趙秀美，張華，賈惠，孫智遠(yuǎn)，徐孝宙，余智清，姜逸

(1. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400；2. 江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125)

傳染性支氣管炎(infectious bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，該病的暴發(fā)與傳播影響全球養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[1]。IBV主要感染雞呼吸道、腎臟、胃腸道以及生殖系統(tǒng)等，引起感染雞的發(fā)病與組織損傷[2]。各種年齡段的雞都可發(fā)病，以雛雞最為嚴(yán)重。病毒可以通過與感染雞的直接接觸傳播，也可以通過氣溶膠和污染的飲水、飼料以及糞便傳播[3]。IBV可在雞體內(nèi)和腸道中存活數(shù)周甚至數(shù)月，并通過呼吸道和糞便排出[4]。IBV的禽類宿主范圍廣泛，家雞和野雞是主要宿主；此外，健康的野生鳥類可能是家雞和野雞之間的傳播媒介[5]。由于IBV缺乏病毒聚合酶校對機(jī)制，基因組中可持續(xù)發(fā)生基因突變和重組，導(dǎo)致不斷出現(xiàn)新的變異株。此外，不同遺傳譜系的IBV之間發(fā)生基因重組以及基因的易位和缺失，導(dǎo)致病毒血清型和基因型眾多[6]。不同毒株之間交叉保護(hù)作用較弱，傳統(tǒng)商品化疫苗對新型變異株不能產(chǎn)生有效保護(hù)，增加了疫病的防控難度[7]。

反向遺傳操作技術(shù)通過對病毒全長基因組進(jìn)行克隆，拯救獲得活病毒，是研究RNA病毒分子生物學(xué)的有效方法。通過IBV反向遺傳技術(shù)對病毒基因組進(jìn)行突變、缺失、插入等，可以研究病毒蛋白功能或單個(gè)基因在發(fā)病機(jī)制中的作用。針對IBV流行株，傳統(tǒng)弱毒疫苗制備過程耗時(shí)費(fèi)力，而且疫苗穩(wěn)定性低，存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。借助反向遺傳技術(shù)可以對毒力相關(guān)基因進(jìn)行突變或刪除，構(gòu)建減毒疫苗株，克服疫苗研制的局限性[8]。此外，該技術(shù)也可用于研究IBV不同血清型和致病型毒株的感染與發(fā)病機(jī)理。IBV基因組較大，而且難以在傳代細(xì)胞系上增殖，導(dǎo)致IBV反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建較為困難，分子水平的研究工作受到限制。近年來，國內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)突破技術(shù)瓶頸，建立了多個(gè)IBV反向遺傳系統(tǒng)，為病毒分子水平研究提供了平臺，推動了IBV致病機(jī)制研究和新型基因工程疫苗的研發(fā)。

1 IBV基因組結(jié)構(gòu)和功能概述

IBV屬于冠狀病毒科γ冠狀病毒屬，病毒粒子直徑120 nm，冠狀突長20 nm。IBV的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長約27.6 kb[9]?；蚪M結(jié)構(gòu)為5′UTR-1a/1ab-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-3′UTR，其兩端包含5′帽子結(jié)構(gòu)和3′多聚腺苷酸尾巴?；蚪M結(jié)構(gòu)5′端2/3的區(qū)域編碼多聚蛋白pp1a和pp1ab，多聚蛋白通過自身蛋白酶水解裂解成15個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[10]。基因組靠近3′端的1/3區(qū)域編碼結(jié)構(gòu)蛋白和種屬特異性O(shè)RF。ORF2編碼S蛋白，該蛋白是目前研究最多的結(jié)構(gòu)蛋白，作為一種跨膜蛋白，S蛋白決定了病毒典型的冠狀結(jié)構(gòu)[11]。在病毒感染宿主過程中，S蛋白裂解為S1和S2兩個(gè)亞基，位于S1的受體結(jié)合區(qū)是決定病毒宿主和組織嗜性的主要區(qū)域[12]。病毒相關(guān)抗原表位主要位于S1蛋白上，S基因可用于IBV變異株的基因型分類，但由于缺乏共同的分類和命名標(biāo)準(zhǔn)，IBV流行病學(xué)的研究較為復(fù)雜。S2亞基較為保守，包含跨膜結(jié)構(gòu)域，將S蛋白錨定在包膜上[13]，是病毒融合的基礎(chǔ)[14]。S1和S2亞基與宿主之間的相互作用決定了病毒附著的親和性與特異性，從而決定了病毒組織嗜性和宿主范圍[15]。ORF3位于ORF2的下游，是一個(gè)多順反子基因，編碼3a、3b和3c蛋白。早期研究表明，3a、3b 蛋白為輔助蛋白，與病毒的復(fù)制無關(guān)[16]。3c蛋白也稱包膜蛋白或E蛋白，是病毒粒子包膜的重要組成部分[9]。M蛋白是由ORF4編碼的，是病毒粒子中含量最多的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒粒子中以二聚體的形式存在，可能采用兩種不同的構(gòu)象，促使膜面彎曲并與核衣殼結(jié)合[17]。ORF5編碼輔助蛋白5a、5b，5a蛋白與病毒在Vero細(xì)胞中的復(fù)制無關(guān)[18]。研究表明，輔助蛋白3a、3b、5a、5b缺失導(dǎo)致病毒在1日齡雛雞體內(nèi)毒力減弱[19]。ORF6編碼的N蛋白是核衣殼中唯一存在的蛋白，與病毒復(fù)制相關(guān)，位于核糖核蛋白核心。M蛋白與核衣殼結(jié)合，促進(jìn)了病毒粒子的組裝[20]。

2 IBV反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建策略

近年來，已成功用于操縱冠狀病毒基因組的反向遺傳學(xué)技術(shù)包括細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)系統(tǒng)、體外連接系統(tǒng)、痘病毒載體系統(tǒng)、靶向RNA重組系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化相關(guān)重組克隆等。盡管各個(gè)系統(tǒng)均存在優(yōu)點(diǎn)和不足，但通過反向遺傳操作技術(shù)對IBV基因進(jìn)行有目的地修飾和改造推動了IBV研究的發(fā)展。

2.1 基于BAC系統(tǒng)的感染性cDNA克隆

基于BAC的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)是目前冠狀病毒研究中最有價(jià)值的系統(tǒng)。首個(gè)冠狀病毒的全長感染性克隆是基于BAC系統(tǒng)進(jìn)行病毒基因組構(gòu)建的[21]。BAC系統(tǒng)可容納較大的外源基因或者DNA片段[22]，外源序列穩(wěn)定性高；在BAC質(zhì)粒中組裝病毒基因組全長cDNA，基因修飾和篩選方法較為成熟。BAC克隆基因組較大，每個(gè)細(xì)胞中僅有1～2個(gè)拷貝數(shù)的質(zhì)粒，低拷貝數(shù)以及隔離的環(huán)境，限制了細(xì)胞內(nèi)BAC分子間的重組[23]。在BAC系統(tǒng)中進(jìn)行基因操作相對容易，cDNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞并表達(dá)的效率高[24]。然而，在誘變過程中，病毒基因?qū)?xì)菌有一定的毒性，為防止病毒在細(xì)菌增殖過程中產(chǎn)生突變，需要每次對質(zhì)粒中的全基因組序列進(jìn)行測序鑒定。

針對H120疫苗株，呂晨翡等[25]將其基因組分為4個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增，用同源重組方法分別將其構(gòu)建到 BAC載體中獲得4個(gè)片段亞克隆載體，進(jìn)而完成全長 cDNA 克隆載體的構(gòu)建。在此基礎(chǔ)上，該課題組進(jìn)一步構(gòu)建了嵌合 IBV 野毒S1 基因的重組疫苗株，并對其進(jìn)行了致病性分析。研究發(fā)現(xiàn)以H120株的4個(gè)亞克隆片段為基礎(chǔ)，通過同源重組，獲得了插入IBV全長基因組cDNA的pBAC重組載體[26]。在此基礎(chǔ)上，將H120株的S1基因替換為強(qiáng)毒株的S1基因，將重組病毒轉(zhuǎn)染至BHK細(xì)胞，并在雞胚中傳代，拯救重組病毒。針對Beaudette株，Xing等[27]以Beaudette-FUB株的cDNA為模板，通過PCR將基因組分為6個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增，分別克隆到pUC18質(zhì)粒中。隨后，將6個(gè)片段依次克隆到修飾的BAC載體中，構(gòu)建全長基因組cDNA。Inayoshi等[28]將弱毒株 C-78E128基因組分為8個(gè)連續(xù)片段進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建全長cDNA并克隆至BAC載體中。將得到的BAC克隆轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒拯救，通過嵌合表達(dá)外源S基因，證實(shí)了S基因與血清特異性病毒中和抗體相關(guān)。

2.2 基于體外連接的感染性cDNA克隆

體外連接系統(tǒng)是使用限制性核酸內(nèi)切酶將識別位點(diǎn)處的堿基進(jìn)行分離，分段擴(kuò)增cDNA片段并在體外順序連接，進(jìn)行病毒全長cDNA的組裝。全長cDNA包括5′端T7 RNA聚合酶和3′端poly(A)尾巴，體外轉(zhuǎn)錄形成具有帽子結(jié)構(gòu)的mRNA后，轉(zhuǎn)染到易感細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行病毒拯救。體外連接轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)主要依賴T7 RNA聚合酶，可以降低病毒cDNA片段在細(xì)菌中的不穩(wěn)定性和毒性[29]。然而，通過該方法獲得病毒需要對所有亞克隆片段進(jìn)行酶切、連接以及純化全長cDNA，操作過程繁瑣，對于DNA的體外合成技術(shù)要求較高。

冠狀病毒首個(gè)體外連接系統(tǒng)是針對豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)構(gòu)建的全長感染性cDNA克隆[30]。將病毒基因組體外克隆的cDNA片段進(jìn)行順序連接，組裝成全長cDNA。通過體外轉(zhuǎn)錄獲得病毒mRNA，電轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中，成功拯救重組病毒。該研究證明同時(shí)表達(dá)N蛋白有助于提高重組病毒的拯救效率。研究表明，磷酸化的N蛋白比非磷酸化或部分修飾的N蛋白能更有效地拯救獲得感染性IBV[31]。針對H120疫苗株，周生等[32]采用RT-PCR方法將其基因組分為10個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增，克隆至pMD19-T載體，將各DNA片段進(jìn)行體外連接，獲取H120株的基因組全長cDNA。通過T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成病毒基因組RNA，轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞并進(jìn)行病毒拯救。此外，該團(tuán)隊(duì)以相同的方法對QX型毒株IBYZ全基因組分為10個(gè)片段擴(kuò)增，成功構(gòu)建了QX型強(qiáng)毒株的反向遺傳系統(tǒng)[33]。Zhou等[34]體外擴(kuò)增H120株13個(gè)病毒基因組片段，克隆到pMD19-T載體中。在T4連接酶作用下，體外連接病毒的全長cDNA，將全長基因組cDNA轉(zhuǎn)錄子與N基因轉(zhuǎn)錄子共同電轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中，收獲細(xì)胞并接種到SPF雞胚中成功拯救了H120的感染性克隆。魏衍全等[35]利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到H120株S基因胞外域，置換到Beaudette株全長cDNA克隆相應(yīng)區(qū)段，構(gòu)建了含有上述區(qū)段的重組cDNA克隆BeauR-H120(S1)。李然等[36]將M41株全基因組分為14段分段擴(kuò)增，體外拼接成基因組全長cDNA，成功構(gòu)建了IBV經(jīng)典毒株M41株的感染性克隆。許紀(jì)剛等[37]分13個(gè)片段擴(kuò)增H52株全長cDNA，采用改進(jìn)的No see’m連接技術(shù)和多片段同時(shí)連接的方法，成功體外連接出病毒的全長cDNA，拯救并獲得了H52株的反向遺傳株。翁文蓮[38]等以 IBV 細(xì)胞適應(yīng)株 Beaudette-R為研究對象，通過體外連接技術(shù)，構(gòu)建并拯救獲得Nsp15核酸內(nèi)切酶活性缺陷型重組病毒，探討Nsp15在IBV感染和復(fù)制過程中的作用。

2.3 基于痘病毒載體的感染性cDNA克隆

痘病毒作為一種基因組大的DNA病毒有以下優(yōu)點(diǎn)：痘病毒可容納大的外源基因片段，并且病毒本身的感染性和復(fù)制能力不受影響；插入的外源基因片段可在痘病毒基因組中穩(wěn)定復(fù)制并表達(dá)，不需要依賴原核表達(dá)系統(tǒng)；痘病毒作為全長cDNA的載體，可以通過同源重組對痘病毒進(jìn)行基因修飾，便于對冠狀病毒基因組克隆進(jìn)行基因突變、插入或缺失[39]。

基于痘病毒載體的反向遺傳系統(tǒng)最先用于重組HCoV-229E的構(gòu)建，研究人員將病毒基因組克隆至痘病毒中，在體外以cDNA為模板轉(zhuǎn)錄生成感染性RNA，拯救獲得重組病毒[40]。IBV首個(gè)反向遺傳系統(tǒng)是針對Beaudette株痘病毒載體的感染性克隆的構(gòu)建。首先，在T7 RNA聚合酶啟動子下游組裝IBV基因組cDNA，克隆到痘病毒基因組中，構(gòu)建重組痘病毒。隨后，將重組痘病毒與表達(dá)T7 RNA聚合酶的雞痘病毒共同轉(zhuǎn)染到CK細(xì)胞中，拯救獲得感染性克隆[41]。在IBV痘病毒反向遺傳操作系統(tǒng)基礎(chǔ)上，Bickerton等[42]進(jìn)一步優(yōu)化方法，使用瞬時(shí)顯性選擇法在IBV cDNA中引入修飾，感染表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組痘病毒，共轉(zhuǎn)染CK細(xì)胞，拯救獲得重組病毒。針對強(qiáng)毒株YN株，Zhao等[43]建立了基于痘病毒的反向遺傳系統(tǒng)。將YN株全基因組分為10個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過同源重組克隆到痘病毒中。體外轉(zhuǎn)錄全長基因組cDNA，將轉(zhuǎn)錄子轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達(dá)N蛋白的BHK-21/N細(xì)胞中，進(jìn)行病毒拯救。48 h后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物并接種到10日齡SPF雞胚中進(jìn)行病毒增殖。

2.4 靶向RNA重組

冠狀病毒基因組較大，復(fù)制酶區(qū)域存在不穩(wěn)定性，使冠狀病毒基因組作為cDNA克隆在大腸桿菌中增殖較為困難。為了克服這些障礙，Masters等[44]在尚不清楚能否構(gòu)建全長感染性cDNA克隆的情況下，建立了靶向RNA重組技術(shù)。靶向RNA重組系統(tǒng)基于S基因的交換，可將不同宿主依賴性的冠狀病毒S基因進(jìn)行交換，便于對不同物種的易感細(xì)胞進(jìn)行選擇。靶向RNA重組最先應(yīng)用于小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)[45]，構(gòu)建MHV感染性克隆分為兩步，首先構(gòu)建攜帶MHV S基因并具有嚴(yán)格小鼠細(xì)胞親和力的嵌合冠狀病毒，隨后在病毒特異性適應(yīng)細(xì)胞上拯救靶向重組病毒?；虿倏v主要集中在IBV基因組結(jié)構(gòu)3′端區(qū)域。靶向RNA重組構(gòu)建方便，可用于拯救高度變異的毒株。由于該系統(tǒng)是基于細(xì)胞水平上的冠狀病毒增殖，因此不適用于致病性IBV。 但是，可以將IBV基因組RNA轉(zhuǎn)染到非易感細(xì)胞中，用MHV的S基因替換IBV S基因，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中拯救重組病毒。van Beurden等[46]以弱毒株H52株為研究對象，構(gòu)建了IBV靶向RNA重組系統(tǒng)。首先，將IBV基因組 RNA和攜帶MHV S基因的嵌合IBV轉(zhuǎn)錄子共轉(zhuǎn)染到非易感細(xì)胞中，以生成重組嵌合鼠化IBV中間體(mIBV)，此時(shí)，由于IBV編碼S蛋白外胞外域的基因組被MHV基因組取代，可在小鼠細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖；隨后，mIBV作為受體，通過引入完整的IBV S基因，構(gòu)建包含IBV基因組3′端的重組RNA，在雞胚中拯救獲得重組毒株。重組病毒在雞胚以及1日齡雛雞體內(nèi)的表型特征與野毒株相似。

大多數(shù)IBV毒株，包括田間分離株，只能在雞胚中增殖，不能在連續(xù)傳代的細(xì)胞系中感染和增殖。靶向RNA重組技術(shù)為這類毒株感染性克隆的構(gòu)建提供了可能。應(yīng)用靶向RNA重組技術(shù)修飾IBV基因組3′端編碼結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白的基因，可以對強(qiáng)毒株結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白基因進(jìn)行研究[46]。通過引入特定突變，為IBV減毒活疫苗的構(gòu)建和生物學(xué)特性研究打下基礎(chǔ)。但是，靶向RNA重組技術(shù)有嚴(yán)格的限制性，它不能在編碼復(fù)制酶的基因上進(jìn)行操作。

3 IBV反向遺傳系統(tǒng)的應(yīng)用

IBV反向遺傳系統(tǒng)通過替換、缺失或插入核苷酸等定點(diǎn)突變產(chǎn)生重組病毒，是研究病毒分子生物學(xué)和致病機(jī)制的重要方法。目前IBV反向遺傳系統(tǒng)主要用于病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能研究、新型疫苗研發(fā)和病毒表達(dá)載體研究等。

3.1 病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能研究

為研究IBV S蛋白與病毒致病性的關(guān)系，Hodgson 等[47]利用反向遺傳技術(shù)將Beaudette株的S蛋白基因替換為致病型M41株的S蛋白，研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)M41株的S蛋白的Beau-R仍是非致病性的，但免疫雞后可對M41株產(chǎn)生保護(hù)作用。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用BAC反向遺傳系統(tǒng)將H120株的S1基因替換為野毒株SC021202的S1基因，可拯救獲得重組毒株rH120/SCS1[26]。雛雞致病性試驗(yàn)表明，雛雞免疫rH120/SCS1可對SC021202產(chǎn)生免疫，但重組毒株rH120/SCS1不具有致病性，說明S1蛋白可能不是SC021202高致病性的關(guān)鍵因素。針對QX型強(qiáng)毒株YN株，Zhao等[48]借助反向遺傳技術(shù)，將YN株的S基因或5a基因替換為弱毒株aYN株的相應(yīng)區(qū)域，構(gòu)建并拯救獲得重組病毒rYN-S-aYN 和 rYN-5a-aYN。重組病毒在雞胚中表現(xiàn)為減毒表型，感染雛雞表現(xiàn)為死亡率降低、體內(nèi)病毒滴度下降、組織損傷程度降低，從而證明了S基因和5a基因是強(qiáng)毒株毒力減弱的主要原因。

為研究IBV S蛋白高變區(qū)(hypervariable region，HVR)在病毒致病性和組織嗜性中的作用，Shan等[49]利用反向遺傳技術(shù)將IBV Beaudette株的3個(gè)HVR分別或同時(shí)替換為QX型腎型毒株ck/CH/LDL/091022的相應(yīng)片段，構(gòu)建并拯救獲得7株重組IBV。通過細(xì)胞和雞胚增殖試驗(yàn)、SPF雛雞體內(nèi)致病性試驗(yàn)探索HVR的功能。為研究病毒S蛋白與細(xì)胞嗜性的相關(guān)性，Bickerton等[50]通過反向遺傳技術(shù)將 Beaudette株的S蛋白膜外片段與強(qiáng)毒株M41-CK的相應(yīng)區(qū)域替換，得到了具有M41-CK的體外細(xì)胞嗜性的重組毒株BeauR-M41(S)。研究表明，S2亞基決定病毒在Vero細(xì)胞中的親嗜性，S2裂解位點(diǎn)附近的3個(gè)氨基酸突變與Beaudette株適應(yīng)Vero細(xì)胞相關(guān)。姜逸等[51-52]借助反向遺傳操作技術(shù)，以H120疫苗株、QX型毒株IBYZ和YZ120毒株的基因組為骨架，分別對S、S1或S2基因進(jìn)行嵌合表達(dá)，確定了V617I的突變是YZ120毒株適應(yīng)原代CK細(xì)胞的關(guān)鍵位點(diǎn)。

IBV反向遺傳系統(tǒng)還可以應(yīng)用于輔助蛋白的功能研究。Laconi等[19]基于靶向RNA重組系統(tǒng)缺失H52株的輔助基因3a、3b、5a和5b，通過雞胚接種試驗(yàn)和1日齡SPF雛雞感染試驗(yàn)，證明缺失輔助基因?qū)е轮亟M病毒產(chǎn)生減毒表型。針對QX型強(qiáng)毒株，在IBYZ株反向遺傳系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，拯救獲得IBYZ株輔助蛋白3a、3b沉默表達(dá)的重組病毒。1日齡SPF雛雞攻毒試驗(yàn)表明，輔助蛋白缺失的重組病毒在雛雞體內(nèi)的致病性減弱，其中輔助蛋白3b缺失的致病性減弱作用較為明顯[33]。

3.2 新型疫苗研究

疫苗免疫是預(yù)防IBV感染的有效途徑。市售疫苗大多為滅活疫苗和弱毒疫苗，滅活疫苗雖然安全性好，但是制備成本較高，且免疫效果不理想；弱毒疫苗是由病毒在雞胚中連續(xù)傳代產(chǎn)生的毒力減弱但保留免疫原性的活毒株，在雞體內(nèi)有一定的致病性，且存在毒株變異與毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)S1基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析，目前我國的主要流行毒株為QX型毒株[53]，與Mass型毒株的核苷酸同源性較低[54]，傳統(tǒng)弱毒疫苗如H120屬于Mass型毒株，針對QX型毒株的保護(hù)性差。反向遺傳學(xué)技術(shù)在RNA病毒疫苗研發(fā)中起重要作用，通過反向遺傳技術(shù)開發(fā)基因型匹配疫苗、減毒活疫苗、廣譜疫苗載體或基因標(biāo)記重組疫苗等，能夠針對不同血清型或基因型毒株產(chǎn)生免疫，比滅活疫苗或弱毒疫苗更為安全高效。

現(xiàn)有疫苗的交叉保護(hù)效果較差，為闡明S1蛋白在免疫保護(hù)中的作用，Ellis等[55]借助反向遺傳操作系統(tǒng)，以Beaudette株為基礎(chǔ)，用重組IBV進(jìn)行同源疫苗接種試驗(yàn)。結(jié)果表明，S1蛋白與不同血清型產(chǎn)生交叉保護(hù)作用有關(guān)。因此，針對致病性Beaudette株設(shè)計(jì)減毒活疫苗可以誘導(dǎo)免疫保護(hù)。Bickerton等[56]以Beaudette株為骨架，借助反向遺傳技術(shù)將H120或QX型強(qiáng)毒株的S1基因替換Beaudette株S1基因，構(gòu)建并拯救獲得重組病毒BeauR-H120(S1)和 BeauR-QX(S1)，獲得的重組病毒能夠在原代雞腎細(xì)胞和Vero細(xì)胞中復(fù)制，為研發(fā)能在 Vero細(xì)胞中有效復(fù)制的IBV疫苗奠定基礎(chǔ)。Ting等[57]借助反向遺傳技術(shù)，將Beaudette-p65株S1基因替換為QX型KC分離株的S1基因，拯救了嵌合S1基因的rIBV-Beaudette-KC(S1)，該重組病毒免疫雛雞可產(chǎn)生較高水平的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并能夠?qū)41株和QX型毒株產(chǎn)生較好的交叉保護(hù)效果，可作為疫苗候選株。Jiang等[58]利用體外連接反向遺傳技術(shù)，以疫苗株H120為骨架，將S1基因替換替換為QX型強(qiáng)毒株的S1，構(gòu)建并拯救獲得重組病毒rH120-S1/YZ。重組病毒對1日齡雛雞的安全性好且能夠產(chǎn)生針對強(qiáng)毒株的免疫保護(hù)力，可作為QX型流行毒株的候選疫苗。van Beurden等[59]以H52為研究對象，建立了基于靶向RNA重組技術(shù)的反向遺傳系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)刪除了IBV基因組中輔助基因3和基因5，構(gòu)建并拯救獲得重組病毒。重組毒株在雞胚中的復(fù)制與親本株相似，證實(shí)了基因3和基因5不是病毒復(fù)制必需的。病毒缺失基因3或基因5后毒力降低，對M41株的攻毒具有保護(hù)作用，為新型減毒疫苗株的研發(fā)打下基礎(chǔ)。Keep 等[60]建立了致病性毒株 M41株的反向遺傳系統(tǒng)，通過對復(fù)制酶基因進(jìn)行特異性修飾，確定了毒力致弱的靶向基因，為IBV減毒活疫苗的開發(fā)提供新的方向。

3.3 病毒表達(dá)載體研究

為探討IBV作為載體表達(dá)外源基因的可行性，周生等[61]利用反向遺傳技術(shù)，將H120株基因組中的5a基因編碼區(qū)替換為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因，拯救獲得重組病毒H120-5a/EGFP株。該重組毒株在雞胚中能有效復(fù)制和傳代，并表達(dá)綠色熒光蛋白，證實(shí)通過替換IBV基因組中的5a基因來表達(dá)外源基因是可行的。Bentley 等[62]利用反向遺傳學(xué)技術(shù)制備了表達(dá)EGFP和人源化海腎熒光素酶的感染性重組病毒。姜逸等[63]以H120為載體，將雞IFN-γ(ChIFN-γ)基因替換了5a基因編碼區(qū)，拯救獲得H120-cIFNγ/5a病毒株，并對其感染雞胚的能力以及在雞胚中的傳代穩(wěn)定性進(jìn)行了評估，為以IBV為載體的新型基因重組疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。Yang等[64]借助反向遺傳系統(tǒng)，以H120株為載體，構(gòu)建并拯救獲得表達(dá)新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)血凝素-神經(jīng)氨酸酶(haemagglutinin-neuraminidase，HN)蛋白的重組病毒R-H120-HN/5a。重組病毒接種SPF雞胚后，其增殖曲線、致病性和病毒滴度與H120親本株相似，而且具有NDV的血凝活性。重組病毒接種SPF雞后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的IBV特異性IgG抗體水平與市售二價(jià)疫苗LaSota/H120相當(dāng)，對IBV致病性毒株M41和NDV強(qiáng)毒株感染提供了有效保護(hù)。因此，IBV可作為二價(jià)疫苗的載體，通過表達(dá)外源基因預(yù)防IBV與其他病原體的感染。

病毒作為載體表達(dá)外源基因取決于多種因素，包括病毒的遺傳背景、插入外源基因在病毒基因組中的位置，以及替換基因是否影響病毒復(fù)制等[62]。重組IBV的穩(wěn)定性取決于外源基因組位置、基因表達(dá)所需的病毒基因組修飾水平以及插入外源基因后IBV結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)效果。IBV輔助基因不是病毒復(fù)制所必需的，因此可以對輔助基因進(jìn)行刪除或替換，成為表達(dá)載體的靶點(diǎn)。

4 小結(jié)

反向遺傳操作技術(shù)通過構(gòu)建病毒感染性分子克隆，在cDNA分子水平上進(jìn)行基因操作，進(jìn)一步產(chǎn)生具有生物活性的RNA分子，解決了RNA病毒基因組難以操作的困難。通過反向遺傳操作技術(shù)可以在病原學(xué)基礎(chǔ)上研究RNA病毒的結(jié)構(gòu)、基因以及氨基酸位點(diǎn)的功能，有助于RNA病毒的生物學(xué)特性研究。

冠狀病毒的基因組大，全長cDNA的構(gòu)建較為困難。使用傳統(tǒng)的質(zhì)粒DNA克隆技術(shù)不能確保大片段cDNA的穩(wěn)定性。一些冠狀病毒的基因序列對于大腸桿菌具有毒性，不能克隆到傳統(tǒng)的質(zhì)粒載體中，或者不能在真核載體系統(tǒng)中傳代。直到21世紀(jì)初，才成功構(gòu)建IBV全長感染性克隆。大部分IBV反向遺傳操作系統(tǒng)是基于Beaudette株或者M(jìn)ass型毒株建立的。Beaudette株是細(xì)胞適應(yīng)株，能在Vero細(xì)胞上增殖，但在雞體內(nèi)沒有致病性。Mass型毒株與我國流行的QX型毒株的基因型差距較大。近年來，研究人員針對QX型毒株建立了多個(gè)反向遺傳操作系統(tǒng)，并進(jìn)行了QX型毒株的免疫學(xué)和體內(nèi)致病性的研究，為IBV發(fā)病機(jī)理研究和疫病防控打下了基礎(chǔ)。IBV反向遺傳技術(shù)不斷發(fā)展成熟，在病毒致病機(jī)制研究和基因工程類疫苗研發(fā)等方面取得了突破性進(jìn)展，是病毒的分子生物學(xué)研究、致病機(jī)制研究以及新型疫苗研發(fā)的重要途徑。