羅慧英，吳步梅，馬天玥，張文利，方彩霞，魏永波，陳輔斌

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000；3.蘭州市農(nóng)業(yè)科技研究推廣中心，甘肅蘭州 730000；4.中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 211198；5.皋蘭百璐通瓜果專業(yè)合作社，甘肅蘭州 730200；6.什川鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心，甘肅蘭州 730200）

軟兒梨（Pyrus ussuriensisMaxim.）也叫凍梨、香水梨，是蘭州特色水果。食用方法獨(dú)特，具有后熟發(fā)酵及凍食特性。每年深秋采摘，新鮮果品口味欠佳，果肉硬而味酸，冷凍貯藏40 多天后，果皮變黑，果肉發(fā)酵軟化，其品質(zhì)不因褐變而受到影響，果糖含量增加，此時(shí)食用梨軟如泥，漿液充盈，味甜似蜜，是中國(guó)地方梨品種中的一個(gè)特色品種。2015 年被農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為“全國(guó)農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志”。蘭州年產(chǎn)軟兒梨3 萬(wàn)多噸，但是由于技術(shù)原因，除直接食用和簡(jiǎn)單加工后制成果汁、果酒外，未見高附加值的下游產(chǎn)品，資源浪費(fèi)巨大，高值化、多品類的開發(fā)利用成為現(xiàn)今迫切需求。

咳嗽是呼吸道系統(tǒng)的常見病。中醫(yī)認(rèn)為“肺主宣發(fā)和肅降”，肺氣宣發(fā)通暢，則能主一身之氣而呼吸調(diào)勻，助血液循環(huán)而貫通百脈[1-2]。但肺為嬌臟，最易受外邪侵襲，如果受到風(fēng)、寒、暑、濕、燥、火六淫的侵襲，就會(huì)造成肺失宣降，肺氣上逆，引起咳嗽。按病邪性質(zhì)咳嗽可分為風(fēng)寒咳嗽、風(fēng)熱咳嗽、風(fēng)燥咳嗽，痰濕咳嗽等[3-6]。秋冬時(shí)節(jié)，由于氣候干燥多燥邪或風(fēng)邪犯肺引發(fā)咳嗽，治療多以清熱去燥；而內(nèi)傷咳嗽，多以臟器功能的失調(diào)為基礎(chǔ)，以痰濕、痰熱、肝火犯肺，肺陰虧損等為主要病癥，治療多以滋陰潤(rùn)肺為主[7-9]。軟兒梨性涼味甘，富含果酸、蘋果酸、檸檬酸、蔗糖、葡萄糖等成分，具有清熱解毒、潤(rùn)燥止咳，生津化痰、滋身祛疾之功效[10-11]，是藥食兼?zhèn)涞拿钇??！侗静菥V目》記載軟兒梨有潤(rùn)肺、止咳、涼心消炎、降火、解瘡毒、解酒等多種功效，當(dāng)?shù)厝顺７持枣?zhèn)咳化痰，但其具體作用機(jī)制鮮見報(bào)道。本研究旨在采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和生物信息分析技術(shù)對(duì)軟兒梨止咳化痰作用進(jìn)行研究，并通過分子對(duì)接和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以期為軟兒梨止咳化痰功效提供理論與試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、本草組鑒（http://herb.ac.cn）、ECTM數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.tcmip.cn/ETCM/）、STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、Metascape 分析平臺(tái)（https://metascape.org/）、PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Uiprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）、PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）、Cytoscape 3.6.1、Autodock Vina 2.1、Chem3D、Pymol 3.3、Venny 2.1.0 等。

1.2 材料與儀器

軟兒梨凍梨 甘肅皋蘭百璐通瓜果專業(yè)合作社提供，剝?nèi)ケ砥ず笞匀唤鈨鋈≈?000 mL，相當(dāng)于軟兒梨凍梨1460.7 g，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，總酚含量為149.14 mg/kg、總黃酮含量為58.23 mg/kg[12]；SPF 級(jí)昆明小鼠 100 只，18～20 g，雌雄各半，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（甘）2015-0002，動(dòng)物倫理審查批號(hào)：20 220714；麻杏止咳糖漿 太極集團(tuán)四川南充制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z51 022042；氨水、酚紅 青島海灣精細(xì)化工有限公司；IL-6 ELISA 試劑盒、IL-13 ELISA 試劑盒 南京建成生物工程研究所；RT-PCR 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RNA 提?。═rizol 法）試劑盒 上海翌圣生物科技股份有限公司；兔抗IL6多克隆抗體、兔抗IL1B 多克隆抗體、兔抗MAPK3多克隆抗體、兔抗VEGFA 多克隆抗體、兔抗PTGS2 多克隆抗體 上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

UV-5500 型紫外分光光度計(jì)、BS124S 型電子天平、B-600 型超微量分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；TDL-5M 型臺(tái)式大容量低溫離心機(jī) 上海精密儀器儀表有限公司；醫(yī)用KJR-602C 型超聲霧化器 合肥康居人智能科技有限公司；SUNRISE 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 瑞士TECAN 公司；PCR 擴(kuò)增儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀 美國(guó)Applied Biosystem 公司；

1645050 型基礎(chǔ)電泳儀、Mini-PROTEAN Tetra 電泳槽、小型rans-Blot 轉(zhuǎn)印槽 美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 軟兒梨止咳化痰作用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 通過調(diào)研，收集文獻(xiàn)已報(bào)道的軟兒梨化學(xué)成分，TCMSP、本草組鑒、ECTM 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索其對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別以關(guān)鍵詞“咳嗽（cough）”和“痰（sputum）”檢索，得到與咳嗽和生痰相關(guān)的兩組基因。將GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中所得兩組基因與軟兒梨的作用基因相映射，得到軟兒梨止咳化痰作用的靶點(diǎn)基因。Venny 2.1.0 繪制維恩圖，Cytoscape 繪制軟兒梨止咳化痰作用成分-靶點(diǎn)圖。將軟兒梨止咳化痰作用靶點(diǎn)基因提交至Metascape 數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，進(jìn)行GO 功能富集分析（包括Biological process、Cellular component、Molecular function）和KEGG 通路富集分析。將軟兒梨止咳化痰作用靶點(diǎn)基因提交至STRING 數(shù)據(jù)平臺(tái)，構(gòu)建軟兒梨止咳化痰作用靶點(diǎn)基因間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI 網(wǎng)絡(luò)）。利用Cytoscape插件CytoHubba，根據(jù)Degree 值過濾出PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因（Top10 基因）。通過Metascape 數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)Top10 基因進(jìn)行KEGG 通路富集，預(yù)測(cè)軟兒梨止咳化痰作用可能涉及的信號(hào)通路。

1.3.2 軟兒梨止咳化痰作用Top10 基因分子對(duì)接驗(yàn)證 Uiprot 數(shù)據(jù)庫(kù)、PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索下載Top10基因的蛋白結(jié)構(gòu)，PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前3 位的化學(xué)成分3D 結(jié)構(gòu)。采用Chem3D、Pymol 對(duì)受體和配體進(jìn)行加氫、去水、均電荷等預(yù)處理，采用Autodock Vina 進(jìn)行對(duì)接，設(shè)置對(duì)接20 次，采用Pymol 將結(jié)合能最小的對(duì)接結(jié)果可視化。

1.3.3 軟兒梨止咳化痰作用動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證

1.3.3.1 氨水引咳試驗(yàn) SPF 級(jí)昆明種小鼠50 只，雌雄各半，體重18～20 g，隨機(jī)分為5 組，分別為軟兒梨高、中、低劑量組（軟兒梨原汁0.2、0.15、0.1 mL/10 g），麻杏止咳糖漿（0.1 mL/10 g）為陽(yáng)性對(duì)照組，生理鹽水（0.1 mL/10 g）為空白對(duì)照組；每天灌胃給藥1 次，連續(xù)10 d。于最后1 次給藥1 h 后逐一將小鼠放入鐘罩內(nèi)，用醫(yī)用超聲霧化器以最大噴霧量（0.2 mL/min）向鐘罩內(nèi)噴入25%氨水氣霧對(duì)小鼠進(jìn)行引咳，15 s 后將小鼠移出，記錄從開始噴霧到小鼠產(chǎn)生第一次咳嗽所需時(shí)間（咳嗽潛伏期）和3 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)[13]。小鼠典型咳嗽癥狀為：腹部?jī)?nèi)縮，同時(shí)張大口，有咳嗽聲。并按公式計(jì)算止咳率。

1.3.3.2 酚紅排泄試驗(yàn) SPF 級(jí)昆明種小鼠50 只，雌雄各半，分組及給藥方法同氨水引咳試驗(yàn)。末次給藥30 min 后小鼠腹腔注射5%的酚紅溶液0.5 mL（0.5 g/kg），30 min 后處死動(dòng)物，剝離甲狀軟骨下至氣管分叉處的氣管，放入盛有2 mL 生理鹽水的試管中，加入1 mol/L 的NaOH 0.1 mL 搖勻，于波長(zhǎng)546 nm處測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酚紅含量（μg/mL）[14]。

1.3.3.3 ELISA 法檢測(cè)血清炎癥因子水平 氨水引咳試驗(yàn)中的小鼠，記錄咳嗽潛伏期和3 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)后，摘眼球取血，離心取血清，按ELISA 試劑盒說明測(cè)定血清中IL-6 和IL-13 含量。

1.3.3.4 RT-PCR 檢測(cè)肺組織中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3的mRNA 表達(dá) 氨水引咳試驗(yàn)中的小鼠，摘眼球取血后，處死動(dòng)物，冰上取出肺臟，分成兩份，-80 ℃冰箱保存，分別供逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和免疫印跡（WB）使用。取-80 ℃保存的肺組織50 mg，按試劑盒說明書提取收集RNA，將得到的RNA 溶于DEPC 水中；取溶解后的RNA 2 μL，微量分光光度計(jì)于260、280 nm 處測(cè)定吸光度，通過A260/A280 計(jì)算RNA 的純度和濃度。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，NCBI Geneba（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Primer Bank（http://harvard.edu）搜索基因序列，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物（引物序列見表1），采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，每個(gè)樣品做3 個(gè)復(fù)孔，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence

1.3.3.5 Western Blot 檢測(cè)肺組織中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 的蛋白表達(dá) 取適量-80 ℃保存的肝臟組織加入裂解液，8000 r/min，4 ℃低溫勻漿10 min，冰上裂解20 min 后凍融3 次，低溫離心10 min（8000 r/min，4 ℃），取上清，用5×上樣緩沖液與蛋白樣品按1:4 的比例混合，100 ℃變性5 min 后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，5%BSA 封閉1 h，一抗（1:1000 稀釋）4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL 發(fā)光液顯影，Image J 軟件分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值，根據(jù)相應(yīng)內(nèi)參的灰度值計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 20.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用+SD 表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟兒梨止咳化痰作用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，軟兒梨中已見報(bào)道的化學(xué)成分有51 個(gè)（表2），經(jīng)TCMSP、本草組鑒、ECTM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)282 個(gè)。GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中與咳嗽相關(guān)的基因有4425 個(gè)，與生痰有關(guān)的基因有1737 個(gè)，三者映射重疊基因有80 個(gè)（圖1a），軟兒梨止咳化痰作用成分-靶點(diǎn)-疾病映射圖見圖1b。將80 個(gè)交集基因提交至Metascape 數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，得到KEGG 通路富集（圖1c）和GO 功能富集（圖1d）結(jié)果，如圖可知，這80 個(gè)基因可能與細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶活性（Peroxidase activity）、抗氧化活性（Antioxidant activity）、氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity）、對(duì)活性氧的反應(yīng)（Response to reactive oxygen species）等生物過程有關(guān)，機(jī)制可能涉及TNF 信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路等。通過STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建軟兒梨止咳化痰作用靶點(diǎn)基因間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI 網(wǎng)絡(luò)）（圖1e）。利用Cytoscape 插件CytoHubba，根據(jù)Degree 值過濾出PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因（Top10基因）（圖1f），分別是：GAPDH、IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、JUN、CASP3、CXCL8、IL10、MAPK3。Top10 基因與軟兒梨中所含化學(xué)成分對(duì)應(yīng)關(guān)系如圖1g 所示。對(duì)Top10 基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，前20 條富集信號(hào)通路如圖1h 所示，其中12 條信號(hào)通路與細(xì)菌、病毒及寄生蟲感染有關(guān)（Pertussis、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、PathogenicEscherichia coliinfection、Chagas disease、Human cytomegalovirus infection、Yersinia infection、Leishmaniasis、Salmonellainfection、Amoebiasis、Malaria、Legionellosis、Hepatitis B），4 條信號(hào)通路與免疫相關(guān)疾病有關(guān)（IL-17 signaling pathway、C-type lectin receptor signaling pathway、Rheumatoid arthritis、Toll-like receptor signaling pathway）（見圖1i），提示軟兒梨可能主要通過消除炎癥感染、增加人體免疫力來(lái)發(fā)揮止咳化痰作用。

表2 軟兒梨化學(xué)成分表Table 2 Chemical composition table of Ruanerli

2.2 軟兒梨止咳化痰作用Top10 基因分子對(duì)接結(jié)果

分子對(duì)接結(jié)果顯示，軟兒梨止咳化痰作用Top10基因與PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前3 位的化學(xué)成分（咖啡酸、苦丁、戊醛）的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol（見圖2），說明受體與配體能夠自發(fā)結(jié)合，且具有較強(qiáng)的結(jié)合活性[15]，部分分子對(duì)接結(jié)果見圖3。

圖2 軟兒梨止咳化痰作用Top10 基因蛋白與Top3 活性成分結(jié)合能圖Fig.2 Binding energy graph of Top10 gene proteins for the antitussive and expectorant effects of Ruanerli and Top3 active components

2.3 軟兒梨對(duì)氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)的影響

氨水是一種刺激性較強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，動(dòng)物吸入氨水氣霧后，可刺激呼吸道感受器，引起咳嗽[13]。由表3 可知，經(jīng)氨水刺激后小鼠出現(xiàn)明顯咳嗽反應(yīng)。與空白組比較，軟兒梨組小鼠咳嗽次數(shù)顯著減少（P＜0.05），咳嗽潛伏期也有顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），且作用呈劑量依賴性，提示軟兒梨對(duì)氨水所致咳嗽有較好的抑制作用。

表3 軟兒梨對(duì)氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)的影響（n=10）Table 3 Effect of Ruanerli on cough response induced by ammonia in mice (n=10)

2.4 軟兒梨對(duì)小鼠呼吸道酚紅排泄的影響

酚紅是一種對(duì)人體無(wú)害的染料，經(jīng)腹腔注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)后可部分由呼吸道排泄，由祛痰作用的藥物在使支氣管分泌增加的同時(shí)，也使呼吸道黏膜的酚紅排泄量增加，因此可由呼吸道酚紅的排泄量間接推測(cè)藥物的祛痰作用。在本實(shí)驗(yàn)中，酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.81048X-0.05511，r2=0.97959。經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與空白組比較軟兒梨組酚紅排泄量顯著增加（P＜0.05），其呈顯著劑量依賴性（P＜0.05）（見表4），提示軟兒梨有促進(jìn)支氣管黏膜分泌（祛痰）的作用。

表4 軟兒梨對(duì)小鼠呼吸道酚紅排泄的影響Table 4 Effect of Ruanerli on phenol red excretion in respiratory tract of mice

2.5 軟兒梨對(duì)血清中炎癥因子水平的影響

IL-6 是一個(gè)26 kDa 的多肽，生物效應(yīng)極為廣泛，主要包括[16-18]：調(diào)節(jié)B 細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化；增強(qiáng)CTL、NK 細(xì)胞的殺傷效應(yīng)；刺激造血干細(xì)胞的增生分化；促進(jìn)肝細(xì)胞合成急性相蛋白等。大量實(shí)驗(yàn)資料表明，IL-6 在維持機(jī)體生理平衡中具有十分重要的地位，體內(nèi)IL-6 的異常與多種疾病有關(guān)。IL-13 是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化和炎癥反應(yīng)，在過敏、哮喘、肺纖維化和腫瘤發(fā)生中具有重要作用[19-21]。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)ELISA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氨水刺激后，小鼠血清中IL-6 和IL-13 的水平明顯升高，經(jīng)軟兒梨處理后IL-6 和IL-13 的水平顯著降低（P＜0.05），且作用呈顯著劑量依賴性（P＜0.05）（表5），提示軟兒梨可以降低血清中炎性介質(zhì)的水平。

表5 軟兒梨對(duì)小鼠血清中炎癥因子水平的影響（n=10）Table 5 Effect of Ruanerli on serum levels of inflammatory factors in mice (n=10)

2.6 軟兒梨對(duì)肺組織中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 mRNA 表達(dá)及蛋白表達(dá)的影響

IL1 是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，IL1B 是其一種存在形式。低濃度的IL-1 主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[22-23]，主要表現(xiàn)在：a.與抗原協(xié)同作用，使CD4+T細(xì)胞活化，增加IL-2R 表達(dá)；b.促進(jìn)B 細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，可使脾細(xì)胞的溶血空斑數(shù)（PFC）增加100 倍，說明IL-1 也可促進(jìn)抗體的形成；c.促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞等的抗原遞呈能力；d.與IL-2 或干擾素協(xié)同可以增強(qiáng)NK 細(xì)胞活性；e.吸引中性粒細(xì)胞，引起炎癥介質(zhì)釋放；f.可刺激多種不同的間質(zhì)細(xì)胞釋放蛋白分解酶并產(chǎn)生一些效應(yīng)等。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），又稱血管通透因子（Vascular permeability factor，VPF）是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用，其作用主要包括[24-25]：a.促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生。VEGF 是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原，在體外可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，在體內(nèi)可誘導(dǎo)血管增生。尤其是在低氧環(huán)境下，VEGF 與內(nèi)皮細(xì)胞膜上VEGF 受體結(jié)合，引起受體的自身磷酸化，從而激活有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK），實(shí)現(xiàn)VEGF的有絲分裂原特性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生；b.促進(jìn)血管增生。在低氧環(huán)境下，VEGF 通過提高血漿酶原活化因子（PA）和血漿酶原活化因子抑制因子-l（PAI-1）的mRNA 表達(dá)，來(lái)提高血漿酶原活化因子的活性，促進(jìn)細(xì)胞外蛋白水解，進(jìn)而促進(jìn)新生毛細(xì)血管的形成；c.增加血管通透性。VEGF 是最強(qiáng)的可增加血管通透性的物質(zhì)之一，該作用主要通過細(xì)胞小囊泡器來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其特點(diǎn)是作用迅速、持續(xù)時(shí)間短。

前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（Prostaglandinendoperoxide synthase 2，PTGS2），又名環(huán)加氧酶2，只存在于一些特殊的細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和傳遞疼痛及炎癥信號(hào)[26-27]。

絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一組能被不同的細(xì)胞外刺激，如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理/病理過程[28-29]。MAPK3 是這個(gè)激酶家族的一員，可作用于多個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，如增殖、分化和細(xì)胞周期進(jìn)程，以響應(yīng)各種細(xì)胞外信號(hào)[30-31]。

在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)RT-PCR 和Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氨水刺激后，空白組小鼠肺組織中炎癥相關(guān)基因（IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3）的mRNA水平和蛋白表達(dá)明顯增加，提示炎癥激活。軟兒梨中、高劑量組可顯著降低炎癥基因的mRNA水平和蛋白表達(dá)（P＜0.05），且作用呈顯著劑量依賴性（P＜0.05）（結(jié)果見表6、圖4～圖5），提示軟兒梨可能通過抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而降低血清中炎性介質(zhì)含量，發(fā)揮止咳化痰作用。

圖4 軟兒梨對(duì)肺組織中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 mRNA 表達(dá)的影響（n=10）Fig.4 Effect of Ruanerli on mRNA expression of IL6,IL1B,VEGFA,PTGS2 and MAPK3 in lung tissue (n=10)

圖5 軟兒梨對(duì)肺組織中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Ruanerli on expression of IL6,IL1B,VEGFA,PTGS2 and MAPK3 proteins in lung tissue

表6 軟兒梨對(duì)肺組織中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 蛋白表達(dá)的影響（n=10）Table 6 Effect of Ruanerli on protein expression of IL6,IL1B,VEGFA,PTGS2 and MAPK3 in lung tissue (n=10)

3 結(jié)論

通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)軟兒梨中已見報(bào)道的化學(xué)成分有51 個(gè)，對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)282 個(gè)。與GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中咳嗽和生痰相關(guān)基因映射后得到80 個(gè)軟兒梨止咳化痰作用的相關(guān)基因。富集分析發(fā)現(xiàn)這80 個(gè)基因可能與細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶活性、抗氧化活性、氧化還原酶活性、對(duì)活性氧的反應(yīng)等生物過程有關(guān)，機(jī)制可能涉及TNF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路等。根據(jù)Dgree 值，從PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選出了軟兒梨止咳化痰作用的Top10 基因（GAPDH、IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、JUN、CASP3、CXCL8、IL10、MAPK3）。通過對(duì)Top10 基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，在前20 條富集信號(hào)通路中12 條與細(xì)菌、病毒及寄生蟲感染有關(guān)，4 條與免疫相關(guān)疾病有關(guān)，提示軟兒梨可能主要通過消除炎癥感染、增加人體免疫力來(lái)發(fā)揮止咳化痰作用。分子對(duì)接結(jié)果顯示，軟兒梨止咳化痰作用Top10 基因與PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前3 位的化學(xué)成分（咖啡酸、蘆丁、戊醛）可以自由結(jié)合，且具有較小的結(jié)合能。動(dòng)物試驗(yàn)表明，軟兒梨可以明顯抑制小鼠氨水引發(fā)的咳嗽反應(yīng)，增加小鼠氣管酚紅的排泄量，降低血清中炎性介質(zhì)IL-6 和IL-13 水平；PCR 和WB 檢測(cè)結(jié)果顯示，軟兒梨可顯著降低炎癥相關(guān)基因IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3的mRNA 水平和蛋白表達(dá)，且作用與劑量成正比，這與生信分析結(jié)果相符，提示軟兒梨的止咳化痰作用可能與降低炎性基因表達(dá)，減少致炎因子釋放有關(guān)。由于客觀條件限制，本文未對(duì)軟兒梨止咳化痰作用做進(jìn)一步的研究，其中涉及的深層機(jī)制還需要更深入的探討。