陳婧姼 楊俊泉 高伊函

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，5 年生存率不到10%[1]。由于腫瘤樣本不足、患者的固有臨床風(fēng)險(xiǎn)以及侵入性活檢的限制，NSCLC 患者血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）越來(lái)越受到關(guān)注[2]。CTCs 是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)子類，能夠從原發(fā)部位遷移到附近的血管和（或）淋巴管，并在血流微環(huán)境中存活[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，CTCs 水平可以反映腫瘤負(fù)荷和生物侵襲性[3]。因此，從患者的外周血中分離CTCs可用于惡性腫瘤的診斷和預(yù)后研究。鐵死亡被描述為一種非凋亡調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡，其特征是過(guò)量活性氧產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化[4]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)肺癌中有鐵死亡發(fā)生，胞質(zhì)P53RRA-Ras GTP 酶激活蛋白結(jié)合蛋白1 相互作用誘導(dǎo)P53 在細(xì)胞核中滯留增加，從而觸發(fā)細(xì)胞周期停滯、凋亡和鐵死亡[5]。因此，抑制鐵死亡可以抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。近期，有學(xué)者根據(jù)肺癌組織中鐵死亡相關(guān)基因（ALOX5、TFRC、PHKG2、FADS2、NOX1）表達(dá)構(gòu)建了一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并發(fā)現(xiàn)該評(píng)分可以促進(jìn)新的治療方法和指導(dǎo)個(gè)體化治療[6]。然而，尚不清楚該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否適用于基于CTCs 的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。近年來(lái)，18F 氟脫氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose，F(xiàn)DG）結(jié)合正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像/電子計(jì)算機(jī)X 射線斷層掃描技術(shù)（positron emission tomography/computed tomography，PET/CT）作為腫瘤代謝負(fù)荷的功能成像方法，已成為評(píng)估早期治療反應(yīng)以及預(yù)測(cè)包括NSCLC 在內(nèi)的多種癌癥的有前途工具[7]。本研究的主要目的是評(píng)估CTCs 鐵死亡相關(guān)基因構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤代謝負(fù)荷結(jié)合用于晚期NSCLC 預(yù)后分層的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2019 年1 月至2022 年1 月于唐山市人民醫(yī)院（唐山市腫瘤醫(yī)院）接受治療且病理診斷為Ⅲ～Ⅳ期101 例NSCLC 患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）病理診斷為NSCLC；2）接受PET/CT 掃描，并有可用于計(jì)算代謝腫瘤體積（metabolic tumor volume，MTV）或糖酵解的總病變（total lesion glycolysis，TLG）水平的數(shù)據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除接受過(guò)化療或有任何其他惡性腫瘤病史的患者。本研究獲得所有患者或其家屬知情同意及本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：ED10250）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 最初的142 例研究受試者中，41 例患者因無(wú)法計(jì)算MTV 或TLG 水平或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)不足而被排除，其余101 例患者入選?；€風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和PET/CT 掃描之間的測(cè)量間隔中位數(shù)為7 d[四分位數(shù)(IQR)=4～14 d]。中位隨訪時(shí)間為19.4（1.3～36.0）個(gè)月。提取并分析關(guān)于年齡、性別、美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組體力狀況評(píng)分（ECOG PS）、吸煙史、病變類型、組織學(xué)類型和臨床分期的數(shù)據(jù)。

1.2.2 PET/CT 圖像分析 所有患者都在常規(guī)臨床方案下使用Gemini TF/16 通道PET/CT 掃描儀（購(gòu)自德國(guó)飛利浦醫(yī)療系統(tǒng)公司）進(jìn)行PET/CT 聯(lián)合掃描。禁食至少6 h 后，靜脈注射放射性示蹤劑（5～6 MBq/kg）FDG，60 min 后進(jìn)行掃描。首先采集非增強(qiáng)CT 掃描進(jìn)行衰減校正，然后采集PET 掃描。通過(guò)在PET 圖像上使用MIRADA XD3 軟件（購(gòu)自英國(guó)MIRADA Medical 公司）繪制感興趣區(qū)域（volume of interest，VOI）來(lái)提取標(biāo)準(zhǔn)化攝取值 (standardized uptake value，SUV)、MTV和TLG[8]。將固定的SUV截止值2.5 g/mL用于半自動(dòng)輪廓繪制系統(tǒng)，以排除非腫瘤組織的生理FDG 吸收。在自動(dòng)生成VOI 邊界后由核醫(yī)學(xué)醫(yī)生進(jìn)行手動(dòng)校正。MTV定義為手動(dòng)校正VOI 邊界內(nèi)的腫瘤總體積。TLG 計(jì)算為MTV 和SUV 平均值的乘積。

1.2.3 基于CTCs 鐵死亡相關(guān)基因構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型 從每個(gè)患者收集外周靜脈血樣品（3 mL）置于含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的真空采血管中。血液樣本暫時(shí)儲(chǔ)存溫度4～10℃，并在24 h 內(nèi)進(jìn)行處理。將獲得血液樣品溶解紅細(xì)胞并去除白細(xì)胞，然后使用CytoploRare 試劑盒（購(gòu)自上海市GenoSaber Biotech 公司）對(duì)葉酸受體陽(yáng)性的CTCs 進(jìn)行富集，使用E.Z.N.A.HP 總RNA試劑盒（購(gòu)自美國(guó)OMEGA 公司）提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT 試劑盒（購(gòu)自日本Takara 公司）合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。使用IqTMSYBR Green Supermix（購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。應(yīng)用2-△△Ct相對(duì)定量方法，通過(guò)β-actin 的Ct 值（內(nèi)源性參照）標(biāo)準(zhǔn)化5 個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)時(shí)PCR引物如下：ALOX5 forward：5′-CAAAATCTGGGTG CGTTCCA-3′；ALOX5 reverse：5′-AGCAGCTTGAAA ATGGGGTG-3′；TFRC forward：5′-GGAGTGCTGGA GACTTTGGA-3′；TFRC reverse：5′-TATACAACAG TGGGCTGGCA-3′；PHKG2 forward：5′-AGCTTCGA GAGTTGTGTGGG-3′；PHKG2 reverse：5′-TAACAT CAGGATCTGCCGCC-3′；NOX1 forward：5′-GGGGT CAAACAGAGGAGAGC-3′；NOX1 reverse：5′-CTTC TGCTGGGAGCGGTAAA-3′；FADS2 forward：5′-GC CACTTAAAGGGTGCCTCT-3′；FADS2 reverse：5′-T GCTGGTGATTGTAGGGCAG-3′；β-actin forward：5′-CCACGAAACTACCTTCAATCCC-3′；β-actin reverse：5′-GTGATCTCTCTTCTGCATCCTGT-3′。

參照文獻(xiàn)報(bào)道的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式[9]：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（0.170×ALOX5 表達(dá)）+（0.125×TFRC 表達(dá)）+（0.298×PHKG2 表達(dá)）+（0.181×FADS2 表達(dá)）+（0.848×NOX1表達(dá)），建立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將患者分為低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組（評(píng)分≤0.70，n=51）和高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組（評(píng)分＞0.70，n=50）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。NSCLC患者的年齡、PET/CT 參數(shù)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)均表示為中位數(shù)和IQR 范圍。通過(guò)Spearman 相關(guān)系數(shù)評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和MTV/TLG 之間的相關(guān)性。構(gòu)建無(wú)進(jìn)展生存 期（progression-free survival，PFS）和總 生存 期（overall survival，OS）的Kaplan-Meier 生存曲線，并通過(guò)對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)測(cè)量統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。多變量Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型用于調(diào)查風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)生存結(jié)果影響的風(fēng)險(xiǎn)比（HR），調(diào)整的協(xié)變量包括年齡、性別、ECOG PS 評(píng)分、Charlson 共病指數(shù)、臨床分期和MTV/TLG 水平。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的基線特征

整個(gè)隊(duì)列的年齡中位數(shù)為66（58～73）歲，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)為0.70（0.40～1.61）。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分低和高的患者之間的基線特征相似（表1）。然而，與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分低的患者相比，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高的患者表現(xiàn)出明顯更高的MTV[49（8～123）mLvs.169（35～498）mL]和TLG 水 平[105（50～290）gvs.415（244～1 330）g]（P＜0.05）。

表1 NSCLC 患者的基線臨床病理特征和PET/CT 參數(shù)

2.2 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與代謝性腫瘤負(fù)荷的相關(guān)性

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和MTV、TLG 之間存在顯著的正相關(guān)（r=0.618、0.462，均P＜0.001）（圖1）。

圖1 散點(diǎn)圖顯示NSCLC 患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與MTV 和TLG 之間的關(guān)系

2.3 MTV 或TLG 對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)后價(jià)值

高M(jìn)TV 的NSCLC 患者表現(xiàn)出相似的中位PFS（低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和高M(jìn)TVvs.高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和高M(jìn)TV；4.0 個(gè)月vs.3.6 個(gè)月；P＞0.05）和中位OS（低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和高M(jìn)TVvs.高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和高M(jìn)TV；9.2 個(gè)月vs.6.6個(gè)月；P＞0.05），與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分水平無(wú)關(guān)。然而，低MTV和低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者的中位PFS（低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和低MTVvs.高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和低MTV；16.8 個(gè)月vs.7.1 個(gè)月；P＜0.001）和中位OS（低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和低MTVvs.高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和低MTV；49.3 個(gè)月vs.11.5 個(gè)月；P＜0.001）高于低MTV 和高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者（圖2A，2B）。

圖2 根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、MTV 和TLG 水平對(duì)NSCLC 患者的PFS 和OS 進(jìn)行評(píng)估

高TLG 的NSCLC 患者在低和高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分水平之間表現(xiàn)出相似的中位PFS（低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和高TLGvs.高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和高TLG；4.0 個(gè)月vs.3.2 個(gè)月；P＞0.05）。然而，低TLG 和低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者的中位PFS（低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和低TLGvs.高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和低TLG；16.8 個(gè)月vs.5.3 個(gè)月；P＜0.001）和中位OS（低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和低TLGvs.高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和低TLG；49.3 個(gè)月vs.10.6 個(gè)月；P＜0.001）比低TLG 和高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者更長(zhǎng)。高TLG 和低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分水平患者的中位OS 顯著長(zhǎng)于高TLG 和高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分水平的患者（低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和低TLGvs.高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和低TLG；14.1 個(gè)月vs.6.6個(gè)月；P＜0.05）（圖2C，2D）。

2.4 單變量和多變量分析

在單變量分析中，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與不良OS 顯著相關(guān)（HR=3.03，P=0.001）。多變量Cox 回歸分析顯示，與低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組相比，高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組OS 的HR 顯著增加（HR=3.22，P=0.001）。在多變量分析中調(diào)整MTV和TLG 后，NSCLC 患者中高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的HR 相似（P＜0.01，表2）。

表2 NSCLC 患者OS 風(fēng)險(xiǎn)比的單變量和多變量分析

3 討論

目前，肺癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估仍然是臨床實(shí)踐中的關(guān)鍵。因此，作為臨床肺癌管理的基本策略，18F-FDG PET/CT 檢查和對(duì)惡性腫瘤患者CTCs 研究不斷增加。有研究調(diào)查并比較了18F-FDG PET/CT 與CTCs 在肺癌患者中的臨床應(yīng)用，如Bian等[10]報(bào)道，在ⅡB～ⅣB 期NSCLC 患者中，CTCs 顯示與MTV 相關(guān)。Fu 等[11]報(bào)道，在ⅢB 期小細(xì)胞肺癌治療前，CTCs的數(shù)量與MTV 相關(guān)。Castello 等[12]發(fā)現(xiàn)較高的MTV和TLG 導(dǎo)致較高的CTCs；NSCLC 患者治療前后的CTCs 計(jì)數(shù)變化與腫瘤代謝反應(yīng)顯著相關(guān)。根據(jù)上述結(jié)論，本研究進(jìn)一步評(píng)估了基于CTCs 鐵死亡相關(guān)基因構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)NSCLC 患者OS 的預(yù)后價(jià)值，證實(shí)了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與不良OS 顯著相關(guān)。

最近，有研究使用多變量Cox 回歸分析構(gòu)建了一個(gè)鐵死亡相關(guān)基因（ALOX5、TFRC、PHKG2、FADS2、NOX1）標(biāo)記模型預(yù)測(cè)肺鱗癌患者的預(yù)后，并確定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是肺鱗癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素，可用于預(yù)測(cè)肺鱗癌患者1、3 和5 年的OS 概率。高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫浸潤(rùn)增加、較低的甲基化水平、較高的免疫檢查點(diǎn)基因水平和較好的化療藥物敏感性相關(guān)[9]。TFRC 是一種重要的膜蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[13]。激活TFRC 增加鐵含量，介導(dǎo)ROS 釋放，誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的鐵死亡[14]；然而，敲除TFRC 可通過(guò)上調(diào)AXIN2 表達(dá)或微小RNA-107 海綿顯著抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[15]。PhK 是一種異源四聚體，由α、β、γ 和δ 亞基各四個(gè)拷貝組成。其中，PHKG2 編碼γ 亞基[16]。PHKG2 是多種癌癥的診斷生物標(biāo)志物，包括乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌[17]。NOX1 在ROS 生成和肺癌中起重要作用[18]。有研究發(fā)現(xiàn)Toll 樣受體4 信號(hào)介導(dǎo)NOX1 依賴性ROS 生成增強(qiáng)了NSCLC 的轉(zhuǎn)移[18]。FADS2 在癌癥中過(guò)度表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用[19]。抑制FADS2 可以通過(guò)增加肺癌細(xì)胞中鐵和脂質(zhì)ROS 的水平來(lái)減少鐵死亡[20]。ALOX5 基因編碼脂肪氧合酶，可催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為白三烯[21]。敲除ALXO5 可減輕ARPE-19 細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化、線粒體損傷、DNA 損傷和細(xì)胞死亡[21]。本研究證實(shí)了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤代謝負(fù)荷相關(guān)，即具有較高腫瘤代謝負(fù)荷的患者可能具有較高的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。

理論上，利用 PET/CT 掃描的MTV 和TLG水平可以精確估計(jì)代謝性腫瘤的負(fù)荷[22]。有報(bào)道，MTV風(fēng)險(xiǎn)分層系統(tǒng)具有獨(dú)立于NSCLC 臨床分期和其他預(yù)后變量的預(yù)后價(jià)值[7]。因此，本文探討了結(jié)合MTV、TLG 分析和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)NSCLC 的預(yù)后價(jià)值。本文觀察到無(wú)論風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分如何，高腫瘤代謝負(fù)荷患者均預(yù)后不良。值得注意的是，本研究表明高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者的預(yù)后比低腫瘤代謝負(fù)荷合并低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者差。因此，監(jiān)測(cè)基線風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分以預(yù)測(cè)生存可能對(duì)低腫瘤代謝負(fù)荷的患者至關(guān)重要。最后，校正MTV 和TLG 后，在多變量Cox 回歸檢驗(yàn)中，高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與不良OS 獨(dú)立相關(guān)。因此，基線腫瘤代謝負(fù)荷不是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)后的顯著混雜因素。

總之，本研究結(jié)果表明，監(jiān)測(cè)CTCs 的鐵死亡風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分作為一種早期、可獲得的生物標(biāo)志物來(lái)識(shí)別低腫瘤代謝負(fù)荷的患者，可能有助于改善患者預(yù)后。

本文無(wú)影響其科學(xué)性與可信度的經(jīng)濟(jì)利益沖突。