唐嘉悅　黃德見

摘 要：建立HPLC法檢測(cè)拉米夫定替諾福韋片有關(guān)物質(zhì)的方法，為拉米夫定替諾福韋片的質(zhì)量控制提供方法依據(jù)。采用BDS C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），以0.025mol/L醋酸銨、乙腈和甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長260nm，進(jìn)樣量5μL。結(jié)果顯示各色譜峰均能良好分離，各雜質(zhì)濃度和峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率在95.0%～105.0%。本方法專屬性強(qiáng)、靈敏、準(zhǔn)確，可用于拉米夫定替諾福韋片有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，同時(shí)填補(bǔ)了國內(nèi)關(guān)于拉米夫定替諾福韋片有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的空白。

關(guān)鍵詞：拉米夫定替諾福韋片；有關(guān)物質(zhì)；質(zhì)量控制

中圖分類號(hào)：R927.11? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2023）11-0016-04

拉米夫定替諾福韋片為拉米夫定和富馬酸替諾福韋二吡呋酯的復(fù)方制劑，臨床上主要用于乙型肝炎感染治療和艾滋病治療[1-4]。為抗人類免疫缺陷病毒（HIV）的一線藥物。WHO藥物資格預(yù)審名單中收錄有Hetero、Mylan、Cipla等六家印度公司生產(chǎn)本品，截至2019年國內(nèi)僅1家公司被批準(zhǔn)上市。

關(guān)于拉米夫定替諾福韋片有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，國內(nèi)外未見文獻(xiàn)報(bào)道。為了嚴(yán)格控制其質(zhì)量，本文采用HPLC法對(duì)拉米夫定替諾福韋片有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)合拉米夫定和富馬酸替諾福韋二吡呋酯的合成工藝，分析其雜質(zhì)譜[5-8]，其結(jié)構(gòu)式見圖1。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司產(chǎn)；BT25S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)。

1.2 試藥及試劑

對(duì)照品：富馬酸替諾福韋二吡呋酯（GOM335，USP，99.3%）、拉米夫定（210405，自制，99.5%）、拉米夫定分離度混合物C（USP，F(xiàn)OK348）、雜質(zhì)對(duì)照品A（210305，自制，98.5%）、雜質(zhì)對(duì)照品B（210305，自制，99.5%）、雜質(zhì)對(duì)照品C（210305，自制，97.5%）、雜質(zhì)對(duì)照品D（210305，自制，98.4%）、雜質(zhì)對(duì)照品E（210306，自制，98.5%）、雜質(zhì)對(duì)照品F（210205，自制，99.2%）、雜質(zhì)對(duì)照品G（210305，自制，95.5%）、雜質(zhì)對(duì)照品H（210305，自制，96.7%）、雜質(zhì)對(duì)照品I（210305，自制，98.5%）、雜質(zhì)對(duì)照品J（210315，自制，98.5%）雜質(zhì)對(duì)照品K（210325，自制，96.5%）雜質(zhì)對(duì)照品L（210308，自制，97.5%）雜質(zhì)對(duì)照品M（210205，自制，99.5%）。

試劑：乙腈（色譜純）、水（超純水）、醋酸銨（分析純）、冰醋酸（分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：BDS C18柱，4.6×250mm，5μm；檢測(cè)波長260nm；柱溫35℃；流速1.0mL/min；進(jìn)樣溫度6℃；進(jìn)樣量5μL。

流動(dòng)相：按表1進(jìn)行線性梯度洗脫；

流動(dòng)相A－0.025mol/L醋酸銨（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.9±0.1）：甲醇（95：5）

流動(dòng)相B－0.025mol/L醋酸銨（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.9±0.1）：乙腈（40：60）

流動(dòng)相C－0.025mol/L醋酸銨（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.9±0.1）：乙腈（20：80）

2.2 溶液配制

（1）系統(tǒng)適用性溶液的配制。取拉米夫定分離度混合物C對(duì)照品1支，加入乙腈：水（10：90）混合溶劑2.5mL使溶解，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液（1）。

取拉米夫定，富馬酸替諾福韋二吡呋酯和雜質(zhì)G、H、I、J、K、L、M各適量，加入流動(dòng)相A溶解稀釋定容后配制成含拉米夫定3mg/mL、富馬酸替諾福韋二吡呋酯3mg/mL，雜質(zhì)I 100μg/mL其他雜質(zhì)10μg/mL的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液（2）。

（2）供試品溶液的配制。精密稱取本品細(xì)粉適量（約相對(duì)于富馬酸替諾福韋二吡呋酯30mg），置10mL量瓶中，加流動(dòng)相A適量超聲5分鐘，并稀釋至刻度，搖勻，用0.45？滋m的濾膜濾過。

（3）對(duì)照溶液的配制。精密量取供試品溶液1mL，置200mL量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 系統(tǒng)適用性

取系統(tǒng)適用性溶液（1）（2）各5？滋L按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，各色譜峰之間分離度均大于1.5。重復(fù)進(jìn)樣結(jié)果顯示各組分系統(tǒng)參數(shù)的RSD%均≤5.0%；結(jié)果均符合要求。

2.3.2 專屬性實(shí)驗(yàn)

精密量取流動(dòng)相A 5μL，按上述色譜條件注入液相色譜儀，按處方比例取混合輔料按供試品溶液制備方法制成溶液，照上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果空白溶劑空白輔料均不干擾樣品檢測(cè)。結(jié)果見圖3。

（1）酸破壞試驗(yàn)：精密稱取本品的細(xì)粉適量（約相當(dāng)于富馬酸替諾福韋二吡呋酯30mg），置10mL量瓶中，加6mol/L鹽酸溶液2ml，搖勻，放置10分鐘，中和，加流動(dòng)相A適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm的濾膜濾過。

（2）堿破壞試驗(yàn)：精密稱取本品的細(xì)粉適量（約相當(dāng)于富馬酸替諾福韋二吡呋酯30mg），置10mL量瓶中，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液2mL，搖勻，放置10分鐘，中和，加流動(dòng)相A適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm的濾膜濾過。

（3）高溫破壞試驗(yàn)：精密稱取置100℃加熱6h樣品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于富馬酸替諾福韋二吡呋酯30mg），置10mL量瓶中，加流動(dòng)相A適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm的濾膜濾過。

（4）氧化破壞試驗(yàn)：精密稱取本品的細(xì)粉適量（約相當(dāng)于富馬酸替諾福韋二吡呋酯30mg），置10mL量瓶中，加30%過氧化氫溶液2mL，搖勻，放置10分鐘，加流動(dòng)相A適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm的濾膜濾過。

（5）光照破壞試驗(yàn)：精密稱取已置太陽光下照射15天的本品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于富馬酸替諾福韋二吡呋酯30mg），置10mL量瓶中，加流動(dòng)相A適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm的濾膜濾過。

按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，主峰與相鄰雜質(zhì)及各降解雜質(zhì)峰分離度符合要求，結(jié)果見表2。

2.4 檢測(cè)限、定量限

將上述雜質(zhì)用流動(dòng)相不斷稀釋，精密量取檢測(cè)限、定量限溶液各5μL按2.1項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，當(dāng)信噪比S/N≥10時(shí)，即為定量濃度及定量限，當(dāng)信噪比S/N≥3時(shí)，即為檢測(cè)濃度及檢測(cè)限。結(jié)果雜質(zhì)A的定量限濃度為0.1679μg/mL，檢測(cè)限濃度為0.0569μg/mL；雜質(zhì)B的定量限濃度為0.1532μg/mL，檢測(cè)限濃度為0.0528μg/mL；雜質(zhì)C的定量限濃度為0.2000？g/mL，檢測(cè)限濃度為0.1000μg/mL；雜質(zhì)D的定量限濃度為0.2000μg/mL，檢測(cè)限濃度為0.1000μg/mL；雜質(zhì)E的定量限濃度為0.1500μg/mL，檢測(cè)限濃度為0.0785μg/mL；雜質(zhì)F的定量限濃度為0.1500μg/mL，檢測(cè)限濃度為0.0750μg/mL；雜質(zhì)G的定量限濃度為0.1500μg/mL，檢測(cè)限濃度為0.0700μg/mL；雜質(zhì)H的定量限濃度為0.1500μg/mL，檢測(cè)限濃度為0.0785μg/mL；雜質(zhì)I的定量限濃度為0.2500μg/mL，檢測(cè)限濃度為0.0569μg/mL；雜質(zhì)J的定量限濃度為0.1500μg/mL，檢測(cè)限濃度為0.0785μg/mL；雜質(zhì)L的定量限濃度為0.1500μg/mL，檢測(cè)限濃度為0.0785μg/mL；雜質(zhì)M的定量限濃度為0.1500μg/mL，檢測(cè)限濃度為0.0785μg/mL；拉米夫定的定量限濃度為0.1750μg /mL，檢測(cè)限濃度為0.0890μg/mL；富馬酸替諾福韋二吡呋酯的定量限濃度為0.1750μg/mL，檢測(cè)限濃度為0.0875μg/mL。

2.5 線性

取上述雜質(zhì)對(duì)照品各適量，精密稱定，加流動(dòng)相A使溶解，再加稀釋劑逐步稀釋制成適宜濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各5μL，按上述色譜條件注入液相色譜儀，記錄峰面積。以C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，做回歸方程。結(jié)果雜質(zhì)A的回歸方程為A=9.7014C-0.314 r=1；雜質(zhì)B的回歸方程為A=56.5977C+0.2359 r=0.9999；雜質(zhì)C的回歸方程為A=56.5977C+0.2359 r=0.9999；雜質(zhì)D的回歸方程為A=8.9358C-0.7073 r=1；雜質(zhì)E的回歸方程為A=7.1591C-1.602 r=1；雜質(zhì)F的回歸方程為A=14.029C+1.0604 r=0.9998；拉米夫定的回歸方程為A=9.7727C+8.7101 r=0.9999；富馬酸替諾福韋二吡呋酯的回歸方程為A=6.0942C+39.024 r=0.9998；雜質(zhì)G的回歸方程為A=6.2244C+8.1014 r=1；雜質(zhì)H的回歸方程為A=28.288C-0.7321 r=0.9998；雜質(zhì)I的回歸方程為A=16.953C-2.2805 r=1；雜質(zhì)J的回歸方程為A=10.352C+1.42263 r=0.9999；雜質(zhì)K的回歸方程為A=8.7401C-2.6152 r=1；雜質(zhì)L的回歸方程為A=14.703C-1.165 r=0.9997；雜質(zhì)M的回歸方程為A=20.138C-1.2967 r=1，各組分在LOQ～至少150%的限量濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.6 重復(fù)性

取同一批號(hào)樣品適量，共6份，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，按上述色譜條件注入液相色譜儀，結(jié)果6次結(jié)果顯示雜質(zhì)檢出個(gè)數(shù)、已知雜質(zhì)檢出量、最大單雜和總雜質(zhì)基本不變；說明本方法具有較好的重復(fù)性。

2.7 回收率

取同一批號(hào)樣品適量，分別置于9個(gè)10mL量瓶中，再分別按限度濃度的80%、100%和120%加入上述對(duì)照品各3份混勻，按上述供試品溶液的制備方法制成供試品溶液。結(jié)果，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I、雜質(zhì)J、雜質(zhì)K、雜質(zhì)L、雜質(zhì)M的回收率分別為96.5%、103.9%、100.1%、103.6%、102.9%、103.5%、98.5%、99.5%、97.2%、96.5%、98.2%、94.8%、96.5%。RSD%分別為0.30%、0.45%、1.85%、0.42%、1.58%、2.15%、1.24%、1.38%、1.45%、2.10%、1.98%、2.00%、1.87%。

2.8 耐用性

分別考察了醋酸銨的濃度、pH值、流速、柱溫以及流動(dòng)相比例的±10%微小變化對(duì)系統(tǒng)適用性（1）（2）及同一批次有關(guān)物質(zhì)供試品溶液檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果各因素微小變化對(duì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果基本無影響。說明本方法耐用性良好。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長的選擇

富馬酸替諾福韋二吡呋酯和拉米夫定最大吸收波長分別為260nm和277nm，由于兩者處方量相同，綜合各雜質(zhì)的紫外吸收，對(duì)波長260nm和277nm分別進(jìn)行了專屬性考查，結(jié)果表明通過酸、堿、氧化、高溫、光照強(qiáng)制降解試驗(yàn)主峰與相鄰雜質(zhì)峰之間均能較好分離?？紤]到在相同濃度下富馬酸替諾福韋二吡呋酯在277nm波長處吸收比拉米夫定弱。因此選擇富馬酸替諾福韋二吡呋酯最大吸收波長260nm作為檢測(cè)波長[9-12]。

3.2 流動(dòng)相及色譜柱的選擇

本品為復(fù)方制劑，建立有關(guān)物質(zhì)分析方法時(shí)應(yīng)同時(shí)考慮拉米夫定和富馬酸替諾福韋二吡呋酯相關(guān)雜質(zhì)，由于拉米夫定及其雜質(zhì)極性大于富馬酸替諾福韋二吡呋酯及相關(guān)雜質(zhì)，因此本方法前15分鐘主要參考“拉米夫定片”中國藥典或BP藥典方法用于對(duì)拉米夫定及相關(guān)雜質(zhì)的分離。至15分鐘后，隨著有機(jī)相比例增高，富馬酸替諾福韋二吡呋酯相關(guān)雜質(zhì)可被完全洗脫出來。最終優(yōu)化方法色譜條件下，拉米夫定的保留時(shí)間約為9分鐘，富馬酸替諾福韋二吡呋酯的保留時(shí)間約為38分鐘。各峰之間分離度均較好[13-15]。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種有效檢測(cè)拉米夫定替諾福韋片有關(guān)物質(zhì)的分析方法，并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可簡便有效地檢測(cè)相關(guān)雜質(zhì)，各雜質(zhì)之間的分離度均大于1.5。系統(tǒng)適用性、專屬性、線性、回收率均較好，檢測(cè)靈敏度高。可用于拉米夫定替諾福韋片有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。填補(bǔ)了國內(nèi)關(guān)于該品種有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的空白，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

〔1〕余史丹，汪碩聞，唐原君，等.替諾福韋、依非韋倫對(duì)拉米夫定在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響[J].中南藥學(xué)，2022，20（09）：2033-2040.

〔2〕馬春濤，霍秀敏，王強(qiáng).我國艾滋病抗病毒治療藥品注冊(cè)情況分析[J].中國艾滋性病，2020，26（09）：941-944+953.

〔3〕項(xiàng)少黎，儲(chǔ)文龍.替諾福韋聯(lián)合拉米夫定片和洛匹那韋利托那韋片治療艾滋病的效果評(píng)價(jià)[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2022，17（05）：163-165.

〔4〕黃婉盈，郭姝悅，張曉丹.替諾福韋酯聯(lián)合拉米夫定治療艾滋病合并乙型肝炎病毒感染的臨床療效分[J].航空航天醫(yī)學(xué)雜志，2021，32（09）：1094-1095.

〔5〕徐鳳杰，楊永忠.拉米夫定的合成進(jìn)展[J].云南化工，2009，36（06）：33-35.

〔6〕王華，鄒柳，劉映，等.拉米夫定的合成工藝優(yōu)化[J].臨床合理用藥雜志，2016，9（34）：88-90.

〔7〕朱衛(wèi)兵.富馬酸替諾福韋二吡呋酯的合成[J].應(yīng)用化工，2020，49（S2）：360-362.

〔8〕張奇，郭明，赫暢，等.富馬酸替諾福韋二吡呋酯的合成工藝[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，35（07）：543-546+556.

〔9〕伏瑤，劉松霞，范彩霞，等.伊沙匹隆有關(guān)物質(zhì)的HPLC法檢測(cè)[J].藥物分析雜志，2022，42（10）：1801-1807.

〔10〕劉曉坤，王世瀟，方詩源，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定普那布林原料藥中9種有關(guān)物質(zhì)[J].中國海洋藥物，2023，42（03）：63-68.

〔11〕劉振麗，徐麗.高效液相色譜法測(cè)定西咪替丁片中的有關(guān)物質(zhì)和含量[J].黑龍江醫(yī)藥，2022，46（15）：1854-1856.

〔12〕白莉霞，劉希望，楊亞軍，等.高效液相色譜法測(cè)定阿司匹林丁香酚酯咀嚼片的有關(guān)物質(zhì)[J].中國畜牧醫(yī)藥，2023，50（07）：3007-3016.

〔13〕龐賽，梁愛仙，陳顏清，等.HPLC法測(cè)定氨酚曲馬多片有關(guān)物質(zhì)方法的建立[J].中國藥師，2022， 25（09）：1689-1693.

〔14〕周琳.煙酸片中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定及結(jié)果分析[J].海峽藥學(xué)，2022，34（05）：71-74.

〔15〕保敏敏，呂蓓蓓，魏文芝，等.奧卡西平片中有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定方法的建立[J].中國藥房，2023，34（10）：1199-1203.