汪漢 路克寧

(1.成都市第三人民醫(yī)院心內(nèi)科,四川 成都 610031; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇 南京 210095)

孟德爾隨機化(Mendelian randomization,MR)正成為一種跨學(xué)科的因果推斷方法。它是一種利用與可改變的暴露相關(guān)的遺傳變異來評估其與被解釋變量的因果關(guān)系的方法[1]。在MR中,遺傳變體通常是單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP),這些SNP與潛在的暴露有密切聯(lián)系,但與傳統(tǒng)的觀察性研究中可能混雜的生活方式或社會經(jīng)濟因素?zé)o關(guān)。MR可提供較高水平的循證醫(yī)學(xué)證據(jù),雖然低于多中心、大樣本的隨機對照試驗和系統(tǒng)評價,但相較于后者更易實施且高效,另外,與傳統(tǒng)的觀察性研究相比,MR也不太可能受反向因果關(guān)系的影響,因此,MR對于判斷“暴露”和“結(jié)局”的因果關(guān)系意義重大[1-2]。

兩樣本MR在MR中最為常見,已廣泛應(yīng)用于心血管疾病的研究中。大量研究通過MR重新定義了傳統(tǒng)心血管疾病和其他可能的危險因素[3]。然而,目前已發(fā)表的MR中方法學(xué)介紹不全,部分研究存在一些缺陷,這使MR的可信度受到懷疑。更重要的是,與其他分析方法一樣,MR的可信度取決于假設(shè),因而評估這些假設(shè)的合理性尤為重要。

在目前的教學(xué)中,多數(shù)學(xué)生對MR的理解局限于跑程序,“程序為王”或“發(fā)文為王”的思想不在少數(shù)。如何深入理解MR,從而進一步轉(zhuǎn)化,在教學(xué)上值得深思熟慮?，F(xiàn)從MR的概念、基本要求與執(zhí)行、應(yīng)用于心血管疾病的現(xiàn)況、在心血管疾病教學(xué)中的學(xué)習(xí)應(yīng)用以及在教學(xué)中的困惑與思考方面進行闡述,以期為初入手MR的學(xué)生提供一定的參考。

1 MR的概念

MR是一種使用遺傳變異來估計“暴露”和“結(jié)局”之間因果關(guān)系的方法?！氨┞丁蓖ǔＶ溉魏慰赡苡绊懡Y(jié)果的危險因素,包括生物學(xué)指標(biāo)、實驗室數(shù)據(jù)或群體特征,而“結(jié)局”一般是疾病,但往往不限于疾病。

MR的核心是利用孟德爾自由組合規(guī)律,這一過程類似于隨機對照試驗中的隨機分組[1]。它主要用于確定變量的因果關(guān)系。確定因果關(guān)系對于制定干預(yù)措施極其重要,然而,由于反向因果關(guān)系、雙向因果關(guān)系以及混雜因素的干擾,這種關(guān)系常難以肯定。與隨機對照試驗類似,MR將等位基因隨機分離,其中,暴露組分配等位基因而對照組則無,進一步比較兩組的結(jié)局。

MR的優(yōu)勢很多,首先,“暴露”一般與行為、社會、心理等因素相關(guān),可能造成偏倚,但遺傳變異則不受混雜影響;其次,遺傳變異與其效應(yīng)的測量誤差較小;最后,近年來全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study,GWAS)相對容易獲取,這為判斷“暴露”和“結(jié)局”之間的因果關(guān)系提供了極大的便利。

2 MR的基本要求與執(zhí)行

MR在統(tǒng)計學(xué)上的本質(zhì)是利用工具變量來研究因果關(guān)系。最常見的兩種統(tǒng)計學(xué)模型是兩階段最小二乘法以及兩樣本MR。后者可利用兩個獨立的GWAS 的匯總統(tǒng)計量來計算“暴露”和“結(jié)局”的關(guān)聯(lián)比值。在兩樣本MR中,需要遵守關(guān)聯(lián)性、排他性以及獨立性假設(shè)等3個原則,即:遺傳變異必須與“暴露”因素強相關(guān);遺傳變異不能與“結(jié)局”直接相關(guān);遺傳變異不能與任何可能的混淆因素相關(guān)。這3個原則是MR的基石,同時也反映在MR的執(zhí)行流程中[3]。

兩樣本MR的基本流程如下:選取匯總數(shù)據(jù),確定工具變量,MR分析操作,進行敏感性和異質(zhì)性分析。操作非常簡單,但規(guī)范更重要。為此,STROBE-MR工作組[4]制訂了一個包含20個條目的MR研究報告規(guī)范清單,旨在幫助作者撰寫MR研究報告、協(xié)助編輯和同行評審人決定該論文可否發(fā)表,以及協(xié)助讀者評價已發(fā)表的MR論文,全文發(fā)表在2021年的JAMA雜志上,隨后該工作組也在BMJ雜志上提出MR寫作的規(guī)范解讀[5]。該規(guī)范清單包括題目和摘要部分(標(biāo)題和摘要)、引言部分(研究背景和目標(biāo))、方法部分(研究設(shè)計和數(shù)據(jù)來源、假設(shè)、統(tǒng)計學(xué)分析、假設(shè)的評估、敏感性分析和附加分析、軟件和預(yù)注冊)、結(jié)果部分(描述性分析、MR主要結(jié)果、對假設(shè)的評估、敏感性分析和附加分析)、討論部分(主要結(jié)果、局限性、解釋和普適性)、其他信息(資助、數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)共享、利益沖突)等六個部分。具體信息詳見網(wǎng)站(https://www.strobe-mr.org/)。

3 MR應(yīng)用于心血管疾病的現(xiàn)況

心血管疾病相關(guān)的GWAS較多,因此,MR廣泛應(yīng)用于心血管疾病領(lǐng)域。最近的研究[6]發(fā)現(xiàn):MR研究已證實了主要的心血管疾病危險因素(飲酒、吸煙、肥胖、高血壓、2型糖尿病、高脂血癥和炎癥)對動脈粥樣硬化性心血管疾病的影響,這些研究的結(jié)果與現(xiàn)有的隊列研究結(jié)果基本相同,同時也被進一步的隨機對照試驗所證實。多數(shù)研究主要是探索心血管疾病的危險因素,因此可以采用兩樣本MR進行,進一步的分析可采用中介MR、多變量MR以及貝葉斯模型操作。當(dāng)然,探討“暴露”與“結(jié)局”的遺傳多效性關(guān)聯(lián)還可以采用連鎖不平衡分?jǐn)?shù)回歸、基因共定位、基于匯總數(shù)據(jù)的MR等方法[3]。

在心血管領(lǐng)域,開發(fā)靶向藥物是一個熱門話題。如何尋找有效的分子靶標(biāo)是科學(xué)家們孜孜追求的重大問題。藥理學(xué)家們更喜歡通過研究作用機制,例如通過靶向受體或分子對接的方法來尋找藥物的靶蛋白。但常消耗了大量時間及金錢,卻只能找到一個無效的靶標(biāo)。由此,用于藥物開發(fā)與效應(yīng)預(yù)測的藥物MR應(yīng)運而生。它基于靶蛋白下游產(chǎn)物的生物標(biāo)志物,以靶蛋白編碼基因附近的對生物標(biāo)志物有顯著效應(yīng)的SNP(pQTL或eQTL)作為工具變量,以生物標(biāo)志物濃度作為暴露,以疾病作為結(jié)局進行MR,以驗證蛋白靶點對所研究疾病的影響[7]。目前,針對心血管疾病的藥物MR才剛剛起步,有極大的應(yīng)用前景。

總之,目前MR在心血管領(lǐng)域的應(yīng)用主要表現(xiàn)為探索疾病的因果關(guān)系、開發(fā)藥物靶點。此外,MR也可進一步探討遺傳多效性,這些可為進一步研究多種疾病的機制奠定基礎(chǔ)。

4 MR在心血管疾病教學(xué)中的學(xué)習(xí)應(yīng)用

部分學(xué)生在學(xué)習(xí)MR時,常會覺得既簡單又困難。簡單的是,MR只需在R軟件中不斷地點擊代碼,就可得出想要的數(shù)值和圖片,以此為基礎(chǔ),似乎就可以出不錯的文章了,所謂“一鍵成文”。另一部分同學(xué)可能覺得困難,原因在于MR的應(yīng)用軟件為R軟件,甚或使用Linux系統(tǒng),而這些語言的學(xué)習(xí)難以一蹴而就。那么,該如何引導(dǎo)學(xué)生進行學(xué)習(xí)呢?大體上需要把握三個關(guān)鍵環(huán)節(jié):(1)熟悉GWAS的基本概念以及MR的基本原理,這些可為操作、解釋MR提供便利。(2)明確MR中的一些基本概念,例如工具變量,弱工具變量偏倚、F值、效應(yīng)量,敏感性分析以及異質(zhì)性分析。(3)基本會操作R語言。目前關(guān)于兩樣本MR的編程語言較多,但主要還是以R語言為主,其他的Linux以及Python在進階分析中有更多的作用。

以2022年筆者發(fā)表的一篇文章[8]為例,在這項研究中,筆者使用兩樣本MR來揭示三甲胺N-氧化物(trimethylamine N-oxide,TMAO)及其前體(膽堿、甜菜堿和肉堿)對收縮壓/舒張壓的因果效應(yīng)。TMAO及其前體的匯總數(shù)據(jù)來自弗雷明漢心臟研究的2 076例歐洲參與者的人類代謝組匯總數(shù)據(jù)。血壓的數(shù)據(jù)來自于國際血壓全基因組協(xié)會研究聯(lián)盟。MR分析采用逆方差加權(quán)法、MR-Egger回歸、最大似然比、加權(quán)中位數(shù)、MR多效性殘差和異常值檢驗等方法。MR結(jié)果表明,TMAO增加1個單位與收縮壓增加相關(guān)(β=0.390,SE=0.720,P=0.201)。此外,筆者的研究結(jié)果還表明,肉堿增加1個單位與收縮壓增加相關(guān)(β=0.550,SE=0.750,P=0.390)。這一結(jié)果也得到了敏感性分析方法的證實。這項研究提供了TMAO及其前體與血壓因果關(guān)系的證據(jù),表明介導(dǎo)TMAO的產(chǎn)生可能有利于降低血壓。

該研究手稿提交后,同時有7個審稿人參與審稿。在提出的問題中,最關(guān)鍵的一點是選題的創(chuàng)新性和臨床的實用性,其余的大部分問題集中在方法學(xué)部分,主要表現(xiàn)在以下方面:(1)研究數(shù)據(jù)的基本特征。該部分常會被忽略,這要求研究者窮盡全文,回溯追查。(2)假設(shè)的評估。作者是否使用了足夠的MR統(tǒng)計學(xué)方法?比值比以及95%可信區(qū)間過大或過小如何解釋?弱工具變量偏倚如何處理?(3)基因的多效性如何解決?作者是否使用了最新的一些統(tǒng)計學(xué)方法解決基因多效性問題?(4)如何看待本文的局限性,包括但不限于數(shù)據(jù)的局限性、統(tǒng)計學(xué)的誤差。(5)對該數(shù)據(jù)進行驗證也是需要著重強調(diào)的問題。(6)其他的問題還表現(xiàn)在引文的準(zhǔn)確、圖表的精美以及書寫的邏輯完整等方面。

5 MR在教學(xué)中的困惑與思考

MR對于解構(gòu)疾病、開發(fā)藥物靶點有益,目前發(fā)文方興未艾。據(jù)統(tǒng)計,2022年已發(fā)表MR相關(guān)論文2 000余篇。然而,對臨床有指導(dǎo)意義的MR論文好像并不多見,推動臨床進展的研究更是少之又少,這似乎陷入了幾年前如火如荼的生物信息學(xué)分析的類似怪圈。

因此,客觀上,選擇一個好的題目尤為重要。很多學(xué)生都存在兩個誤導(dǎo)性的觀點:(1)無人做過的MR肯定可以發(fā)表;(2)陽性結(jié)果的MR肯定可以發(fā)表。然而,在實際中,文獻沒有認(rèn)真查閱而直接重復(fù)別人做過的MR不在少數(shù);另外,已有大量高質(zhì)量隨機對照試驗證實的結(jié)論也不宜重復(fù)進行MR研究。

此外,普通的教學(xué)形式可能難以滿足當(dāng)前的學(xué)習(xí)情況,大數(shù)據(jù)的實際場景操作可能更適合目前的教學(xué)形式。實際上,進行eQTL、基于匯總數(shù)據(jù)的MR方法或基因共定位等操作時,對電腦的要求會更高一些,普通配置的電腦可能難以滿足計算的要求,因此,云服務(wù)器可能是一個比較好的選擇。

在描述MR的局限性時常會陳述以下幾個方面:人群缺陷、樣本缺陷以及無法獲得原始數(shù)據(jù)從而進一步分析。盡管如此,以下幾個方面必須注意:(1)必須嚴(yán)格執(zhí)行MR研究的假設(shè)。MR中關(guān)聯(lián)性、排他性以及獨立性假設(shè)條件的執(zhí)行需嚴(yán)格而謹(jǐn)慎。在這個環(huán)節(jié)中,為了盡可能刪除回文SNP,避免混雜,需在Catalog和PhenoScanner中詳細(xì)查詢SNP位點。(2)樣本重疊似乎是一個難以解決的問題。部分學(xué)者認(rèn)為樣本量小的因素與樣本量大的因素的比值即是可能的最大樣本重疊率。也有人認(rèn)為樣本的來源、國別不同就說明兩樣本之間不存在樣本重疊率。然而,實際上,根據(jù)MR lap包計算兩樣本重疊率也是一個可行的方法[9]。(3)在MR中,結(jié)果往往較之于觀察性研究結(jié)果更好,因此對MR結(jié)果的解釋需更謹(jǐn)慎,因和果并不是一成不變的,隨著年齡、環(huán)境以及伴隨疾病的出現(xiàn),因和果的聯(lián)系也可能增強或者減弱[3]。另外,在觀察性研究中有意義的關(guān)聯(lián)也可能在MR中無意義,這與人群、樣本量、伴隨疾病以及基因多效性相關(guān)。此外,由于遺傳變異僅解釋了暴露變量方差的一小部分,因而可能無法從MR研究中推斷出臨床應(yīng)用的結(jié)果[2]。由于無法真正驗證所有的假設(shè),MR研究可用于判斷因果關(guān)系,但不能用于效應(yīng)量的外推。最后,MR作為檢驗“暴露”和“結(jié)局”是否有因果關(guān)系具有相當(dāng)大的優(yōu)勢,然而,當(dāng)使用MR反駁因果關(guān)系時,統(tǒng)計效能較低,可能需非常大的樣本量估計基因型-表型效應(yīng)的精確性。(4)在實際操作中,還有一個重要問題值得注意,即基因的遺傳多效性[10]。大牌雜志常會強調(diào)這個問題。常規(guī)的兩樣本MR一般依據(jù)常規(guī)的數(shù)學(xué)檢驗統(tǒng)計,然而,潛在的遺傳多效性位點常不可避免。目前有多個新的統(tǒng)計學(xué)方法對遺傳多效性進行檢測,如CAUSE(Causal Analysis Using Summary Effect estimates)等,然而,CAUSE卻經(jīng)常得出陰性結(jié)果。另外一個方法是剔除“暴露”和“結(jié)局”可能共享的遺傳多效性位點,然后再進行兩樣本MR計算,但后者在實際操作中也存在諸多問題。

總之,兩樣本MR在心血管領(lǐng)域的用途越來越廣,在教學(xué)中的疑難點也頗多。只有立足于對基礎(chǔ)知識的理解、基本操作的練習(xí)以及基本環(huán)節(jié)的剖析,才會熟練掌握這門強大的武器。