高麗娜，張永利，鄭欣欣，喬曉婷，閆宗科，金成勇*

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西 寶雞 721406）

窖泥作為微生物棲息富集的載體，含有己酸菌、乳酸菌、放線菌、甲烷菌及硝酸鹽還原菌等多種功能菌[1-2]，對酒體的風格形成具有重要作用[3]，是白酒釀造微生物的重要來源。鳳香型白酒釀造工藝中，采用土暗窖發(fā)酵，酒醅與窖泥接觸面積較大、時間較長，為保證己酸乙酯含量在合理范圍，每年會更新一次窖泥，因而對窖泥的依賴程度低于濃香型白酒，酒體風格融合了清香、濃香的優(yōu)點，具有醇香秀雅、甘潤挺爽、諸味協(xié)調(diào)、尾凈悠長的特點[4]。

近年來，隨著白酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展及現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的不斷創(chuàng)新應(yīng)用，窖泥微生物與白酒釀造的關(guān)系得到深入研究[5]，其中窖泥的微生物多樣性解析及其對釀酒生產(chǎn)、基酒品質(zhì)的影響[3，6-8]也得到較多關(guān)注。目前，多數(shù)窖泥依賴型白酒如濃香型、醬香型白酒等，已通過窖泥相關(guān)理論實踐研究逐漸明晰了不同地理位置、窖齡及窖池空間位置窖泥菌群構(gòu)成及窖泥功能菌作用等理論[9-12]。然而，現(xiàn)有涉及鳳香型窖泥的研究甚少、時間較早，且主要集中在窖泥理化指標分析和人工窖泥培養(yǎng)等方面[13-16]，關(guān)于對鳳香型窖泥微生物的研究鮮見報道，窖泥在鳳香型白酒釀造中的作用、窖泥質(zhì)量評價標準等也都有待研究。

本研究通過對鳳香型白酒窖泥的理化性質(zhì)、微生物多樣性解析，了解不同車間來源、窖池不同空間位置窖泥性質(zhì)，并采用典范對應(yīng)分析（canonicalcorrespondence analysis，CCA）探究窖泥的理化性質(zhì)與微生物群落的關(guān)系，一方面豐富鳳香型白酒窖泥相關(guān)理論，另一方面也為白酒窖泥的質(zhì)量評價提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥：取自陜西西鳳酒廠釀造車間；Fast脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）SPIN kit for soil：美國Mpbio公司；M0491L Q5超保真DNA聚合酶：美國Bio Labs公司；75510-019 Agarose、P7589 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit：美國invitrogen公司；氫氧化鈉、酒石酸鈉鉀、鹽酸、濃硫酸、氟化銨、鉬酸銨、氯化亞錫、磷酸二氫鉀、碘化汞、碘化鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FE28型pH計、ME303E電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-WO-5L油浴鍋：上海一凱儀器設(shè)備有限公司；UVS-1振蕩器：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；lllumina NovaSeq測序儀：美國lllumina公司；2720聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：美國ABI公司；FLX800T酶標儀、Nano Drop 2000超微量分光光度計：美國Thermo Scientific公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統(tǒng)：北京百晶生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥取樣方法

于圓窖期分別在車間T（一直采用傳統(tǒng)鳳型制酒工藝）、F（之前一直采用濃香型制酒工藝，改綿柔鳳型制酒工藝1年多）隨機挑選窖池3個（窖號：1#、12#、24#）和2個（窖號：1#、13#），采用五點取樣法，分別對各窖池的窖壁泥（JB）、窖底泥（JD）進行取樣，按照“車間-窖池位置-窖號”編號，樣品編號為TJB-1、TJB-12、TJB-24、TJD-1、TJD-12、TJD-24，F(xiàn)JB-1、TJB-13、FJD-1、TJD-13，相同車間窖池相同位置的窖泥指標取均值得到編號為TJB、TJD、FJB、FJD的四組樣品。

1.3.2 窖泥理化指標的測定

水分含量采用烘干恒重法測定[17]，pH值采用pH計測定[17]，氨基酸態(tài)氮含量采用納氏試劑比色法測定[17]，有效磷含量參照NY/T 1121.7—2014《土壤檢測第7部分：土壤有效磷的測定》測定[18]，有機質(zhì)含量參照NY/T 1121.6—2006《土壤檢測第6部分：土壤有機質(zhì)的測定》測定[19]。

1.3.3 窖泥微生物菌群多樣性分析

新鮮窖泥樣品采用Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒提取總DNA，以其為模板，分別采用引物對338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對細菌的16S rDNA V3-V4區(qū)基因序列進行PCR擴增，采用引物對ITS5F（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS1R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對真菌的ITS V1區(qū)基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系（25 μL）：5×reaction buffer 5 μL、5×GC buffer 5 μL、2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）2 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水（ddH2O）8.75 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL。PCR擴增條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25～30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，10 ℃保溫。PCR擴增及l(fā)llumina NovaSeq高通量測序委托上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Vsearch 2.13.4、Cutadapt 2.3、QIIME2-2019.4軟件對測序獲得的原始序列進行質(zhì)量控制；采用Vsearch 2.13.4軟件在97%相似度水平下對高質(zhì)量序列進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類；選用Silva 132、Unit 8數(shù)據(jù)庫對細菌和真菌序列進行比對，并采用QIIME2的classify-sklearn算法進行分類學注釋；采用隨機抽平方法分別計算α-多樣性指數(shù)。采用Origin 9.0軟件繪制窖泥優(yōu)勢菌門柱狀堆積圖，采用HemI軟件繪制窖泥優(yōu)勢菌屬熱圖，采用Canoco 5軟件進行窖泥理化因子與優(yōu)勢菌群組成的典范對應(yīng)分析（CCA）及繪圖。利用SPSS 20.0軟件進行窖泥理化指標方差分析、相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳香型白酒窖泥的理化指標

不同來源、位置窖泥樣品的理化指標測定結(jié)果見表1。

表1 不同窖泥樣品理化指標測定結(jié)果Table 1 Determination results of physicochemical indexes of different pit mud samples

由表1可知，窖泥的水分含量為31.26%～40.47%，pH值為6.38～8.69，氨基酸態(tài)氮含量為29.30～80.66 mg/100 g，有效磷含量為1.66～2.43 g/kg，有機質(zhì)含量為27.49～78.47 g/kg。從不同來源看，F(xiàn)、T車間窖泥樣品的平均水分含量分別為39.70%、32.29%，平均pH值分別為8.64、6.94，平均氨基酸態(tài)氮含量分別為76.50 mg/100 g、44.93 mg/100 g，三項指標差異顯著（P＜0.05）；平均有效磷含量分別為2.12 g/kg、1.95 g/kg、平均有機質(zhì)含量分別為55.46 g/kg、39.78 g/kg，兩項指標差異均不顯著（P＞0.05）。從不同位置看，同一車間JB、JD樣品的各項理化指標存在差異但均不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，不同來源窖泥樣品的水分、pH值、氨基酸態(tài)氮存在顯著差異，這可能與兩個車間的窖池管理水平有關(guān)。

2.2 鳳香型白酒窖泥的微生物菌群多樣性

2.2.1α-多樣性分析結(jié)果

鳳香型白酒窖泥微生物菌群的α-多樣性指數(shù)見表2。由表2可知，所有樣本的覆蓋率（Coverage）均＞99%，表明測序結(jié)果能真實反映窖泥樣品的微生物菌群組成信息。從窖泥細菌菌群來看，F(xiàn)車間JD樣品的OTU數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Pielou_e指數(shù)均高于JB樣品，Simpson指數(shù)略低于JB樣品，但差異均不顯著（P＞0.05）；而T車間JD樣品的所有指數(shù)均低于JB樣品，但差異也均不顯著（P＞0.05）。從窖泥真菌菌群來看，同一車間內(nèi)JB、JD樣品的各項指數(shù)均較為接近；F車間窖泥樣品的OTU數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Pielou_e指數(shù)略高于T車間窖泥樣品，Simpson指數(shù)略低于T車間窖泥樣品，但差異均不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，不同車間、窖池不同位置窖泥樣品細菌、真菌菌群的α-多樣性差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同窖泥樣品微生物菌群Alpha多樣性分析結(jié)果Table 2 Alpha diversity analysis results of microbial community in different pit mud samples

2.2.2β-多樣性分析結(jié)果

（1）細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

采用QIIME2軟件classify-sklearn算法和Silva 132數(shù)據(jù)庫從窖泥樣品中共注釋到38個細菌門、626個細菌屬?；陂T、屬水平，不同來源、不同位置窖泥樣品中細菌群落組成見圖1。

圖1 基于門（a）和屬（b）水平不同窖泥樣品細菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.1 Bacterial community structure of different pit mud samples based on phylum (a) and genus (b) levels

由圖1a可知，在門水平上，窖泥樣品的優(yōu)勢細菌門（平均相對豐度＞1%）為厚壁菌門（Firmicutes）（59.56%）、變形菌門（Proteobacteria）（21.94%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（9.23%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（3.50%）、放線菌門（Actinobacteria）（2.67%）。其中，F(xiàn)irmicutes在F、T車間JD樣品中均為絕對優(yōu)勢細菌門，相對豐度分別為77.21%、76.97%，分別是其JB樣品中的1.78和1.89倍。Proteobacteria在F、T車間JB樣品中相對豐度較高，分別為47.54%、20.61%，分別是其JD樣品中的4.49和2.29倍。Bacteroidetes在F車間窖泥樣品中相對豐度均較低，但在T車間窖泥樣品中為優(yōu)勢細菌門，且在JB樣品中的相對豐度是其JD樣品的4.06倍。結(jié)果表明，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria為鳳香型白酒窖泥中的主導優(yōu)勢細菌門，且T車間窖泥優(yōu)勢細菌門類更豐富。

由圖1b可知，在屬水平上，窖泥樣品的優(yōu)勢細菌屬（平均相對豐度＞2%）為Fastidiosipila（9.31%）、己酸菌屬（Caproiciproducens）（7.86%）、梭菌屬（Solibacillus）（7.44%）、八疊球菌屬（Sporosarcina）（7.25%）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）（6.80%）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（5.18%）、擬桿菌屬（Petrimonas）（4.74%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（3.72%）、Christensenellaceae_R-7_group（2.22%）。其中，Caproiciproducens是窖泥中產(chǎn)己酸的重要菌群[20]；Solibacillus的豐度與己酸、己酸乙酯、丁酸、丁酸乙酯水平相關(guān)[21]；Petrimonas具有代謝糖類生成乙酸功能[20]；Lactobacillus是鳳香型酒醅中的優(yōu)勢細菌屬[22]，且有生成乳酸作用，并與乳酸乙酯含量正相關(guān)[21]，而乙酸、己酸、乳酸、丁酸和乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯也分別是鳳香型白酒中的四大有機酸和四大酯[23]，推測窖泥優(yōu)勢細菌對基酒微量成分有一定貢獻[24]。從不同來源看，F(xiàn)車間窖泥樣品中平均相對豐度較高的優(yōu)勢細菌屬為Fastidiosipila（18.59%）、Sporosarcina（13.16%）、Psychrobacter（13.60%）、Acinetobacter（10.28%）；而T車間與F車間窖泥樣品中相對豐度較高的優(yōu)勢細菌屬組成不同，為Caproiciproducens（15.41%）、Solibacillus（13.54%）、Petrimonas（8.60%）、Lactobacillus（6.70%）。從空間位置看，JB、JD樣品中相對豐度較高的優(yōu)勢細菌屬分布差異較大，F(xiàn)車間JB樣品中相對豐度較高的優(yōu)勢細菌屬為Psychrobacter（27.14%）、Acinetobacter（19.90%）、Sporosarcina（17.77%），JD樣品中相對豐度較高的優(yōu)勢細菌屬為Fastidiosipila（33.27%）、Sporosarcina（8.56%）；而T車間JB樣品中相對豐度較高的優(yōu)勢細菌屬為Petrimonas（16.92%）、Lactobacillus（13.13%）、Christensenellaceae_R-7_group（6.05%），JD樣品中相對豐度較高的優(yōu)勢細菌屬為Caproiciproducens（27.07%）和Solibacillus（25.51%）。綜上，不同車間窖泥優(yōu)勢細菌菌群組成差異較大，不同窖池位置窖泥樣品細菌群落組成具有明顯的空間異質(zhì)性。

（2）真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

采用QIIME2軟件classify-sklearn算法和Unit 8數(shù)據(jù)庫從窖泥樣品中共注釋到9個真菌門、166個真菌屬。基于門、屬水平，不同來源、不同位置窖泥樣品中真菌群落組成見圖2。

圖2 基于門（a）和屬（b）水平不同窖泥樣品真菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.2 Fungal community structure of different pit mud samples based on phylum (a) and genus (b) levels

由圖2a可知，在門水平上，窖泥樣品的優(yōu)勢真菌門（相對平均豐度＞1%）為子囊菌門（Ascomycota）（84.22%）、擔子菌門（Basidiomycota）（4.33%）、毛霉菌門（Mucoromycota）（3.07%）。其中，Ascomycota為窖泥樣品中的絕對優(yōu)勢細菌門，其在F和T車間JB、JD樣品中的相對豐度分別為75.07%、85.14%和88.50%、88.16%。Basidiomycota在F車間JB、JD樣品中相對豐度較高，分別為8.67%、5.40%，分別是T車間JB、JD樣品中的5.18和3.39倍。Mucoromycota在F車間JB樣品、T車間JD樣品中相對豐度較高，分別為4.13%和4.59%。結(jié)果表明，Ascomycota為鳳型窖泥中的絕對優(yōu)勢真菌門。

由圖2b可知，在屬水平上，窖泥樣品的優(yōu)勢真菌屬（平均相對豐度＞1%）為畢赤酵母屬（Pichia）（12.78%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（5.92%）、曲霉菌屬（Aspergillus）（5.54%）、賽多孢菌屬（Scedosporium）（2.45%）、假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）（2.45%）、假散囊菌屬（Pseudeurotium）（1.86%）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）（1.57%）、根霉菌屬（Rhizopus）（1.35%）、橫梗霉屬（Lichtheimia）（1.24%）、青霉菌屬（Penicillium）（1.03%）。其中，Pichia具有較強的產(chǎn)酯能力[25]，Thermoascus對糖化力、液化力有提升作用[26]，Aspergillus的酯化酶和糖化酶活力強[27]，三個菌屬也是鳳香型酒醅中的優(yōu)勢真菌屬[22]。從不同來源看，F(xiàn)、T車間窖泥樣品中相對豐度較高的優(yōu)勢真菌屬各有5種，其中共有的優(yōu)勢真菌屬為Thermoascus（4.22%、7.63%）、Pichia（2.83%、22.74%）、Aspergillus（3.08%、7.99%），且相對豐度均在T車間較高；特有的相對豐度較高優(yōu)勢真菌屬在F車間為Pseudeurotium（3.54%）、Wickerhamomyces（3.03%），在T車間為Pseudallescheria（4.90%）、Scedosporium（4.71%）。從空間位置看，JB、JD樣品中相對豐度較高的優(yōu)勢真菌屬分布差異較大，F(xiàn)車間JB樣品中各優(yōu)勢真菌屬相對豐度均較低，JD樣品中相對豐度較高的真菌屬為Thermoascus（6.62%）、Wickerhamomyces（6.06%）、Pseudeurotium（5.39%）、Aspergillus（4.83%）、Pichia（3.54%）；T車間JB樣品中相對豐度較高的優(yōu)勢真菌屬為Pichia（39.65%）、Aspergillus（7.16%）、Thermoascus（3.15%），在JD樣品中與F車間JD樣品共有的相對豐度較高的優(yōu)勢真菌屬有3種，Aspergillus（12.10%）、Thermoascus（8.82%）、Pichia（5.82%），特有的相對豐度較高的優(yōu)勢真菌屬為Pseudallescheria（9.66%）、Scedosporium（9.29%）、Rhizopus（3.05%）。綜上，窖泥真菌群落組成也具有明顯的空間異質(zhì)性。

2.3 鳳香型白酒窖泥理化因子與優(yōu)勢菌群相關(guān)性分析

窖泥的理化性質(zhì)差異是影響微生物群落多樣性的重要因素[28-29]。采用典范對應(yīng)分析對窖泥理化因子與優(yōu)勢菌群（平均相對豐度前10的細菌屬與真菌屬）間相關(guān)性進行分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，CCA1和CCA2軸共解釋了優(yōu)勢細菌群落39.57%的變異率，優(yōu)勢真菌群落43.53%的變異率，且均主要集中在CCA1軸，表明微生物群落在一定程度上受到窖泥理化性質(zhì)影響。

圖3 窖泥理化因子與優(yōu)勢細菌屬（a）和真菌屬（b）的典范對應(yīng)分析結(jié)果Fig.3 Canonical correspondence analysis results of physicochemical factors of pit mud and dominant bacterial genera (a) and fungal genera (b)

由圖3a可知，窖泥優(yōu)勢菌屬結(jié)構(gòu)的影響來自多個理化因子的綜合作用，如Caproiciproducens、Lactobacillus、Petrimonas、Christensenellaceae_R-7_group均與pH值、水分、氨基酸態(tài)氮含量呈負相關(guān)，與有效磷、有機質(zhì)含量呈正相關(guān)；Psychrobacter、Sporosarcina、Acinetobacter、Kurthia與pH值呈正相關(guān)，與其他指標呈負相關(guān)；Fastidiosipila與水分、氨基酸態(tài)氮含量、pH值呈正相關(guān)，與有效磷、有機質(zhì)含量呈負相關(guān)；Solibacillus與pH值、有效磷、有機質(zhì)含量呈正相關(guān)，與其他指標呈負相關(guān)。條件限制性分析結(jié)果顯示，pH值（29.9%）對優(yōu)勢細菌結(jié)構(gòu)的影響極顯著（P＜0.01），氨基酸態(tài)氮含量（25.6%）的影響顯著（P＜0.05），其他理化指標影響大小依次為有效磷含量（18.3%）、有機質(zhì)（14.6%）含量、水分含量（11.5%），但影響均不顯著（P＞0.05）。由圖3b可知，不同來源窖泥優(yōu)勢真菌群落差異與多個理化因子相關(guān)，Pichia、Candida與氨基酸態(tài)氮、水分、有效磷含量呈負相關(guān)，與有機質(zhì)含量呈正相關(guān)；Penicillium、Pseudeurotium、Scedosporium、Pseudallescheria、Cutaneotrichosporon與pH 值、氨基酸態(tài)氮含量呈正相關(guān)，與其他理化指標呈負相關(guān)；Thermoascus、Rhizopus、Aspergillus與pH值呈負相關(guān)，與其他指標呈正相關(guān)。條件限制性分析結(jié)果顯示，氨基酸態(tài)氮含量（44.6%）對優(yōu)勢真菌結(jié)構(gòu)的影響最大，其次為pH值（42.1%），其他依次為水分含量（6.5%）、有效磷含量（3.6%）、有機質(zhì)含量（3.3%），但影響均不顯著（P＞0.05）。窖泥pH值對微生物的生長繁殖具有重要影響[29-30]，如pH值較低時有助于乳酸桿菌等耐/嗜酸菌群富集；氨基酸態(tài)氮是窖泥功能菌生長、繁殖的主要氮源[30]。綜上，pH值、氨基酸態(tài)氮含量極有可能是影響鳳香型白酒窖泥微生物菌群在不同來源、不同位置中分布差異的主要理化因子。

3 結(jié)論

本研究在對窖泥理化指標分析基礎(chǔ)上結(jié)合高通量測序技術(shù)，分析了不同來源、位置鳳香型白酒窖泥的理化特性及微生物群落結(jié)構(gòu)差異。理化性質(zhì)分析表明，不同來源窖泥的pH值、氨基酸態(tài)氮和水分含量存在顯著差異（P＜0.05），有效磷、有機質(zhì)含量差異均不顯著（P＞0.05）；不同位置窖泥樣品的各項理化指標存在差異但均不顯著（P＞0.05）；窖泥的水分含量為31.26%～40.47%，pH值呈弱酸性至中性，為6.38～8.69，氨基酸態(tài)氮含量為29.30～80.66 mg/100 g，有效磷含量為1.66～2.43 g/kg，有機質(zhì)含量為27.49～78.47 g/kg。微生物多樣性分析結(jié)果顯示，不同來源、位置窖泥的細菌和真菌菌群α-多樣性存在差異但均不顯著（P＞0.05）；細菌、真菌群落組成在來源、窖池位置上均具有空間異質(zhì)性，但主要優(yōu)勢細菌屬為Fastidiosipila（9.31%）、己酸菌屬（Caproiciproducens）（7.86%）、梭菌屬（Solibacillus）（7.44%）、八疊球菌屬（Sporosarcina）（7.25%）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）（6.80%）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（5.18%）等，主要優(yōu)勢真菌屬為畢赤酵母屬（Pichia）（12.78%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（5.92%）、曲霉菌屬（Aspergillus）（5.54%）等。通過典范對應(yīng)分析（CCA）探究窖泥菌群分布特征與其理化因子的關(guān)系，結(jié)果表明，pH值、氨基酸態(tài)氮含量極有可能是影響鳳香型白酒窖泥微生物菌群在不同來源、不同位置中分布差異的主要理化因子。