孔凡旺,張志剛,李 偉,陳玉峰,王長江,鄭亞琴,徐 蒙,*

(1.臨沂大學 農(nóng)林科學學院, 山東 臨沂 276000; 2.鄒城市自然資源和規(guī)劃局, 山東 濟寧 273500)

4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate: CoA ligase, 4CL)作為苯丙氨酸代謝途徑中的關鍵分支酶之一,催化甲氧基或羥基肉桂酸衍生物轉(zhuǎn)化為相應的CoA硫酯[1-2]。4CL基因在1988年首次在歐芹(Petroselinumhortense)被克隆出來,隨后4CL在更多物種中得到系統(tǒng)的鑒定和研究[3]。研究表明,不同4CL家族成員分別參與木質(zhì)素、類黃酮等化合物的合成調(diào)控[4-7]。

桃(Prunus)風味獨特,鮮甜多汁,果實中的花青素顯著影響果實色澤和口感,是果實品質(zhì)的重要影響因素。類黃酮,尤其花青素,因其強大的抗氧化與抗病蟲害能力,也賦予果實較好的營養(yǎng)價值和抗逆能力[8]。桃果實在采后低溫貯藏過程中易遭受冷害,表現(xiàn)為果肉絮敗與木質(zhì)化等,嚴重影響果實品質(zhì)。4CL基因主要可分為兩個亞家族,其中第一亞家族成員參與木質(zhì)素合成,第二亞家族成員參與花青素等類黃酮物質(zhì)生物合成。擬南芥(Arabidopsisthaliana)4CL1和4CL2參與木質(zhì)素生物合成,4CL3參與類黃酮代謝[5]。丹參(Salviamiltiorrhiza)第一亞家族成員Sm4CL2主要參與木質(zhì)素的合成,第二亞家族成員Sm4CL3參與類黃酮生物合成[9]。石榴(Punicagranatum)Pg4CL5參與木質(zhì)素的合成,Pg4CL2參與類黃酮素的合成[4]。此外,第一亞家族4CL成員參與木質(zhì)素合成在模式植物楊樹(Populus)中被大量研究報道[10-12]。上述結果暗示,4CL在果實類黃酮合成和采后果肉冷害木質(zhì)化調(diào)控中可能發(fā)揮重要功能。目前4CL在毛竹(Phyllostachyspubescens)[13]和梨樹(Pyrusbretschneideri)[14]等越來越多的物種中引起關注,但桃中尚未得到系統(tǒng)的鑒定和研究。

本研究基于桃基因組數(shù)據(jù)庫鑒定4CL基因家族成員,從基因家族進化樹的角度分析桃4CL基因家族的結構與功能;以發(fā)育階段的不同品種光核桃(Prunusmira)果實和采后貯藏的北京9號(Prunuspersica)桃果實為研究材料,結合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析其在果實類黃酮合成及采后冷害調(diào)控中的功能。本工作不僅為研究桃果實發(fā)育過程中 4CL的作用機制提供理論依據(jù),而且為研究桃采后低溫貯藏過程中4CL的調(diào)控作用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

光核桃的桃果實采集自西藏自治區(qū)林芝市,野生和半野生的品種表現(xiàn)為不同果肉顏色。紅肉和黃肉品種為野生種,白肉品種為半野生種。采集硬核期(花后60 d)、細胞膨大期(花后85 d)和成熟期(花后95 d)果肉組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析,相關轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載自NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(SRP174461)[26]。

采后貯藏試驗所用材料為北京9號桃品種,采集自山東省臨沂市蒙陰縣。果實采收后,選擇無機械傷、成熟度和大小一致的果實運往實驗室進行 0 ℃和 LTC 處理。LTC處理具體方法參照Wang等[15],預貯藏調(diào)整為10 ℃,5 d。

1.2 4CL基因家族鑒定

在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=peach)中下載桃基因組數(shù)據(jù)(assembly Prunus_persica_NCBIv2),使用TBtools軟件Gff3 sequence extract插件提取基因序列,使用ORF prediction插件將DNA序列翻譯成蛋白序列。所得蛋白序列與擬南芥和水稻進行BLAST (Expection value: 0.001),所得候選基因使用HEMMER SCAN (https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)再次確認。

1.3 4CL蛋白理化性質(zhì)與基因進化樹分析

4CL蛋白序列基本理化性質(zhì)使用 Expasy在線網(wǎng)站(http://web.expasy.org/protparam/)分析。從 TAIR 數(shù)據(jù)庫(https:www.arabidopsis.org/)下載擬南芥4CL蛋白質(zhì)序列。擬南芥和桃4CL蛋白序列使用MEGA X軟件進行聚類,使用在線軟件EVOLVIEW (https://evolgenius.info//evolview-v2/#mytrees)進行可視化。

1.4 不同種類光核桃發(fā)育階段的基因表達分析

黃肉、紅肉和白肉品種光核桃轉(zhuǎn)錄組下載自NCBI SRA數(shù)據(jù)庫[26],使用Trimmomatic軟件去掉接頭信息,以桃作為參考基因組利用Kalliso軟件得到基因表達數(shù)據(jù)。

1.5 4CL啟動子順式作用元件分析

利用桃基因組提取4CL基因編碼區(qū)起始密碼子上游2 000 bp的啟動子序列,通過PlantCARE網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測啟動子中的各類順式作用元件,使用TBtools進行可視化。

1.6 4CL共線性和保守基序分析

共線性分析及其可視化使用TBtools 軟件One Step MCScanX-Super Fast插件。使用MEME網(wǎng)站(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)分析4CL基因保守基序,使用TBtools 軟件Gene Structure View插件進行可視化。

1.7 4CL基因表達驗證

基因表達驗證所用材料為蒙陰蜜桃北京9號桃品種,使用全式金逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成。利用Primer3網(wǎng)站(http://primer3.ut.ee/)設計4CL和內(nèi)參特異性引物后送往擎科生物有限公司合成(表1)。

表1 qRT-PCR基因表達引物序列

2 結果與分析

2.1 桃4CL基因家族成員鑒定與染色體分布

基于桃基因組數(shù)據(jù)庫,鑒定到21個4CL家族成員,其中Pp4CL15和Pp4CL16、Pp4CL20和Pp4CL21為串聯(lián)重復基因,分布在1號和8號染色體上。Pp4CL7和Pp4CL8、Pp4CL10和Pp4CL11分別為片段復制基因。1號染色體上包含數(shù)量最多的4CL,第2、3和4號染色體上4CL數(shù)量最少(圖1)。大多數(shù)桃4CL蛋白氨基酸數(shù)量在550左右,其中Pp4CL15與Pp4CL16氨基酸數(shù)量最多,Pp4CL19 氨基酸數(shù)量最少。Pp4CL3、Pp4CL7、Pp4CL10-Pp4CL13、Pp4CL15、Pp4CL16與Pp4CL19蛋白不穩(wěn)定系數(shù)大于40,處于不穩(wěn)定狀態(tài)(表2)。

2.2 桃4CL基因家族成員基因結構與蛋白保守基序

為進一步分析桃4CL的基因結構特征,基于桃基因組數(shù)據(jù)庫基因注釋信息,提取Pp4CL的內(nèi)含子、外顯子等信息,利用MEME在線軟件分析4CL蛋白保守基序。結果表明,Pp4CL1-Pp4CL4和Pp4CL6-Pp4CL13包含數(shù)量最多的保守基序,序列上保守性最高,Pp4CL19-Pp4C21保守基序的數(shù)量最少;基序特征相似的4CL具有近似的內(nèi)含子與外顯子組成。除Pp4CL19-Pp4C21,其他桃4CL均至少含有包括基序1和基序4在內(nèi)的4種以上保守基序(圖2)?；?由GELWVRG組成,基序4由SSGTTGLPKGV組成,均為AMP保守結構域(AMP-binding domain),為催化功能必要的結構域(圖3)。

圖2 桃4CL基因家族成員保守結構域分析與基因結構

圖3 桃4CL基因家族成員的保守基序

2.3 桃4CL基因家族成員啟動子的順式作用元件

Pp4CL啟動子順式作用元件分析結果表明,Pp4CL基因含有大量的非生物脅迫響應以及激素響應元件(圖4)。Pp4CL2、Pp4CL3、Pp4CL8、Pp4CL13、Pp4CL17和Pp4CL19啟動子上含有低溫響應元件。除Pp4CL5、Pp4CL6、Pp4CL9、Pp4CL17,其余4CL均含有多個MeJA響應元件。19個Pp4CL基因含有大量厭氧誘導響應元件,尤其是Pp4CL9含有5個厭氧誘導響應元件。

圖4 桃4CL基因家族成員啟動子的順式作用元件

2.4 桃4CL基因家族成員與楊樹和擬南芥共線性

由于4CL相關研究主要集中于模式植物楊樹、擬南芥和水稻等物種,選擇桃、楊樹與擬南芥4CL基因家族成員進行共線性分析。結果表明,楊樹與桃4CL有19對共線性基因,主要集中在桃第1、5號染色體上,擬南芥與桃4CL共有5對,主要集中在桃1號染色體上。其中Pp4CL5、Pp4CL6、Pp4CL10、Pp4CL11、Pp4CL13、Pp4CL15、Pp4CL16、Pp4CL17、Pp4CL18、Pp4CL19與楊樹和擬南芥4CL均存在共線性(圖5)。該結果暗示上述Pp4CL在遺傳進化中更為保守,或具有重要功能。

圖5 桃、楊樹和擬南芥4CL基因家族成員共線性分析

2.5 桃與其他物種4CL遺傳進化

將桃與枇杷(Eriobotryajaponica)、楊樹(Populus)、水稻(OryzasativaL.)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、丹參(Salviamiltiorrhiza)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)4CL基因家族成員進行遺傳進化分析。結果表明,桃4CL家族成員可分為兩類,Pp4CL1與Pp4CL2屬于第一亞家族(Group1),Pp4CL3-Pp4CL21屬于第二亞家族(Group2)。Pp4CL1與Sa4CL2、Pog4CL1、Egl4CL聚類在一起,Pp4CL2與Ej4CL1、Af4CL聚類在一起,Pp4CL5與At4CL3、Sm4CL3聚類在一起(圖6)。

圖6 桃4CL基因家族成員遺傳進化分析

2.6 黃肉、白肉和紅肉光核桃果實4CL基因家族成員發(fā)育階段基因表達

光核桃為薔薇科桃屬植物,因其果核光滑得名,為桃子現(xiàn)存最古老的祖先。因其豐富的遺傳多樣性和多樣的果肉顏色,在果實發(fā)育階段的果實著色研究中具有一定價值。為明確4CL家族成員在桃果肉發(fā)育階段中的潛在功能,對黃肉、白肉和紅肉光核桃果實發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行4CL家族成員基因表達模式分析。如圖7所示,隨著果實生長發(fā)育,Pp4CL1、Pp4CL8、Pp4CL13在紅肉果實中的基因表達總體呈上升趨勢,表達量為紅肉品種最高,黃肉和白肉品種較低;Pp4CL3、Pp4CL12、Pp4CL20、Pp4CL21在紅肉果實發(fā)育階段中的基因表達表現(xiàn)為先升高后降低,且總體在黃肉品種中的表達水平高于紅肉品種,在白肉品種中表達始終維持在較低水平。

PH,硬核期;CE,細胞增大期;FR,果實成熟期。

2.7 桃4CL基因家族成員在采后低溫和LTC處理中的表達

研究表明,桃果實采后低溫貯藏易受冷害,LTC處理可以減緩冷害發(fā)生[11]。為明確桃4CL基因家族成員在采后低溫和LTC處理中的潛在功能,結合桃采后低溫貯藏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對其進行基因表達模式分析。如圖8所示,Pp4CL1、Pp4CL5、Pp4CL8、Pp4CL10、Pp4CL12、Pp4CL13、Pp4CL14和Pp4CL20受低溫誘導表達上調(diào),Pp4CL2、Pp4CL3、Pp4CL7、Pp4CL11、Pp4CL15和Pp4CL17受低溫誘導表達下調(diào),Pp4CL2、Pp4CL3在果肉組織中不表達。與低溫處理相比,LTC處理可進一步提高Pp4CL8、Pp4CL10、Pp4CL14基因表達水平。為了驗證該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性,我們選擇上述3個候選4CL進行實時熒光定量分析。如圖9所示,RNA-Seq與qRT-PCR中Pp4CL8、Pp4CL10和Pp4CL14的表達趨勢具有較強的一致性,表明該轉(zhuǎn)錄組的表達數(shù)據(jù)是可靠的。因此,我們推測桃果實采后低溫貯藏過程中,Pp4CL8、Pp4CL10和Pp4CL14可響應LTC處理,通過促進類黃酮合成減緩桃果實采后冷害。

圖8 4CL基因家族成員在采后低溫和LTC處理中的表達模式

圖9 qRT-PCR驗證候選4CL基因在采后0 ℃(A)和LTC(B)處理中的相對表達水平

3 討論

枇杷和竹筍等物種中的研究表明,植物遭受冷害誘導木質(zhì)素沉積以提高植物抗逆能力[16-17]。周慧娟等[18]研究發(fā)現(xiàn),桃果實采后低溫易發(fā)生冷害,表現(xiàn)為果肉木質(zhì)化和絮敗化現(xiàn)象,嚴重影響果實品質(zhì)。桃Pp4CL1和Pp4CL2分別與藍桉Egl4CL和枇杷Ej4CL1聚類在一起。有研究表明,藍桉Egl4CL在次生木質(zhì)部組織的木質(zhì)化中發(fā)揮功能[19-20],枇杷Ej4CL1在果實的冷害木質(zhì)化中發(fā)揮功能[16]。我們的結果表明,低溫誘導第一亞家族成員Pp4CL2表達上調(diào),推測其可能通過加速果肉木質(zhì)素積累,誘導果實發(fā)生冷害木質(zhì)化。

果實色澤是影響桃商業(yè)價值的重要因素之一,一定程度上決定了顧客的選擇和營養(yǎng)價值。桃果實色素積累主要與花青素和類胡蘿卜素相關,紅肉桃果實花青素含量最高;黃肉果實的花青素含量中等,其黃色主要與類胡蘿卜素的積累相關;白肉果實中花青素與類胡蘿卜素含量均較低而呈現(xiàn)乳白色[21-24]。紅肉桃果實花青素主要為矢車菊素-3-葡萄糖苷及矢車菊素-3-蕓香糖苷,白肉和黃肉品種僅在果皮近核部位有少量花青素[25]。Ying等[26]對不同果肉顏色的光核桃果肉轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn),矢車菊素-3-蕓香糖苷在紅肉果實中的積累量遠超黃肉和白肉品種;矢車菊素-3-葡萄糖苷在紅肉桃品種中大量積累,而在白肉和黃肉桃品種中只能檢測到極微量存在。對其基因表達分析發(fā)現(xiàn),Pp4CL8、Pp4CL13基因在紅肉品種中表達最高,黃肉和白肉桃品種中表達量較低。根據(jù)桃果實生長發(fā)育進程,可分為幼果膨大期、硬核期、果實迅速生長(細胞增大)與果實成熟期,不同桃品種花青素的積累差異主要在生長發(fā)育后期[27-28]。Pp4CL8、Pp4CL13在紅肉光核桃細胞增大期和成熟期的表達水平明顯高于硬核期,總體表達呈上升趨勢。此外,第二亞家族Pp4CL5-Pp4CL21與類黃酮合成基因Os4CL2和At4CL3聚類在一起[5,29],表明其可能參與桃果實花青素等類黃酮合成。因此,推測Pp4CL8、Pp4CL13參與桃果實花青素等類黃酮的合成調(diào)控。

植物遭受冷害后誘導細胞內(nèi)活性氧(ROS)大量積累和果肉褐變,引起脂質(zhì)過氧化和DNA損傷[29-31]。類黃酮等抗氧化物質(zhì)可通過清除過量ROS,從而減輕植物冷害癥狀[32]。研究表明,植物4CL廣泛響應非生物脅迫參與類黃酮等生理進程調(diào)控[33-35]。桃4CL基因家族成員啟動子中發(fā)現(xiàn)了大量的低溫等非生物脅迫響應元件,推斷其在桃果實抗冷害中起到一定的調(diào)控作用。第二亞家族成員Pp4CL8、Pp4CL10和Pp4CL14在低溫處理后表達量上調(diào),暗示上述基因可能通過加速類黃酮物質(zhì)合成清除過量ROS。Wang等[15]研究表明,桃果實采后低溫易發(fā)生冷害,LTC處理可減緩果實采后低溫貯藏引起的冷害。LTC處理后Pp4CL8、Pp4CL10和Pp4CL14基因表達進一步上調(diào),產(chǎn)生更多的抗氧化物質(zhì)類黃酮,以提高對ROS的清除能力。前期研究表明,MeJA處理能夠顯著抑制枇杷、枸杞和桃等果實的冷害現(xiàn)象[36-38]。有趣的是,大部分桃4CL基因家族成員啟動子上也均發(fā)現(xiàn)MeJA響應元件,該結果暗示4CL或也可響應MeJA處理通過調(diào)控類黃酮合成以減輕桃果實冷害。

綜上,本研究對桃4CL基因家族成員進行了全基因組的鑒定,共鑒定到21個家族成員。不同品種光核桃的發(fā)育階段4CL基因表達模式及其基因進化樹分析表明,Pp4CL8和Pp4CL13可能參與桃果肉類黃酮合成。其在采后低溫貯藏中的表達分析推測,Pp4CL2受采后低溫誘導加速果肉冷害木質(zhì)化,Pp4CL8、Pp4CL10和Pp4CL14可響應LTC處理加速類黃酮合成以減緩桃果實采后冷害。