細(xì)胞及水稻葉鞘原生質(zhì)體的細(xì)胞毒性，以確定其應(yīng)用于基因遞送的可行性及使用濃度。圖5-A可以看出，其正常生長的BY-2細(xì)胞增質(zhì)量在前10 d內(nèi)呈指數(shù)型增長，在 10 d 時(shí)到達(dá)峰值之后逐漸下降，這符合煙草BY-2細(xì)胞的一般生長規(guī)律。從圖5-B可知，隨著培養(yǎng)基中材料濃度的增加細(xì)胞增質(zhì)量逐漸減少，從 25 μg /mL 增加至100 μg /mL過程中細(xì)胞增質(zhì)量減少并無明顯差異，然而當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí)，細(xì)胞增質(zhì)量出現(xiàn)明顯降低并且在500 μg/mL時(shí)達(dá)到試驗(yàn)組最低值。因此在煙草植物細(xì)胞中，LDHs的使用濃度應(yīng)該不高于100 μg/mL。

如圖6-A所示，與未處理的對照擬南芥種子相比，在1～2 d時(shí)，所有組別的萌發(fā)率均維持在60%～80%，無明顯差異，證明不同濃度的LDHs對擬南芥種子的萌發(fā)均無顯著毒性 即使是濃度高達(dá)100 μg/mL。如圖6-B所示，通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)估算水稻原生質(zhì)體的活力，對照組的原生質(zhì)體細(xì)胞保持較高的活力水平，隨著培養(yǎng)基中材料濃度的增加原生質(zhì)體的個(gè)數(shù)逐漸減少，從25 μg/mL增加至100 μg/mL過程中細(xì)胞個(gè)數(shù)減少量并無顯著差異，然而當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí)，細(xì)胞個(gè)數(shù)出現(xiàn)明顯降低（圖6-B）。因此在水稻葉鞘原生質(zhì)體中，LDHs的使用濃度應(yīng)該不高于 100 μg/mL。綜上可知，LDHs在植物中的使用濃度應(yīng)該保持在不高于100 μg/mL的水平。

2.7 LDHs負(fù)載熒光染料進(jìn)入植物細(xì)胞

植物細(xì)胞壁是由纖維素、果膠與半纖維素構(gòu)成，具有一定的排阻效應(yīng)。細(xì)胞壁是防止外界分子進(jìn)入植物細(xì)胞的天然屏障之一。為了探究LDHs的生物分子遞送能力，本試驗(yàn)選取常用的活體染料異硫氰酸熒光素（FITC）來測試LDHs在擬南芥植株上的分子遞送能力。圖7-A可知，單熒光染料組中，大量的熒光染料分子富集到細(xì)胞外，在植物細(xì)胞外有明顯的綠色熒光和植物體葉綠素自發(fā)的紅色熒光未有重疊，證明單熒光染料很難進(jìn)入到植物細(xì)胞中。由圖 7-B、圖7-C可以觀察到，擬南芥植株外有明顯的綠色熒光（與葉綠體自發(fā)紅光合并后呈現(xiàn)出黃色光），進(jìn)一步驗(yàn)證了LDHs納米材料可以快速有效地運(yùn)載外部熒光染料分子進(jìn)入植物細(xì)胞。

2.8 LDHs/DNA煙草植株的轉(zhuǎn)化

選取質(zhì)量比為3 ∶1的LDHs/DNA的納米材料-基因復(fù)合物浸潤4周齡的本氏煙草植株葉片，培養(yǎng) 96 h 后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。試驗(yàn)組中清晰可見有綠色熒光蛋白信號，而野生型對照組中的煙草葉片中無綠色熒光蛋白的表達(dá)。結(jié)果說明，LDHs能夠有效保護(hù)并負(fù)載質(zhì)粒DNA通過植物細(xì)胞壁進(jìn)入完整煙草植株葉片細(xì)胞內(nèi)。用Image J圖像處理軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度的定量測算，結(jié)果如圖8所示，LDHs納米載體負(fù)載pAN580質(zhì)粒處理的試驗(yàn)組的GFP平均熒光強(qiáng)度約為野生型對照組的56倍。證明LDHs可以有效負(fù)載外源質(zhì)粒DNA并將其遞送入完整的成熟植物體中表達(dá)，為植物的遺傳轉(zhuǎn)化提供了新的思路。

3 討論與結(jié)論

納米材料通過其獨(dú)特的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)，在現(xiàn)階段的研究中納米基因載體成為最熱門的非病毒基因遞送載體之一。在眾多納米材料中，類水滑石材料由于具有良好的生物相容性、制備簡單、基因裝載量大、轉(zhuǎn)化效率高等多種優(yōu)勢，尤其在生物分子的負(fù)載與保護(hù)方面表現(xiàn)出的突出優(yōu)勢而成為植物納米基因載體的優(yōu)勢材料之一。Desigaux等通過自組裝和合成及離子交換合成并得到了穩(wěn)定的類水滑石-DNA的復(fù)合物，通過體外轉(zhuǎn)染試驗(yàn)證明該復(fù)合物可以進(jìn)入HeLa細(xì)胞中并實(shí)現(xiàn)了表達(dá)［28］。本試驗(yàn)采用高速剪切的方法合成了硝酸根插層的LDHs作為植物基因遞送載體，其表面攜帶有高密度的正電荷，因此可以通過靜電接枝的方法與表面帶有負(fù)電荷的外源質(zhì)粒DNA進(jìn)行有效裝載和吸附。

而合適的基因運(yùn)載體不僅要具有大的比表面積、有效負(fù)載外源基因，更重要的是要在細(xì)胞內(nèi)保護(hù)所攜帶的基因免受多種酶的水解，才能提高基因的表達(dá)效率［29］。植物細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境復(fù)雜，含有多種水解酶，當(dāng)基因運(yùn)載體負(fù)載外源基因進(jìn)入植物細(xì)胞后，如果載體材料不能有效地保護(hù)核酸分子，按照細(xì)胞的運(yùn)輸機(jī)質(zhì)，那么外源的核酸分子將會大部分會被細(xì)胞內(nèi)的溶酶體的水解作用等機(jī)制水解消化，從而大大降低基因的表達(dá)效率。因此納米基因載體系統(tǒng)對于基因的保護(hù)作用是外源基因成功表達(dá)的必要條件之一。由本試驗(yàn)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可知，LDHs可以有效負(fù)載并保護(hù)質(zhì)粒DNA免受外界核酸酶等物質(zhì)的水解消化作用，可以推測類水滑石材料表面具有大量的正電荷，在與核酸分子磷酸骨架上的負(fù)電荷通過靜電接枝而緊密結(jié)合的同時(shí)，導(dǎo)致DNA的構(gòu)象發(fā)生改變，將外界的核酸酶等物質(zhì)與核酸分子隔絕開來，可以保護(hù)其在植物細(xì)胞內(nèi)免受各種水解消化作用，有效提高基因的表達(dá)效率。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，合成的LDHs材料可以直接轉(zhuǎn)化外界核酸分子進(jìn)入完整的植物細(xì)胞中，并檢測到了目標(biāo)基因綠色熒光蛋白的表達(dá)。這說明，LDHs可以負(fù)載外源基因跨過植物細(xì)胞壁的屏障運(yùn)輸進(jìn)入完整的細(xì)胞中表達(dá)。證明筆者所在實(shí)驗(yàn)室合成的類水滑石材料是一種優(yōu)越的植物納米基因載體，在轉(zhuǎn)基因植物的研究上展現(xiàn)出了一定的潛力，為植物穩(wěn)定遺傳與性狀改良提供了新的思路。

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收稿日期：2022-12-08

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號：2017YFD0200900）。

作者簡介：孫仲旭（1997—），女，河北衡水人，碩士研究生，主要從事納米生物學(xué)研究。E-mail：sunfox9@163.com。

通信作者：曾章華，博士，研究員，主要從事納米生物學(xué)研究。E-mail：zengzhanghua@caas.cn。