胡世享，葉玲玲，肖妍，卓娜，陳朝林，汪琳，蒲靜，陳培富*，艾軍*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學，云南 昆明 651000；2. 昆明海關(guān)技術(shù)中心，云南 昆明 651000；3. 天津海關(guān)動植物與食品檢測中心，天津 300041；4. 中國海關(guān)科學技術(shù)研究中心，北京 100026)

赤羽病又稱阿卡斑病(Akababe disease，AKA)，由赤羽病病毒(Akabane virus，AKV)引起的牛、羊傳染病，主要癥狀有早產(chǎn)、妊娠損失、死胎、先天性關(guān)節(jié)彎曲以及多水性無腦畸形癥[1-2]。AKV屬于泛布尼亞病毒科、辛波病毒群[3-4]，單股負鏈RNA病毒[5]，是一種具有囊膜、纖突的球狀蟲媒性病毒。

AKV基因組由3個RNA片段組成，即大(L)、中(M)、小(S)。L-RNA發(fā)揮催化作用，協(xié)助病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；M-RNA表達合成促使機體產(chǎn)生中和抗體及血凝抑制抗體的囊膜糖蛋白G1和G2[6]；S-RNA編碼具有群特異性抗原表位的核衣殼蛋白[7-8]。作為AKV主要囊膜蛋白G1，其氨基端位于病毒粒子表面，能被脊椎動物宿主免疫系統(tǒng)所識別，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生強烈的特異性免疫反應(yīng)，最終產(chǎn)生保護性的中和抗體[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)通過3種不同制劑對小鼠進行免疫試驗，證實G1蛋白含有中和抗原決定簇，并引起小鼠的保護性免疫[11-12]。G1蛋白是決定AKV致病力及感染性的重要基因產(chǎn)物，也是刺激機體產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，對疫病監(jiān)測和防控都具有重要意義。鑒于G1蛋白對AKV起著重要作用，本文對G1基因編碼的蛋白質(zhì)進行生物信息學分析，從中篩選結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的優(yōu)勢抗原區(qū)域，并在此基礎(chǔ)上利用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)對截短基因進行表達，為進一步深入了解AKV G1的免疫特性及生物學特性奠定基礎(chǔ)，也為進一步研制以赤羽病G1截短表達產(chǎn)物為抗原的檢測試劑提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種和細胞

大腸桿菌DH10Bac、sf9昆蟲細胞、pFastBac HTB質(zhì)粒、AKV病毒KR260715.1病毒株及陽性血清均由昆明海關(guān)技術(shù)中心動檢實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購于北京擎科生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和PstⅠ、DNA Marker、蛋白Marker、T4連接酶、BSA、DAB均購自寶生物工程(大連)股份公司；Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑制備盒由Invitrogen有限公司生產(chǎn)；胎牛血清、Grace’s細胞培養(yǎng)基購自GBICO公司；兔抗山羊IgG-HRP購自武漢博士德生物工程有限公司；高效RIPA組織/細胞裂解液、PMSF均購自Solarbio公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學分析

利用在線軟件 Protparam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)分析AKV G1結(jié)構(gòu)的基本生化特性；軟件NetPhos3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)，Sig-nalP4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測蛋白中存在的潛在磷酸化位點；軟件NetOGlyc4(www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc)，NetNGlyc1.0(www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)預(yù)測蛋白 N-糖基化潛在位點；利用在線工具 TMHMM(v2.0)(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預(yù)測G1蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)；利用 Cell-PLoc2.0(www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2)軟件預(yù)測蛋白的亞細胞定位；利用在線工具SOPMA(https://links.jianshu.com/go?to=http%3A%2F%2Fnpsa-pbil.ibcp.fr%2Fcgi-bin%2Fnpsa_automat.pl%3Fpage%3Dnpsa_sopma.html)預(yù)測G1蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用 Phyre2(www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)，并用 RasWin軟件進行查看；利用在線軟件IEDB(https://www.iedb.org)預(yù)測蛋白的T細胞和B細胞抗原表位。

1.3.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank發(fā)布的KR260715病毒株全基因組序列(GenBank登錄號：927338546)利用在線軟件分析G1蛋白的線性抗原表位，從G1蛋白中篩選出具有優(yōu)勢抗原性的基因片段，即G1蛋白中的208個氨基酸肽段(189～397 aa)，并設(shè)計引物進行目的基因克隆，目的片段擴增長度為653 bp。參考 Bac-to-Bac桿狀病毒的表達體系使用說明書合成用于鑒定穿梭桿狀病毒的通用M13引物，下劃線為酶切位點。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.3.3 目的基因克隆及其純化

利用核酸提取試劑盒提取AKV病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄。利用所設(shè)計的特異性引物AKV-F/AKV-R克隆AKV目的基因，其中模板RNA總量5 μL，反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2 μL，2×1 step buffer 25 μL，上下游引物(20 pmol/L)各1 μL，滅菌去離子水16 μL，輕輕混勻。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像體系中，將PCR產(chǎn)物按凝膠回收試劑盒的標椎操作步驟進行純化回收。

1.3.4 目的基因與表達載體的構(gòu)建

利用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物，與經(jīng)相同酶切處理的 pFastBac HTB載體，連接轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含有100 μg/mL氨芐固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，挑取單一菌落于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)15 h，提取質(zhì)粒。獲得重組供體質(zhì)粒，對其進行PCR、雙酶切鑒定，將鑒定過的重組質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司測序，測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對。以確定目的基因組及其表達載體是否構(gòu)建成功，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pFastHTB-AKV-G1-2。

1.3.5 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)Bac-to-Bac桿狀病毒的表達體系，將pFastHTB-AKV-G1-2轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，將菌液全部涂布于含有濃度為50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL四環(huán)素、10 μg/mL慶大霉素的 LB固體平板上，在37 ℃恒溫箱進行48 h的培養(yǎng)。從上述平板上選擇形態(tài)良好且單一的菌落接種在LB液體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含卡那霉素(50 μg/mL)、四環(huán)素(7 μg/mL)和慶大霉素(10 μg/mL)3種抗生素。37 ℃恒溫搖床條件下過夜培養(yǎng)15 h，并根據(jù) Bac-to-Bac操作手冊中的操作步驟，提取重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-AKV-G1-2，并使用引物M13進行PCR鑒定目的基因是否插入。反應(yīng)體系為：10×LATaqBuffer Ⅱ 5 μL，TaKaRaLATaq(5 U/μL)0.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)8 μL，M13上下游引物各1 μL，菌液5 μL，ddH2O 29.5 μL，總體系50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.6 重組病毒的拯救與蛋白表達

根據(jù)Invitrogen Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systen 應(yīng)用說明手冊，將構(gòu)建的重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-AKV-G1-2在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染對數(shù)期增殖的sf9昆蟲細胞，設(shè)置空白對照組(健康sf9細胞)，轉(zhuǎn)染后27 ℃培養(yǎng)觀察，待80%～90%細胞出現(xiàn)裂解，收集已出現(xiàn)嚴重病變的sf9細胞和培養(yǎng)上清液，凍融3次，3 000 r/min離心5 min除去細胞和大細胞碎片，收集上清液為病毒種毒，感染sf9細胞，27 ℃培養(yǎng)120 h后用同樣的方法獲得第二代(P2)和第三代(P3)重組病毒。

1.3.7 重組蛋白的Western blot分析

使用購于Solarbio公司的高效組織細胞裂解液，取 P3代重組病毒感染細胞及正常sf9細胞各20 mL進行裂解，裂解步驟詳見說明書，上清液用15%的分離膠和4%的濃縮膠進行SDS-PAGE檢測，將電泳后的凝膠電泳蛋白區(qū)轉(zhuǎn)移至固相載體硝酸纖維膜(PVDF膜)上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5% BSA封閉1 h，1×PBST洗滌3次，加入1∶10稀釋的AKV山羊陽性血清，4 ℃過夜孵育，再用1×PBST洗滌3次，每次10 min，加入1∶3 000稀釋的兔抗山羊IgG-HRP，37 ℃孵育1 h，重復(fù)上述洗滌步驟，使用DAB顯色觀察，拍照留存。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學分析

2.1.1 理化性質(zhì)

利用在線軟件分析AKV G1基因編碼蛋白質(zhì)的基本生化特性，結(jié)果顯示，G1基因共編碼808個氨基酸，理論蛋白分子式為C4003H6347N1099O1211S49，總原子數(shù)為12 709，總分子質(zhì)量為 90 817.01 D，理論等電點為85.87。氨基酸組成：共含有約20種氨基酸，所占的比重最大(8.5%)為異亮氨酸，所占的比重較小(0.9%)為色氨酸，并且包含83個負電荷氨基酸堿基(天冬氨酸+谷氨酸)和94個正電荷氨基酸(精氨酸+賴氨酸)，如表2所示。消光系數(shù)為 92 900，不穩(wěn)定系數(shù)為32.33，表明該蛋白為穩(wěn)定蛋白，預(yù)計的半衰期為1.3 h，脂肪系數(shù)為 85.87，總平均親水性為-0.322，使用ProtScale 軟件分析其蛋白親疏水性，發(fā)現(xiàn)該蛋白結(jié)構(gòu)為親水性蛋白。

表2 G1蛋白氨基酸組成

2.1.2 磷酸化、糖基化位點及亞細胞定位

利用軟件分析 G1氨基酸序列中存在的潛在磷酸化作用位點，結(jié)果顯示，共存在80個潛在的蘇氨酸磷酸化位點，如圖1所示。

圖1 G1蛋白磷酸化位點預(yù)測

利用軟件完成的G1蛋白N-糖基化位點預(yù)測，結(jié)果顯示有6個潛在的N-糖基化位點，分別在第31、96、176、260、330、369位氨基酸，如圖2所示。

圖2 G1蛋白N-糖基化位點預(yù)測

使用在線軟件對G1蛋白進行定位分析，結(jié)果顯示在G1蛋白808個氨基酸中，僅在前60個氨基酸中存在跨膜氨基酸0.000 32；利用軟件對G1蛋白的亞細胞結(jié)構(gòu)進行定位分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G1蛋白在宿主細胞質(zhì)、細胞核中分布較多。

2.1.3 G1蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件分析G1蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示，G1蛋白共含有α-螺旋210個，延伸鏈184個，β-折疊34個，無規(guī)則卷曲380個，其中α-螺旋占25.99%，延伸鏈占22.77%，β-折疊占4.21%，無規(guī)則卷曲占47.03%。利用在線軟件建立了AKV G1蛋白的三級模型(圖4)，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致，G1蛋白的三級結(jié)構(gòu)是環(huán)狀的，非常穩(wěn)定，更多β-折疊位于蛋白質(zhì)中間；在蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的上部和下部存在許多易于形成構(gòu)象表位的結(jié)構(gòu)。

Hh.α-螺旋；Ee.延伸鏈；Tt.β-折疊；Cc.無規(guī)卷曲。圖3 G1蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

圖4 G1蛋白三級結(jié)構(gòu)分析

通過在線軟件對G1氨基酸序列進行表位預(yù)測和分析，結(jié)果顯示其具有26個T細胞優(yōu)勢抗原表位(表3)，30個B細胞優(yōu)勢抗原表位(表4)?？乖匀鐖D5所示，縱坐標數(shù)值代表對應(yīng)橫坐標區(qū)域的氨基酸抗原性數(shù)值，以0.5為閾值，數(shù)值越高則表示該區(qū)的氨基酸抗原性越強，黃色區(qū)間為各肽段預(yù)測存在抗原表位的區(qū)域，結(jié)果顯示抗原指數(shù)較高區(qū)域為：1～80 aa、140～180 aa、189～397 aa、300～400 aa、560～620 aa。綜合細胞表位肽段免疫原性得分，選取了1個由208個氨基酸組成的肽段(189～397 aa)進行抗原性預(yù)測分析。如圖6所示，蛋白質(zhì)的理化分析顯示，該段截短表達蛋白為親水性蛋白，具有較好的穩(wěn)定性，跨膜區(qū)預(yù)測顯示該蛋白存在跨膜區(qū)，推測該蛋白主要以包涵體形式存在；該蛋白存在多個潛在的磷酸化位點，且該片段二級結(jié)構(gòu)中β-折疊與無規(guī)則卷曲所占比例超過50%。綜合以上分析，該肽段具有較好的抗原優(yōu)勢表位，則選取該肽段進行截短表達。

圖5 G1(1～808 aa)氨基酸抗原性預(yù)測

圖6 208個氨基酸肽段(189～397 aa)抗原性預(yù)測

表3 T細胞表位預(yù)測

表4 B細胞表位預(yù)測

2.1.4 目的基因的克隆、鑒定

電泳圖顯示在653 bp處出現(xiàn)單一條帶，與預(yù)期大小相符，如圖7所示，經(jīng)測序鑒定證實該 DNA 合成片段的堿基序列及編碼的氨基酸序列完全正確，即獲得所需克隆目的片段。

M. DNA標準DL2000；1～2. AKV-G1-2基因的PCR產(chǎn)物。圖7 G1-2基因PCR擴增

2.1.5 重組供體質(zhì)粒HTB-AKV-G1-2 的鑒定

PCR產(chǎn)物與 pFastBac HTB載體連接后，經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切可以在4 856和653 bp處看到2個條帶，如圖8所示，大小與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)PCR、酶切、測序鑒定，結(jié)果表明外源性目標片段的大小和閱讀框正確，成功構(gòu)建了重組供體質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒命名pFastHTB-AKV-G1-2。

M.DNA標椎DL5000；1. 重組質(zhì)粒pFastHTB-AKV-G1-2；2. pFastBac HTB空載體；3～4. pFastHTB-AKV-G1-2經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切。圖8 重組供體質(zhì)粒pFastHTB-AKV-G1-2酶切鑒定

2.1.6 重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-AKV-G1-2的PCR鑒定

將pFastHTB-AKV-G1-2重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH10Bac感受態(tài)細胞后，經(jīng)含有慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素的平板培養(yǎng)篩選48 h后提取重組穿梭質(zhì)粒，用M13引物進行PCR鑒定，結(jié)果擴增的產(chǎn)物分別為3 083和300 bp，未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的DH10Bac菌株僅在300 bp出現(xiàn)條帶，如圖9所示，證明目的片段已經(jīng)成功轉(zhuǎn)座至Bacmid，重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-AKV-G1-2構(gòu)建成功。

M.DNA標椎DL5000；1. Bacmid-AKV-G1-2用引物M13的PCR產(chǎn)物；2～3. 未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DH10Bac。圖9 重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-AKV-G1-2的PCR鑒定

2.1.7 重組病毒的拯救

提取重組穿梭質(zhì)粒，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染對數(shù)期增殖的健康sf9昆蟲細胞，設(shè)立空白對照組，27 ℃進行培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染Bacmid-AKV-G1-2 的細胞，培養(yǎng)120 h病變明顯，與正常細胞相比，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞明顯變大、變圓，并開始出現(xiàn)裂解，如圖10所示。

2.1.8 重組蛋白的SDS-PAGE鑒定和Western blot分析

將重組病毒感染的細胞裂解上清液用15%的分離膠和4%的濃縮膠進行SDS-PAGE分析，結(jié)果在約27 kDa左右可見表達產(chǎn)物，見圖11，與預(yù)期大小一致。以AKV抗體陽性血清為一抗，兔抗山羊IgG-HRP為二抗，Western blot結(jié)果表明重組蛋白能被特異性識別，如圖12所示，在約27 kDa處出現(xiàn)特異性目的印跡，而正常細胞上清液中在此位置沒有出現(xiàn)特異性印跡，證明截短表達產(chǎn)物在昆蟲細胞中得以表達。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1. 正常的sf9細胞；2. 轉(zhuǎn)染Bacmid-AKV-G1-2的sf9細胞。圖11 重組蛋白SDS-PAGE分析

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1. 轉(zhuǎn)染Bacmid-AKV-G1-2的sf9細胞。圖12 Bacmid-AKV-G1-2重組蛋白Western blot分析

3 討論

2021年8月之前，赤羽病對我國養(yǎng)殖業(yè)的危害報道較少。隨后，我國東北多個地區(qū)牛養(yǎng)殖區(qū)出現(xiàn)懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，新生牛犢畸形等現(xiàn)象，主要癥狀為患病犢牛出生后四肢關(guān)節(jié)彎曲呈蜷縮狀，脊柱和頭部變形，部分患病牛犢出現(xiàn)雙目失明、吞咽困難等癥狀，其后吉林大學動物醫(yī)學院王新平教授團隊，分離到赤羽病病毒。中國動物疫病預(yù)防控制中心監(jiān)測結(jié)果顯示，除黑龍江省未檢出赤羽病陽性病例外，其他省份均有報告檢出赤羽病病例，現(xiàn)赤羽病病毒在我國已較為普遍存在[13]。赤羽病的防控現(xiàn)尚無商品化疫苗，因此對于此病的檢測監(jiān)測尤為重要。

在AKV的所有蛋白中，G1是 AKV的主要包膜蛋白，同時也是AKV致病能力和感染性的重要基因，它的氨基酸部分位于病毒顆粒的最表層，能被宿主的免疫系統(tǒng)所識別，進而使其形成免疫力反射，形成了保護性的中和抗體。有學者對G蛋白部分進行了截短表達和抗原性的研究，但其表達方式為包涵體或是利用原核表達獲得重組蛋白[14]。本研究前期嘗試用昆蟲細胞表達G1蛋白的整個編碼基因，但可能是表達基因片段較長、密碼子嗜好等原因，未能獲得表達完整的G1蛋白。本研究中采用生物信息學方法對AKV M片段上的G1基因進行分析，發(fā)現(xiàn)G1蛋白共含有α-螺旋210個，延伸鏈184個，β-折疊34個，無規(guī)則卷曲380個，具有26個T細胞優(yōu)勢抗原表位，30個B細胞優(yōu)勢抗原表位，5個抗原指數(shù)較高區(qū)域。綜合蛋白質(zhì)的理化分析，確定截短表達189～397 aa肽段蛋白為親水性蛋白，具有較好的穩(wěn)定性，該蛋白存在跨膜區(qū)，推測該蛋白主要以包涵體形式存在，這可為后續(xù)的純化及研究奠定基礎(chǔ)。該蛋白存在多個潛在的磷酸化位點，推測可能與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白定位有關(guān)系，且該片段二級結(jié)構(gòu)中β-折疊與無規(guī)則卷曲占比較高，表明該蛋白具有形成抗原表位的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。β-折疊一般作為凸出結(jié)構(gòu)位于蛋白質(zhì)位置表面，容易產(chǎn)生扭曲結(jié)構(gòu)，更容易與抗體結(jié)合。由于β-折疊的生物學特性，使得β-折疊存在的區(qū)域更容易形成抗原表位。細胞表位預(yù)測結(jié)果表明該截短片段細胞免疫原性得分較高，存在豐富的潛在抗原表位，屬于優(yōu)勢抗原肽段，選取該肽段(189～397 aa)利用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)進行表達，表達后的重組蛋白可與AKV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明重組表達產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性。

辛波病毒群M 基因節(jié)段的序列變異性較大，其編碼G蛋白的氨基酸序列同源性僅為33.1%～47.3%，而G蛋白在AKV各分離株之間的同源性卻很高，提示選用G蛋白為檢測抗原可能是提高AKV血清抗體ELISA檢測方法特異性的有效途徑[15-16]。Ogawa等[17]用AKV糖蛋白Gc的N端(1～97 aa)和中間(189～397 aa)2個重組蛋白與中和單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，并用這2個重組蛋白及其融合蛋白產(chǎn)物免疫小鼠，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。本研究對AKV G1蛋白進行生物學分析后，利用昆蟲細胞表達具有免疫活性的G1-2蛋白，理論上與天然蛋白構(gòu)像更接近，不僅可作為AKV血清抗體ELISA檢測方法的診斷抗原，而且也可以作為一種重要的AKV防控的亞單位疫苗候選抗原。