陳國(guó)強(qiáng)， 劉心怡， 劉 絮

（1. 清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084；2. 清華大學(xué) 合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心，北京 100084；3. 清華大學(xué) 化工系，北京 100084；4.北京微構(gòu)工廠生物技術(shù)有限公司，北京 101309）

聚羥基脂肪酸酯（PHA）是一系列微生物在過(guò)量碳源和有限的氮/磷源存在的不利生長(zhǎng)條件下，作為碳源、能量和還原力的存儲(chǔ)物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)合成和積累的微生物線性聚酯［1］。從100 余年前首次發(fā)現(xiàn)PHA開(kāi)始，目前已有超過(guò)150種不同單體、種類多樣的PHA 被發(fā)現(xiàn)［2］。 如聚3 - 羥基丁酸酯（polyhydroxybutyrate， PHB）、聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸共聚酯（poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate）， PHBV）、聚3-羥基丁酸-3-羥基己 酸 共 聚 酯（poly （3-hydroxybutyrate-3-hydroxyhexanoate）， PHBHHx）、聚3-羥基丁酸-4-羥基丁酸共聚酯（poly （3-hydroxybutyrate-4-hydroxybutyrate）， P34HB）等都是常見(jiàn)的PHA 材料。同時(shí)，合成生物學(xué)、基因編輯、代謝工程等技術(shù)的快速發(fā)展，進(jìn)一步擴(kuò)大了PHA的大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用前景［3］。近年來(lái)，通過(guò)基因工程改造微生物已經(jīng)可以獲得不同單體結(jié)構(gòu)、聚合模式以及相對(duì)分子質(zhì)量的定制PHA［4］。

PHA材料表現(xiàn)出十分優(yōu)越的材料性能，包括優(yōu)良的熱塑加工性、可調(diào)節(jié)的機(jī)械性能，以及在組織工程領(lǐng)域最值得關(guān)注的生物相容性和生物可降解性［5］。通過(guò)不同的物理、化學(xué)、生物修飾，如將PHA與其他生物基可降解高分子（如聚乳酸、透明質(zhì)酸、殼聚糖等）進(jìn)行共混，引入不同官能團(tuán)或新的功能性單體，都可以賦予PHA 新的性能，滿足不同的應(yīng)用場(chǎng)景［6-8］。PHA和聚乳酸（PLA）共混后，對(duì)其制備纖維材料的可紡性有較大的提升，便于加工成纖維狀的制品，用于醫(yī)療領(lǐng)域，如手術(shù)縫線等［5］。通過(guò)與透明質(zhì)酸的接枝，可以增強(qiáng)化合物的親水性，擴(kuò)展其在藥物遞送領(lǐng)域的應(yīng)用可能性［7］。與殼聚糖等其他材料的共混，可以獲得不同形貌和孔洞的支架，為細(xì)胞培養(yǎng)的研究提供了更多的選擇空間［8］。

最常見(jiàn)也是研究最廣泛的PHA——聚3-羥基丁酸酯（PHB）以及其他含有3-羥基丁酸（3HB）單元的共聚物還具有另一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)：該類聚合物的降解產(chǎn)物3HB 具有多種生物活性功能。3HB 是哺乳動(dòng)物酮體的重要組成部分，能夠在極端條件下（如長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)、饑餓等）為機(jī)體提供能量［9］。更重要的是，許多研究表明3HB 對(duì)多種疾病具有潛在的治療作用。3HB 具有抑制脂質(zhì)分解的能力［10］，從而可以通過(guò)提高心肌線粒體解偶聯(lián)蛋白的表達(dá)和降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的表達(dá)來(lái)抑制延長(zhǎng)心肌損傷的游離脂肪酸的產(chǎn)生，起到保護(hù)心肌的作用［11］。3HB 還可以通過(guò)不同的機(jī)制改善阿爾茨海默病、癲癇等神經(jīng)退行性疾?。?2-13］，而以3HB 為主要作用成分的生酮飲食對(duì)人乳腺癌［14］、神經(jīng)性母細(xì)胞瘤［15］、結(jié)腸癌［16］、前列腺癌［17］和胃癌［18］等腫瘤也具有明顯的治療效果。

基于以上優(yōu)勢(shì)，PHA材料已被廣泛用于組織工程、植入材料、藥物緩釋、醫(yī)療保健等多個(gè)領(lǐng)域中［19］。2007 年，以聚4-羥基丁酸酯（P4HB）為原料的可吸收縫合線 （TephaFLEX?） 獲美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，成為首個(gè)商品化的PHA醫(yī)療產(chǎn)品，進(jìn)一步打開(kāi)了PHA 在組織工程中的應(yīng)用前景［20］。

本文將針對(duì)PHA 材料在骨、皮膚、神經(jīng)等組織工程中的應(yīng)用進(jìn)行介紹，并簡(jiǎn)述PHA作為藥物載體的應(yīng)用前景（表1）。

表1 PHA在組織工程中的應(yīng)用Tab. 1 Applications of PHA in tissue engineering

1 PHA在骨組織工程中的應(yīng)用

由于PHA 材料良好的力學(xué)性質(zhì)和生物相容性等，許多基于PHA（如PHB， PHBHHx，PHBV 和P34HB）的支架已被應(yīng)用于骨組織工程中［37］。將PHB與納米羥基磷灰石（nHA）共混后制備了PHB/nHA復(fù)合支架，其顯示出高度互連的多孔結(jié)構(gòu)，具有相對(duì)較高的孔隙率。體外實(shí)驗(yàn)中，該支架對(duì)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞都具有較強(qiáng)的生物相容性，證明了其在骨組織工程中的應(yīng)用潛力［21］。Knowles 等人制備了 PHBV/磷酸鹽玻璃復(fù)合材料，并在大鼠皮下和非負(fù)重股骨作為種植體進(jìn)行骨修復(fù)評(píng)價(jià)。細(xì)胞的初始活性非常高；4 周后，大量細(xì)胞進(jìn)入由增溶玻璃形成的股骨種植體表面孔隙，種植體表面出現(xiàn)新骨，說(shuō)明PHBV 作為骨修復(fù)材料可以促進(jìn)骨組織的修復(fù)和再生［22］。PHBHHx 具有適當(dāng)?shù)氖杷?，且相比PHB 和PHBV 具有更好的機(jī)械性能。將兔骨髓細(xì)胞分別接種到PHB、PLA 和PHBHHx 的3D 支架上，PHBHHx 表現(xiàn)出更好的成骨細(xì)胞附著和骨髓細(xì)胞增殖性能。結(jié)合其更好的彈性和加工性，PHBHHx 也可以用作骨重建的潛在生物材料［23］。通過(guò)靜電紡絲技術(shù)，Lin 等人使用P34HB 和氧化石墨烯合成了納米纖維支架。這種復(fù)合材料支架制備簡(jiǎn)單，具有良好的多孔結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)的機(jī)械性能和快速成骨能力，在大鼠嚴(yán)重顱骨缺損的體內(nèi)骨再生中表現(xiàn)十分優(yōu)異［24］。綜上所述，多種不同種類的PHA 均可用于骨組織工程中作為支架材料，促進(jìn)骨組織的修復(fù)和再生。

2 PHA在皮膚組織工程中的應(yīng)用

PHA 材料在皮膚組織工程中的修復(fù)應(yīng)用也有較為廣泛的研究。Volova等人通過(guò)溶劑澆鑄和靜電紡絲技術(shù)分別制備了P34HB 膜和由超細(xì)纖維組成的無(wú)紡布靜電紡膜，作為傷口敷料，分別測(cè)試了兩者促進(jìn)皮膚修復(fù)和再生的能力。在磷酸鹽緩沖液中，兩種膜沒(méi)有顯著膨脹，也沒(méi)有快速水解，但P34HB本身的生物降解性保證了它們可以在血液中緩慢生物降解的同時(shí)保留其應(yīng)有的機(jī)械強(qiáng)度。相對(duì)于傳統(tǒng)的溶劑蒸發(fā)法得到的P34HB薄膜，靜電紡絲膜更有利于干細(xì)胞的增殖并向成纖維細(xì)胞進(jìn)行分化，而敷料上存在的成纖維細(xì)胞可同時(shí)促進(jìn)傷口愈合、血管形成和再生。同時(shí)，細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白還可以在靜電紡絲膜表面形成一層基質(zhì)，促進(jìn)表皮細(xì)胞向傷口周圍的鄰近組織遷移［25］。

基于以上原理，具有細(xì)胞外基質(zhì)模擬結(jié)構(gòu)（ECM）的仿生支架已在傷口愈合應(yīng)用中得到廣泛研究，但它們不足的機(jī)械強(qiáng)度和有限的生物活性仍然是臨床應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)。為解決這一缺陷，近期一項(xiàng)研究制備了一種微流控3D 打印仿生PHA 支架。該支架主要由P34HB和聚己內(nèi)酯（PCL）組成，具備優(yōu)異的拉伸強(qiáng)度（2.99 MPa）和降解性。它的ECM 模擬分層多孔結(jié)構(gòu)允許骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖并黏附在支架上。此外，負(fù)載BMSCs和HUVEC的各向異性復(fù)合支架可以顯著促進(jìn)大鼠傷口缺損中的再上皮化、膠原沉積和毛細(xì)血管形成，其表明具有令人滿意的體內(nèi)組織再生活性［26］。

通過(guò)濕法誘導(dǎo)相分離技術(shù)，Marcano 團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種孔隙可調(diào)節(jié)的不對(duì)稱PHA 纖維支架。在抗菌實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)細(xì)菌與支架接觸時(shí)，高達(dá)33%的表皮葡萄球菌的生物膜形成受到抑制，而26%的已形成的生物膜會(huì)被破壞。這種抗菌性能對(duì)于解決皮膚組織修復(fù)愈合中的感染問(wèn)題十分有效［27］。

以上結(jié)果均表明了基于PHA 的敷料或仿生支架用于皮膚修復(fù)和再生的可行性，為皮膚組織工程應(yīng)用提供了有效的治療策略和新的應(yīng)用前景。

3 PHA在神經(jīng)組織工程中的應(yīng)用

神經(jīng)組織損傷后的神經(jīng)再生是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要難題，而PHA基生物材料有望為其提供解決方案［38］。Khorasani 等人通過(guò)固/液相分離方法制造了PHB 支架，并使用P19 小鼠胚胎細(xì)胞系作為體外評(píng)價(jià)的模型系統(tǒng)。體外實(shí)驗(yàn)表明，該支架可以促進(jìn)細(xì)胞附著并分化到神經(jīng)細(xì)胞［28］。而在PHB 神經(jīng)導(dǎo)管中添加施萬(wàn)細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可能會(huì)達(dá)到更好的效果，進(jìn)一步增強(qiáng)神經(jīng)再生［29］。PHBV 微球具有降解速度慢和藥物釋放效率高等性能，對(duì)神經(jīng)組織工程具有重要意義。Chen 等人通過(guò)使用皮層神經(jīng)元（CN）和神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）來(lái)研究PHBV微球是否能夠支持神經(jīng)元生長(zhǎng)，以檢測(cè)PHBV 微球作為神經(jīng)組織工程支架對(duì)于不同神經(jīng)元類型的適用性。結(jié)果表明，NPCs 可以在微球上分化為神經(jīng)元，PHBV微球作為神經(jīng)組織工程的支架可以支持多種神經(jīng)元細(xì)胞類型，并促進(jìn)了更大的軸突-樹突分離，可能有助于修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［30］。而作為PHA 家族的新成員，3-羥基丁酸、3-羥基戊酸和3-羥基己酸的三元共聚物（PHBVHHx）也可以使人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSC）分化為神經(jīng)細(xì)胞［39］。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Young 等人研究了PHB 神經(jīng)導(dǎo)管在兔腓總神經(jīng)損傷模型中橋接長(zhǎng)神經(jīng)間隙（高達(dá)4 cm）的潛力。術(shù)后第63 天，再生軸突在自體神經(jīng)移植組和PHB 導(dǎo)管組中已經(jīng)橋接了所有長(zhǎng)度的神經(jīng)間隙，且PHB組的免疫染色再生纖維面積甚至大于自體神經(jīng)移植組。因此，PHB 導(dǎo)管支持周圍神經(jīng)再生的能力至少長(zhǎng)達(dá)63天，并且適合于長(zhǎng)間隙神經(jīng)損傷修復(fù)［40］。

而在一項(xiàng)具有前瞻性的臨床研究中，PHB 導(dǎo)管作為神經(jīng)外縫合的一種替代方法，用于治療手腕到前臂水平的周圍神經(jīng)損傷。12名有不同程度損傷的患者通過(guò)PHB 導(dǎo)管或顯微外科神經(jīng)外端縫合進(jìn)行治療。在經(jīng)過(guò)18 個(gè)月的臨床、神經(jīng)生理學(xué)、形態(tài)學(xué)和生理學(xué)評(píng)估后，大多數(shù)結(jié)果顯示PHB組患者與傳統(tǒng)治療組間不存在顯著差異，亦未報(bào)告與PHB相關(guān)的任何不良事件或并發(fā)癥。因此，PHB 導(dǎo)管可被視為顯微外科神經(jīng)外縫合的安全替代方案［41］。但這一研究涉及的患者數(shù)量有限，臨床上仍需要進(jìn)一步的探究確認(rèn)。

4 PHA用作藥物載體

除在上述組織工程中的應(yīng)用外，PHA還可以用作藥物載體搭載包括小分子藥物、蛋白質(zhì)、RNA 和細(xì)胞在內(nèi)的生物活性物質(zhì)（BAS）?；赑HA 的納米粒子已廣泛用于BAS遞送，尤其是用于腫瘤治療的藥物［42］。例如，將高毒性和低溶解度的模型抗癌藥物玫瑰樹堿封裝在PHBV納米粒中可以提高藥物的治療效果，使其對(duì)A549癌癥細(xì)胞系的抑制活性提高［31］?；赑HB 的納米載體還用于傳遞和控制多西紫杉醇（DTXL）的釋放，這是一種有效的抗癌藥物，與常用的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）相比，PHB 納米載體顯示出更高的載藥效率和更緩慢的釋放速率［32］。利用這一優(yōu)勢(shì)，Xiong等人還開(kāi)發(fā)了使用混合PHA納米顆粒（PHB和PHBHHx）的羅丹明B 異硫氰酸鹽（RBITC）的細(xì)胞內(nèi)控制釋放，并實(shí)現(xiàn)了經(jīng)驗(yàn)證的治療效果［43］。更重要的是，紫杉醇負(fù)載的PHBV 納米顆粒表現(xiàn)出48 h 的毒性保護(hù)窗口，允許靶細(xì)胞充分內(nèi)吞藥物載體，這可以通過(guò)增強(qiáng)的滲透性和保留效應(yīng)保護(hù)抗癌劑免于過(guò)早降解［44］。

由于局部注射方便且無(wú)不良反應(yīng)，PHA微球在抗腫瘤治療和組織再生方面具有巨大潛力［45］。PHA微球中沉積的抗生素（如四環(huán)素和慶大霉素）的高包封效率和可持續(xù)釋放可以在相應(yīng)的疾病模型中獲得治療效果［33］。Zhang等人制備了直徑為5～10 μm的PHBHHx 微球，該微球攜帶了含有有綠色熒光蛋白GFP的基因的腺病毒。通過(guò)腹腔將微球注射到小鼠的胰腺中；手術(shù)后5天，胰腺中約40%的血管內(nèi)皮細(xì)胞被標(biāo)記。這種基于PHA 微球腺病毒復(fù)合物的高效胰腺毛細(xì)血管靶向植入物在未來(lái)毛細(xì)血管相關(guān)疾病治療中具有巨大潛力和價(jià)值［43］。

為了避免使用支架移植進(jìn)行大型開(kāi)放手術(shù)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出小型細(xì)胞載體并用于修復(fù)復(fù)雜的組織缺損。Wei 等人成功制造了直徑為300～360 μm 的PHA 高度開(kāi)放多孔微球（OPMs），用作含有增殖干細(xì)胞的可注射載體［35］。與PLA 微球相比，PHA OPMs在小鼠同種異體骨形成和體外實(shí)驗(yàn)中顯示出更好的生物相容性，可以支持人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）的增殖和分化。作為細(xì)胞的微型諾亞方舟，PHA微球有助于將體外增殖的細(xì)胞運(yùn)輸?shù)饺毕萁M織中進(jìn)行組織再生。近期，Chotchindakun 等人制備了負(fù)載有不同濃度肉桂醛（CIN）的PHBV基介孔生物活性玻璃納米顆粒（MBGN），證明了PHA顆粒作為無(wú)抗生素材料在骨缺損修復(fù)中的巨大潛力［36］。綜上所述，無(wú)論是納米顆粒、微球還是細(xì)胞載體，PHA都可以搭載不同的生物活性物質(zhì)，適配不同的應(yīng)用場(chǎng)景。

5 結(jié)語(yǔ)

本文系統(tǒng)性地總結(jié)了不同種類、不同材料形式的PHA在骨、皮膚和神經(jīng)修復(fù)及藥物遞送中的應(yīng)用和進(jìn)展，充分展示了PHA材料在組織工程中的能力和潛在價(jià)值。未來(lái)的研究將更多地集中在開(kāi)發(fā)不同單聚或共聚的PHA，應(yīng)用不同的改性手段使它們適用于新的組織工程場(chǎng)景，并逐步走向臨床和市場(chǎng)。

作者貢獻(xiàn)聲明：

陳國(guó)強(qiáng)：制定選題，文章撰寫與修改。

劉心怡：文獻(xiàn)搜集及文章撰寫。

劉 絮：文章修改潤(rùn)色。