劉璐 管欣 趙燕喬 王曉娜 尹崇高 劉清華 李洪利

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]，肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）是最常見的肺癌組織學(xué)類型[2]，肺癌患者的平均5年生存率仍然很低，致癌基因的有效監(jiān)視被視為癌癥治療的靶點(diǎn)，分子病理學(xué)診斷和靶向治療應(yīng)用能顯著提高患者總生存期[3]。目前分子靶向治療在臨床應(yīng)用中顯示出不錯(cuò)的治療效果[4]，但是由于耐藥性的發(fā)展，患者的治療仍具有挑戰(zhàn)性。因此，進(jìn)一步了解肺癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，尋找更有效的分子靶向治療和預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)對(duì)提高LUAD患者的生存率和生活質(zhì)量至關(guān)重

要[5]。

鐵死亡（ferroptosis）是一種新的細(xì)胞死亡形式，其特征是大量鐵積累和脂質(zhì)過氧化，在腫瘤微環(huán)境中起著關(guān)鍵作用[6]。鐵穩(wěn)態(tài)影響細(xì)胞特征的發(fā)展，細(xì)胞鐵含量可以影響腫瘤狀況，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖需要大量的鐵，但過量的鐵水平會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[7]。先前研究證實(shí)，LUAD中重要的鐵死亡調(diào)節(jié)因子RRM2通過抑制鐵毒死亡促進(jìn)腫瘤免疫浸潤(rùn)[8]；KLF11通過抑制GPX4調(diào)控LUAD鐵下垂和化療敏感性[9]，因此解決抑制鐵死亡的分子機(jī)制、誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生對(duì)于治療肺癌具有深遠(yuǎn)臨床意義。

微小RNA（microRNAs, miRNAs）是一種高度保守的非編碼RNA（non-coding RNAs, ncRNAs）[10]，主要通過3' UTR中的識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行翻譯抑制或降解信使RNA（messenger RNA, mRNA）來(lái)調(diào)節(jié)基因的穩(wěn)定性表達(dá)[11]。有課題組研究[12]表明，lncRNA-AC009948.5通過結(jié)合miR-186-5p促進(jìn)LUAD的侵襲轉(zhuǎn)移，miR-186-5p降低A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力，miR-186-5p可能成為L(zhǎng)UAD診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，但關(guān)于miR-186-5p是否通過鐵死亡方式影響LUAD增殖、侵襲與遷移還尚未見研究與報(bào)道。本文通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-186-5p是否通過調(diào)控其下游靶蛋白PRKAA2影響A549鐵死亡途徑從而抑制LUAD細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器 細(xì)胞株：LUAD A549、H1299細(xì)胞株以及293T細(xì)胞株購(gòu)自ATCC（American Type Culture Collection）。miR-186-5p過表達(dá)及對(duì)照質(zhì)粒、PRKAA2敲除及對(duì)照質(zhì)粒均由上海吉?jiǎng)P基因股份有限公司構(gòu)建合成。鐵死亡抑制劑Fer-1購(gòu)自山東增峰生物科技有限公司。EdU和JC-1試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。活性氧（reactive oxygen species, ROS）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione, GSH）試劑盒購(gòu)自Boxbio生工科技有限公司。絲裂霉素C購(gòu)自Sigma Aldrich公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將細(xì)胞分組：（1）con組：A549、H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒；（2）con+Fer-1組：轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒后加入10 μmol/L鐵死亡抑制劑Fer-1；（3）overmiR-186-5p+Fer-1組：轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-186-5p質(zhì)粒后加入10 μmol/L鐵死亡抑制劑Fer-1；（4）over-miR-186-5p+sh-PR K A A2+Fer-1組：共轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-186-5p和敲低PRKAA2質(zhì)粒后加入10 μmol/L鐵死亡抑制劑Fer-1。

1.3 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)和篩選靶基因 通過miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)、DIANA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://diana.e-ce.uth.gr/tools）、miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://mirdb.org/）以及FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.zhounan.org/ferrdb/current/）預(yù)測(cè)可能與miR-186-5p結(jié)合的靶基因。通過韋恩圖將以上網(wǎng)站所預(yù)測(cè)到的靶蛋白取交集。通過GEPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)最終篩選出表達(dá)以及生存預(yù)后符合條件的靶蛋白。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 構(gòu)建pGL3-PRKAA2-3’-UTR-WT（UGAAAAUCAGUUAUAUUCUUUA）和pGL3-PRKAA2-3’-UTRMUT（UGAAAAUCAGUUAUCGCGAUCA），將miR-186-5p過表達(dá)（CTCGAGTGCTTGTAACTTTCCAAAGAATTCTCCTTTTG GGCTTTCTGGTTTTATTTTAAGCCCAAAGGTGAATTTTT TGGGAAGTTTGAGCTTTCGAA）及對(duì)照質(zhì)粒和PRKAA2的野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，48 h后測(cè)定熒光素酶活性。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測(cè)PRKAA2基因表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA, cDNA），qRT-PCR檢測(cè)PRKAA2在細(xì)胞中的表達(dá)量。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRKAA2蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后提取總蛋白，煮蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4oC過夜，洗膜，二抗孵育，洗膜，曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 各分組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，加入EdU工作液，37oC孵育2 h，甲醇固定30 min，Triton透膜40 min，Click反應(yīng)液孵育40 min，DAPI染核。

1.8 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 取培養(yǎng)24 h的各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。取稀釋后的Matrigel膠涂抹于上室。上室滴加200 μL（4×104個(gè)）細(xì)胞懸液，下室滴加含10% FBS的正常培養(yǎng)液。24 h后甲醇固定，PBS洗滌，姬姆薩染色，雙蒸水沖洗晾干，拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.9 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 取移液器200 μL吸頭做平行劃痕，PBS洗滌，更換為含1%胎牛血清的培養(yǎng)基。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 MDA和還原型GSH含量檢測(cè) 各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量1×104個(gè)，離心收集細(xì)胞，冰浴超聲破碎，4oC 8000g離心10 min。取上清加入MDA檢測(cè)試劑后沸水浴處理60 min，測(cè)定450、532和600 nm三處的吸光值進(jìn)行MDA含量計(jì)算；另取上清加入GSH檢測(cè)試劑后室溫充分顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定412 nm處吸光值進(jìn)行GSH含量計(jì)算。

1.11 ROS和脂質(zhì)活性氧（lipid ROS, L-ROS）含量檢測(cè) 各組轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞以2×105數(shù)量鋪于共聚焦小皿中，加入無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA熒光探針的工作液（1:1000，終濃度10 μmol/L），避光孵育20 min；無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌后換為正常培養(yǎng)液，觀察并拍照。L-ROS：甲醇固定20 min，PBS洗滌，加入1 mL用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋C11-BODIPY探針的工作液，孵育30 min，PBS洗滌，換為正常培養(yǎng)液。觀察并拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組樣本比較采用t檢驗(yàn)，多組樣本比較采用單因素方差分析，P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRKAA2與miR-186-5p靶向結(jié)合且在LUAD中高表達(dá)通過生信網(wǎng)站miRDB、DIANA、miRWalk、FerrDb預(yù)測(cè)可與miR-186-5p結(jié)合的鐵死亡相關(guān)靶基因，4組數(shù)據(jù)取交集得到2個(gè)靶基因：PIK3CA、PRKAA2（圖1A）。通過GEPIA和Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)到的靶蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，PRKAA2在LUAD組織中高表達(dá)（圖1B，P＜0.05），PRKAA2低表達(dá)的LUAD患者預(yù)后生存率高于高表達(dá)患者（圖1C，P＜0.05）。因此，我們選取PRKAA2為研究對(duì)象做后續(xù)研究。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-186-5p與PRKAA2兩者間靶向結(jié)合關(guān)系，結(jié)果顯示，PRKAA2 mRNA的3’-UTR區(qū)是miR-186-5p的直接結(jié)合位點(diǎn)（圖1D，P＜0.05）。綜上所述，PRKAA2在LUAD中高表達(dá)，miR-186-5p與PRKAA2存在結(jié)合位點(diǎn)且miR-186-5p負(fù)向調(diào)控PRKAA2蛋白表達(dá)。

圖1 miR-186-5p與PRKAA2靶向結(jié)合。A：韋恩圖顯示4個(gè)生信網(wǎng)站取交集獲得2個(gè)共同鐵死亡蛋白；B：Ualcan查詢PRKAA2在正常組織和肺腺癌組織中的表達(dá)情況；C：GEPIA查詢PRKAA2的生存曲線分析；D：熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同組細(xì)胞的熒光素酶活性。*P＜0.05。Fig 1 Targeted binding of miR-186-5p with PRKAA2. A: Venn diagram shows that two common ferroptosis proteins are obtained by intersection of four websites; B: UALCAN query the expression of PRKAA2 in normal tissues and lung adenocarcinoma tissues; C: GEPIA inquires about the survival curve analysis of PRKAA2; D: Luciferase activity of different groups of cells was detected by luciferase experiment. *P＜0.05. LUAD: lung adenocarcinoma; WT: wild-type; MUT: mutant-type; con: control.

2.2 miR-186-5p負(fù)向調(diào)控PRKAA2發(fā)揮作用 通過qRT-PCR檢測(cè)PRKAA2的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-186-5p后PRKAA2表達(dá)量顯著下降（圖2A）；通過Western印跡檢測(cè)過表達(dá)miR-186-5p后PRKAA2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，over-miR-186-5p組PRKAA2的表達(dá)明顯低于con組（圖2B，P＜0.05）。綜上所述，miR-186-5p負(fù)向調(diào)控PRKAA2從而發(fā)揮作用。

圖2 miR-186-5p負(fù)向調(diào)控PRKAA2。A：qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)miR-186-5p后PRKAA2的基因表達(dá)水平；B：Western blot檢測(cè)過表達(dá)miR-186-5p后PRKAA2的蛋白表達(dá)水平。*P＜0.05。Fig 2 miR-186-5p negatively regulates PRKAA2. A: The gene expression level of PRKAA2 was detected by qRT-PCR after miR-186-5p was overexpressed; B: The protein expression level of PRKAA2 was detected by Western blot after miR-186-5p was expressed. *P＜0.05. qRT-PCR:quantitative real-time polymerase chain reaction.

2.3 miR-186-5p通過鐵死亡方式抑制LUAD細(xì)胞增殖能力 EdU增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同濃度（10 μmol/L）抑制劑Fer-1處理下，con+Fer-1組陽(yáng)性增殖細(xì)胞數(shù)明顯多于con組；相較于con+Fer-1組，over-miR-186-5p+Fer-1組A549和H1299陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相對(duì)減少；over-miR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組陽(yáng)性增殖細(xì)胞數(shù)比over-miR-186-5p+Fer-1組更少（圖3A、3B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 miR-186-5p調(diào)控PRKAA2通過鐵死亡方式抑制肺腺癌細(xì)胞增殖能力。A：EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在加入Fer-1條件下，轉(zhuǎn)染miR-186-5p和PRKAA2對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的結(jié)果圖及定量分析；B：相同條件下對(duì)H1299細(xì)胞侵襲能力的結(jié)果圖及定量分析。*P＜0.05。Fig 3 The ability of miR-186-5p to inhibit the proliferation of lung adenocarcinoma cell by ferroptosis. A: EdU experiment was used to detect the proliferation ability of tranfected miR-186-5p and PRKAA2 to A549 cells under the condition of adding Fer-1; B: Results and quantitative analysis of invasion ability of H1299 cells under the same conditions. *P＜0.05.

2.4 miR-186-5p通過鐵死亡方式抑制LUAD細(xì)胞侵襲遷移能力 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖4），在相同濃度（10 μmol/L）抑制劑Fer-1處理下，con+Fer-1組穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)明顯多于con組，相較于con+Fer-1組，over-miR-186-5p+Fer-1組穿過基底膜的A549和H1299細(xì)胞數(shù)相對(duì)減少；over-miR-186-5p+Fer-1組穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)多于overmiR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，每組在加入絲裂霉素C排除細(xì)胞增殖對(duì)劃痕遷移能力的影響后，在相同濃度（10 μmol/L）抑制劑Fer-1處理下，相較于con組，con+Fer-1組劃痕寬度更窄；over-miR-186-5p+Fer-1組細(xì)胞遷移率小于con+Fer-1組；相較于over-miR-186-5p+Fer-1組，over-miR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組劃痕寬度更加顯著（圖5A、5B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 miR-186-5p調(diào)控PRKAA2通過鐵死亡方式抑制肺腺癌細(xì)胞侵襲能力。A：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在加入Fer-1條件下，轉(zhuǎn)染miR-186-5p和PRKAA2對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的結(jié)果圖及定量分析；B：相同條件下對(duì)H1299細(xì)胞侵襲能力的結(jié)果圖及定量分析。*P＜0.05。Fig 4 The ability of miR-186-5p to inhibit the invasion of lung adenocarcinoma cell by ferroptosis. A: Transwell experiment was used to detect the invasion ability of transfected miR-186-5p and PRKAA2 to A549 cells under the condition of adding Fer-1; B: Results and quantitative analysis of invasion ability of H1299 cells under the same conditions. *P＜0.05.

圖5 miR-186-5p調(diào)控PRKAA2通過鐵死亡方式抑制肺腺癌細(xì)胞遷移能力。A：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在加入Fer-1條件下，轉(zhuǎn)染miR-186-5p和PRKAA2對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的結(jié)果圖及定量分析；B：相同條件下對(duì)H1299細(xì)胞侵襲能力的結(jié)果圖及定量分析。*P＜0.05。Fig 5 The ability of miR-186-5p to inhibit the migration of lung adenocarcinoma cell by ferroptosis. A: Scratch test results and quantitative analysis of the migration ability of transfected miR-186-5p and PRKAA2 to A549 cells under the condition of adding Fer-1; B: Results and quantitative analysis of invasion ability of H1299 cells under the same conditions. *P＜0.05.

2.5 miR-186-5p逆轉(zhuǎn)Fer-1減少LUAD細(xì)胞ROS含量的影響ROS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同濃度（10 μmol/L）抑制劑Fer-1處理下，con+Fer-1組細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯低于con組；相較于con+Fer-1組，over-miR-186-5p+Fer-1組A549和H1299細(xì)胞熒光強(qiáng)度相對(duì)增強(qiáng)；over-miR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組熒光強(qiáng)度強(qiáng)于over-miR-186-5p+Fer-1組，過表達(dá)miR-186-5p和敲低PRKAA2引起大量ROS的生成（圖6），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 ROS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量變化。敲低PRKAA2協(xié)同miR-186-5p共同升高細(xì)胞內(nèi)ROS含量。Fig 6 ROS experiment was used to detect the changes of ROS content in cells of each group. Knockdown of PRKAA2 and miR-186-5p increase the content of intracellular ROS. ROS: reactive oxygen species.

2.6 miR-186-5p調(diào)控PRKAA2通過調(diào)節(jié)MDA與GSH含量促進(jìn)鐵死亡敏感性 MDA實(shí)驗(yàn)顯示，與con組相比，con+Fer-1組細(xì)胞MDA含量降低；相較于con+Fer-1組，over-miR-186-5p+Fer-1組A549和H1299細(xì)胞MDA含量升高；over-miR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組細(xì)胞MDA含量顯著高于overmiR-186-5p+Fer-1組。GSH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與con組相比，con+Fer-1組還原型GSH含量升高；相較于con+Fer-1組，over-miR-186-5p+Fer-1組A549和H1299細(xì)胞還原型GSH含量降低；over-miR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組細(xì)胞還原型GSH含量顯著低于over-miR-186-5p+Fer-1組（圖7）。因此，過表達(dá)miR-186-5p逆轉(zhuǎn)了Fer-1對(duì)LUAD細(xì)胞鐵死亡指標(biāo)的影響，過表達(dá)miR-186-5p和敲除PRKAA2可明顯上調(diào)A549和H1299細(xì)胞中MDA水平，下調(diào)GSH含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖7 miR-186-5p和PRKAA2對(duì)A549（A）、H1299（B）細(xì)胞MDA和GSH水平的影響。*P＜0.05。Fig 7 Effect of miR-186-5p and PRKAA2 on MDA and GSH levels of A549 (A) and H1299 (B) cells. *P＜0.05. MDA: malondialdehyde; GSH: glutathione.

2.7 miR-186-5p調(diào)控PRKAA2通過增加L-ROS促進(jìn)鐵死亡敏感性 采用C11 BODIPY 581/591檢測(cè)A549脂質(zhì)過氧化情況，未氧化的C11 BODIPY 581/591呈現(xiàn)紅色熒光信號(hào)，氧化的呈綠色熒光信號(hào)。L-ROS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于con組，con+Fer-1組A549和H1299細(xì)胞L-ROS紅色熒光信號(hào)強(qiáng)度升高，over-miR-186-5p+Fer-1組A549細(xì)胞紅色熒光強(qiáng)度減弱；相較于over-miR-186-5p+Fer-1組，over-miR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組細(xì)胞綠色熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，紅色熒光明顯減弱（圖8），miR-186-5p通過靶向調(diào)控PRKAA2增強(qiáng)L-ROS水平，打破細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，誘導(dǎo)A549和H1299細(xì)胞L-ROS生成，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖8 miR-186-5p靶向PRKAA2破壞A549、H1299細(xì)胞中的鐵穩(wěn)態(tài)。L-ROS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在加入Fer-1條件下，過表達(dá)miR-186-5p和敲低PRKAA2后細(xì)胞內(nèi)L-ROS含量變化。Fig 8 miR-186-5p targeted PRKAA2 to destroy iron homeostasis in A549 and H1299 cells. L-ROS experiment was used to detect the changes of L-ROS content in cells after overexpression of miR-186-5p and knockdown of PRKAA2 under the condition of adding Fer-1. L-ROS: lipid reactive oxygen species.

3 討論

LUAD常見于肺外周組織，約占非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）的70%和肺腫瘤的40%。針對(duì)性地靶向打擊癌細(xì)胞是癌癥治療的主要挑戰(zhàn)，癌癥的發(fā)生和維持均有癌基因的調(diào)控，因此抑制腫瘤生長(zhǎng)的策略之一是靶向致癌途徑[13]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的快速發(fā)展，人們提出了新的治療策略，以改善LUAD患者的預(yù)后[14]。確定肺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制是開發(fā)有效的生物標(biāo)志物，以更好地診斷和設(shè)計(jì)治療干預(yù)措施的必要條件[15]。

miR-186-5p參與多種形式的細(xì)胞死亡過程，如凋亡、焦亡和自噬。本研究發(fā)現(xiàn)miR-186-5p通過結(jié)合PRKAA2抑制Fer-1促進(jìn)A549、H1299細(xì)胞鐵死亡，這些研究表明miR-186-5p是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、焦亡、自噬和鐵死亡交叉調(diào)控的重要miRNA，進(jìn)一步探討miR-186-5p在細(xì)胞凋亡、自噬和鐵死亡之間相互作用中的關(guān)鍵作用具有深遠(yuǎn)的臨床意義。鐵對(duì)于快速增殖的癌細(xì)胞至關(guān)重要，已經(jīng)有人嘗試通過鐵代謝來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)[16]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）賦予極化上皮細(xì)胞更強(qiáng)的侵襲性，被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[17]。鐵下垂和EMT是腫瘤發(fā)生的主要生物學(xué)過程，它們之間存在著復(fù)雜的關(guān)系，并通過多種信號(hào)通路介導(dǎo)。EMT過程通過不同的機(jī)制在多種癌細(xì)胞中產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞死亡的抗性。對(duì)治療有抵抗力或接受EMT的癌細(xì)胞可能更容易誘導(dǎo)鐵下垂，具有間充質(zhì)性質(zhì)的癌細(xì)胞通常比具有上皮性質(zhì)的癌細(xì)胞對(duì)鐵下垂更敏感，這意味著EMT在一定程度上與鐵下垂有關(guān)[18]。

miR-186-5p已被證實(shí)與癌癥密切相關(guān)，我們課題組前期實(shí)驗(yàn)研究[19]表明，miR-186-5p通過靶向調(diào)控PTTG1抑制LUAD細(xì)胞的EMT，然而有關(guān)miR-186-5p如何通過鐵死亡機(jī)制影響其在LUAD增殖遷移和侵襲中發(fā)揮作用尚未見研究報(bào)道，因此，本文通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證敲低PRKAA2能協(xié)同miR-186-5p增強(qiáng)LUAD細(xì)胞對(duì)Fer-1誘導(dǎo)的鐵死亡敏感性，逆轉(zhuǎn)Fer-1抑制LUAD細(xì)胞鐵死亡的趨勢(shì)，從而抑制LUAD細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力，進(jìn)一步加強(qiáng)證實(shí)miR-186-5p在LUAD細(xì)胞中所發(fā)揮的抑癌作用。

AMPK（5′AMP活化蛋白激酶）作為細(xì)胞能量傳感器，是多種癌癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[20]。PRKAA2是AMPK的α2亞基，在葡萄糖代謝中起重要作用[21]。我們的研究表明，PRKAA2是miR-186-5p的直接靶點(diǎn)，敲除PRKAA2促進(jìn)A549細(xì)胞鐵死亡，miR-186-5p通過負(fù)向調(diào)控PRKAA2促進(jìn)LUAD細(xì)胞鐵死亡，從而抑制LUAD細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。通過本研究，我們探討了miR-186-5p促進(jìn)LUAD細(xì)胞鐵死亡的分子機(jī)制，但關(guān)于miR-186-5p通過何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路靶向PRKAA2介導(dǎo)LUAD進(jìn)程的機(jī)制尚不清楚，這也將成為我們接下來(lái)探索與研究的重點(diǎn)。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Liu L conceived and designed the study. Zhao YQ and Wang XN performed the experiments. Guan X analyzed the data. Liu QH contributed analysis tools. Yin CG and Li HL provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.