林金鉤 林蓉

摘要：采集受草銨膦污染的香蕉園土壤，通過富集培養(yǎng)技術(shù)獲得以草銨膦為唯一碳源生長的微生物C6菌株。結(jié)果表明，C6菌株對草銨膦降解率高達(dá)69.01%；通過觀察C6菌株的形態(tài)學(xué)特征結(jié)合16S rRNA序列分析，初步鑒定C6菌株為戴爾福特菌屬（Delftiasp.）；進(jìn)一步探討培養(yǎng)基體積、氮源、草銨膦初始濃度、培養(yǎng)基初始pH 值、培養(yǎng)溫度、菌懸液接種量、Na+濃度和Mg2+濃度等因素對C6菌株生長的影響。結(jié)果顯示，C6菌株最適宜的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)基體積為 75 mL、氮源為硫酸銨、草銨膦初始濃度 200 mg·L-1、初始 pH 值8.5、培養(yǎng)溫度 25℃、接種量 15%、 Na+濃度20 g·L -1、Mg2+濃度100 mg·L-1。本研究結(jié)果為利用微生物對草銨膦污染土壤進(jìn)行原位生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：草銨膦；降解菌；戴爾福特菌菌株；生長特性

中圖分類號：S482.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2095-5774（2023）01-0030-07

Isolation，Identification and Growth Characteristics of a Glufosinate

Ammonium-degrading Bacterial Strain

Lin Jingou，Lin Rong

（Xiamen Environmental Monitoring Central Station，Xiamen，F(xiàn)ujian 361000，China）

Abstract： The microbial strain C6 growing with glyphosate as the only carbon source was obtained from soil of banana orchard contaminated by glyphosate through enrichment culture technology. The results showed that the degradation rate of glyphosate by strain C6 reached 69.01%. Combined with the morphological characteristics of strain C6 and 16SrRNA sequence analysis，strain C6 was preliminarily identified as Delftia sp. The effects of medium volume，nitrogen source，initial concentration of glyphosate，initial pH value of medium，culture temperature，inoculation amount of bacterial suspension，sodium and magnesium ion concentration on the growth of strain C6 were further discussed. The results showed that the optimum growth conditions were 75 mL medium，ammonium nitrate as nitrogen source，200 mg·L-1 as initial concentration of glyphosate，medium at pH 8.5，temperature at 25 ℃，15% bacterial suspension for inoculation，20 g·L -1 sodium ion，and 100 mg·L -1 magnesium ion. The results provide a theoretical basis for the in situ bioremediation of the soil contaminated by glyphosate using microorganism.

Key words： Glyphosate；Degrading bacteria；Delftia sp. Strain；Growth characteristics

草銨膦（Glufosinate ammonium）又稱草丁膦，化學(xué)名為4-［羥基（甲基）膦?；?DL-高丙氨酸，化學(xué)式為C5H15N2O4P，是一種廣譜型除草劑，具低毒、活性高和環(huán)境相容性好等特點［1］。草銨膦通過與植物體中的ATP相結(jié)合并占據(jù)谷氨酰胺合成酶（glutamine aynthetase，GS）的反應(yīng)位點，在植物氮代謝過程中阻礙谷氨酸與銨離子合成谷氨酰胺的途徑并隨之破壞其后的代謝過程［2］。主要劑型為溶液劑（水劑），由于其殺草譜廣、發(fā)揮活性作用速度較快，廣泛應(yīng)用于果園、馬鈴薯以及非耕地等田間雜草的治理。

目前因一系列高毒性除草劑（百草枯、草甘膦等）的禁用，以及農(nóng)用除草劑的市場高需求，草銨膦作為低毒、高活性的廣譜除草劑，其生產(chǎn)量和使用量均居世界前列［3］。隨著使用量的增加，且具有較強(qiáng)的水溶性，容易污染水源并進(jìn)一步在食物鏈中富集，對環(huán)境和人體健康產(chǎn)生潛在威脅［4］，有效降低這些威脅成為目前迫切需要解決的問題。微生物降解是農(nóng)藥殘留被降解轉(zhuǎn)換的主要途徑之一［5］，具有適用范圍廣泛、代謝方式多樣且相較于物理、化學(xué)降解更安全、綠色和有效，因此研究和應(yīng)用的前景十分廣闊?，F(xiàn)階段國內(nèi)外關(guān)于草銨膦的研究主要集中在作用機(jī)理［2］以及在不同環(huán)境中的行為［1，6，7］、毒性［8，9］等方面，而對草銨膦的降解菌株及相關(guān)降解菌株的生長特性方面的研究尚少。本研究旨在從受草銨膦污染的香蕉果園土壤中分離、篩選可降解草銨膦的微生物菌株，并對草銨膦降解菌株的生長特性進(jìn)行研究，以期為草銨膦微生物降解的深入研究和草銨膦降解菌的產(chǎn)業(yè)化利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試土壤

福建省漳州市長泰縣常年施用草銨膦的香蕉園，拔除土壤表層雜草和其它雜物后取0～15 cm土樣，迅速取回，置于4℃冰箱保存。

1.1.2培養(yǎng)基

以草銨膦為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，每1 L蒸餾水中組分構(gòu)成為MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4·3H2O 1.31 g、FeSO4·7H2O 0.018 g、NaNO3 3.0 g 。外加草銨膦用于培養(yǎng)和分離草銨膦降解菌株。LB培養(yǎng)基為10.0 g蛋白胨、5.0 g酵母粉、NaCl 5.0 g。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基為牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、瓊脂18.0 g、蒸餾水1 L，pH值 7.0～7.2。

1.1.3草銨膦

草銨膦標(biāo)準(zhǔn)品（阿拉丁/G114499-100 mg），購自阿拉丁官網(wǎng)。

1.1.4主要儀器

電子天平（奧豪斯/AR224CN）、超凈工作臺（蘇州安泰/SW-CJ-2FD）、臺式高速離心機(jī)（上海安亭/TGL-16C）、立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安/LDZM-80L）、基礎(chǔ)型超純水系統(tǒng)（上海澤拉布/Dura 12FV）、振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚/ZQZY-75CN）、生化培養(yǎng)箱（寧波賽福/SPX-250）、pH計（上海儀電/PHS-3C）、超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（安捷倫/1290-6545）、光學(xué)顯微鏡（Ci-L，日本）。

1.2 草銨膦降解菌株的富集和分離純化

降解菌株的分離純化在參考吳紅萍等［10］方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)改良。取10 g土壤加入含有100 mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，外加草銨膦50 mg·mL-1，在生化培養(yǎng)箱中以30℃恒溫、150 r·min-1的培養(yǎng)條件培養(yǎng)3 d。取10 mL上層懸浮液加入到100 mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，相同條件繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)上述培養(yǎng)操作至草銨膦濃度為300 mg·mL-1，在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3個周期。待培養(yǎng)周期結(jié)束后，梯度稀釋樣液，并吸取100μg稀釋液涂布于改良高氏一號培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，分別在30℃和37℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)1～7 d。待菌落長出后，進(jìn)行觀察，用接種環(huán)在分離較好且菌落形態(tài)不同的單一菌落上沾取少量菌體放入液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行平板劃線，恒溫培養(yǎng)結(jié)束后放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3高效降解菌株的篩選

菌株接種到液體培養(yǎng)基中制備懸浮菌液，于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，以10%接菌量接種到100 mL含300 mg·L-1草銨膦基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，再于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1個周期。培養(yǎng)結(jié)束后，吸取2 mL于2.5 mL具塞離心管中，置于臺式高速離心機(jī)中，以10 000 r·min-1離心10 min，通過0.22μm超濾膜過濾上清液1～1.5 mL到樣品管中，用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜儀測定，另設(shè)置未添加微生物降解菌株的草銨膦標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為對照組，計算菌株的降解率（％）=（C0- Ct）／C0×100％，式中C0為草銨膦初始濃度，Ct為不同菌株降解作用下草銨膦的濃度。

1.4草銨膦降解菌株的形態(tài)與分子鑒定

采用平板涂布法將篩選后的草銨膦降解菌株，在生化培養(yǎng)箱中 30 ℃培養(yǎng) 12～48 h。參照《常見細(xì)菌鑒定手冊》等［11，12］對降解菌株的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀察。

進(jìn)一步采用通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和 1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACCCTT-3）［13］擴(kuò)增菌株序列，并送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將所得基因序列在 NBCI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLAST 同源性比對分析，選取同源性較高的菌株序列，采用 MEGA7.0 軟件的鄰接法 （Neighbor-Joining method）構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5草銨膦降解菌株的生長因素優(yōu)化

草銨膦降解菌株生長因子優(yōu)化采用Liu等［14］方法。將降解菌株接種在 50 mL的LB 液體培養(yǎng)基（pH 值7.0）中，在30℃、150 r·min-1的振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng) 18～24 h（OD600=0.30），再按 5%（V/V）的量接種于基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，初始 pH值為 7.0，初始草銨膦濃度為 50 mg·L-1、溫度為 30 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，分別進(jìn)行以下幾組處理測定生長量的變化，每種因素設(shè) 3 個重復(fù)試驗，以接種滅活的菌株為對照組，24 h 后取樣測定菌株生長量變化。

設(shè)培養(yǎng)基體積分別為 25、50、75、100、150、200 mL；設(shè)氮源分別為 硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉；設(shè)草銨膦初始濃度分別為10、50、100、200、300、400、500 mg·L-1；用 NaOH 或 HCl 調(diào)節(jié)初始 pH 值分別至 4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、 8.0、8.5、9.0、10.0；設(shè)培養(yǎng)溫度分別為 20、25、30、35、40、45℃；設(shè)接種量分別為 5%、10%、15%、20%、25%；將菌懸液按 5%接種量接入含有草銨膦降解培養(yǎng)基的錐形瓶中，調(diào)節(jié)初始 pH值7.0、7.5，在 30℃、150 r·min-1 條件下分別加入5、10、20、30、50、100 g·L-1氯化鈉培養(yǎng) 1 d 后測定草銨膦降解率，重復(fù)3 次，確定最適 Na+濃度。同樣設(shè)置 Mg2+濃度分別為50、100、200、300、400 mg·L-1。

2 結(jié)果與分析

2.1降解菌株的篩選與分離鑒定

從草銨膦污染的土壤中取樣，經(jīng)過兩次稀釋涂布和初步的富集培養(yǎng)，分離純化得到1個草銨膦降解菌株，命名為C6。形態(tài)觀察結(jié)果（圖1）顯示，C6菌株菌落為光滑圓形，乳白色，直徑約為1.0 mm，邊緣整齊不透明；在100倍顯微鏡下觀察為透明，長桿狀。

以C6菌株基因組DNA為模板、27F/1492R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度約為1.5 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast同源比對分析，結(jié)果表明C6菌株與Delftiasp.的基因同源性最高，達(dá)96％以上。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，C6與戴爾福特菌屬 （Delftiasp.）聚在一起。綜合菌落特征與16S rDNA基因序列，初步認(rèn)定C6菌株為戴爾福特菌屬菌株（圖2）。

2.2 C6菌株對草銨膦的降解情況

C6菌株在接種量10%、含300 mg·L-1的草銨膦培養(yǎng)基中，30℃、150 r·min-1的條件下振蕩3 d，經(jīng)超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜儀測定，C6菌株對草銨膦的降解率高達(dá)69.01%。

2.3培養(yǎng)基體積與氮源對C6菌株生長的影響

不同培養(yǎng)基體積影響C6菌株的生長，如圖3A所示，在25～200 mL的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，C6菌株均能正常生長；在25～75 mL范圍內(nèi)，C6菌株的生長呈快速上升趨勢，且體積為75 mL時，OD值達(dá)到最大，為0.136；當(dāng)體積大于75 mL時，隨著基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基體積的增大，OD值呈下降趨勢，至200 mL時降至最低。

不同氮源培養(yǎng)基對C6菌株生長的影響如圖3B所示，C6菌株分別在100 mg·L-1的硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨和硫酸銨為唯一氮源的培養(yǎng)基中均可以生長，但菌株的生長情況因氮源種類的不同而有差異。當(dāng)?shù)词橇蛩徜@時，C6菌株的生長處于最佳狀態(tài)，OD值最大；其次是硝酸銨，而在以硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基中，生長最差。

2.4草銨膦初始濃度與培養(yǎng)基初始pH值對C6菌株生長的影響

草銨膦初始濃度對C6菌株的影響如圖4A所示，培養(yǎng)基中草銨膦濃度在10～200 mg·L-1的范圍內(nèi)，降解菌株C6的生長速度隨濃度的增加而提高，在200 mg·L-1時達(dá)到最大值；當(dāng)草銨膦初始濃度大于200 mg·L-1時，C6菌株的生長量隨著草銨膦初始濃度的增加而降低。

培養(yǎng)基初始pH值對C6菌株的生長影響如圖4B所示，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值在4.0～8.5間，C6菌株的生長隨著pH值的升高而升高；pH值為8.5時最有利于C6菌株的生長；當(dāng)pH值大于8.5時，C6菌株的生長量快速下降。結(jié)果表明，過酸或過堿的培養(yǎng)基不適宜C6菌株的生長。

2.5 培養(yǎng)溫度與菌懸液接種量對C6菌株生長的影響

C6菌株在20～45℃的范圍內(nèi)均可生長，但不同溫度下生長速度有明顯差異（圖5A）。培養(yǎng)基溫度為20～25℃時，C6菌株的生長隨著溫度升高而增加，25℃時達(dá)到最大值，為 0.155；當(dāng)溫度大于25℃時，C6菌株的生長明顯下降，表明C6菌株生長的最適溫度為25℃。

在一定范圍內(nèi)，接種量的增加可以加快C6菌株的生長速率，縮短延滯期（圖5B）。當(dāng)接種量超過15%時，C6菌株的生長下降，表明C6菌株的適宜菌株接種量為15％。

2.6 Na+與Mg2+濃度對C6菌株生長的影響

C6菌株在Na+濃度為5～100 g·L-1的培養(yǎng)基中均可以生長，但生長速度有明顯不同（圖6A）。在50 g·L-1氯化鈉培養(yǎng)基中，C6菌株生長最差，在20 g·L-1氯化鈉培養(yǎng)基中生長最好。

C6菌株在Mg2+濃度為50～400 mg·L-1的培養(yǎng)基中均可以生長，但稍有差異（圖6B）。其中，菌株C6在200 mg·L-1氯化鎂培養(yǎng)基中的生長最差，在100 mg·L-1氯化鎂培養(yǎng)基中的生長最好。

3討論

本文從長期噴灑草銨膦的香蕉果園土壤中分離出1株微生物降解菌C6菌株，經(jīng)過純化鑒定，確定其屬于戴爾福特菌屬 。已有研究表明，戴爾福特菌屬在生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域的降解優(yōu)勢，如田爽等［15］從長期受農(nóng)藥苯磺隆污染的土壤中篩選鑒定1株降解菌株B2 ，B2 與多株戴爾福特菌屬細(xì)菌的 16S rDNA 序列同源性達(dá) 99%；陳思雨等［16］從白洋淀重金屬污染土壤中獲得10個戴爾福特菌屬菌株，對高濃度Pb２+和Cr（Ⅵ）具有明顯抗性；趙曉燕等［17］發(fā)現(xiàn)一株辛硫磷降解菌株戴爾福特菌D39，進(jìn)一步分析機(jī)理證明降解活性部位主要是胞內(nèi)酶。廖家龍等［18］從活性污泥中發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)淬滅高效菌株，其中戴爾福特菌株JL5能夠在10 h內(nèi)完全降解 N-己酰高絲氨酸內(nèi)酯。

目前尚未見對降解草銨膦菌株的相關(guān)報道，本文首次從草銨膦污染土壤中分離出戴爾福特菌，對未來除草劑的生物降解提供了新的微生物資源。同時，試驗得出C6菌株培養(yǎng)最適宜條件為：培養(yǎng)基體積為 75 mL、氮源為硫酸銨、草銨膦初始濃度 200 mg·L-1、初始 pH 值8.5、培養(yǎng)溫度 25 ℃、菌懸液接種量 15%、Na+濃度 20 g·L-1、Mg2+濃度為 100 mg·L-1。

與此同時，本文所篩選出來的C6菌株是在特定的生長環(huán)境（香蕉園）中培養(yǎng)的結(jié)果，而根據(jù)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，單一品種的農(nóng)藥不再能滿足生產(chǎn)的需求，往往在生產(chǎn)中會混合施用不同種類的農(nóng)藥，多種農(nóng)藥的混合施用會導(dǎo)致土壤中農(nóng)藥殘留部分的成分逐漸復(fù)雜，這也增加了微生物降解工作的挑戰(zhàn)性。因此C6菌株在復(fù)雜除草劑污染環(huán)境中的降解效率等方面需要進(jìn)一步的研究和探討。

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（責(zé)任編輯：馮新）