文柏清， 張 倪， 康亞妮

（上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，上海 200240）

0 引 言

卡米洛·高爾基（Camillo Golgi）于1873 年發(fā)現(xiàn)，利用鉻酸銀溶液浸泡大腦切片，可以使小部分神經(jīng)元全部染色，即高爾基染色（Golgi staining）［1］。高爾基方法的主要優(yōu)點(diǎn)之一是神經(jīng)染色具有隨機(jī)性的，因?yàn)樗蝗旧魏我粋€(gè)選定區(qū)域大約1% ～10%的神經(jīng)元。這種隨機(jī)染色使得單個(gè)神經(jīng)元幾乎所有結(jié)構(gòu)可視化，包括體細(xì)胞、軸突、樹突和樹突棘。隨后，多種研究對(duì)該方法進(jìn)行了改良，如由Cajal提出的快速高爾基染色法（Rapid Golgi method）、高爾基-柯普奇法（Golgi-Kopsch）和高爾基-考克斯（Golgi-Cox）。

Golgi-Cox法以氯化汞取代硝酸銀進(jìn)行神經(jīng)標(biāo)記，并通過(guò)鉻酸鉀緩和溶液的過(guò)度酸性反應(yīng)。該方法優(yōu)于快速高爾基染色法，標(biāo)記的神經(jīng)元更多，且重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定，被廣泛用于觀察神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，但其性質(zhì)不確定、一致性差、染色時(shí)間長(zhǎng)等因素阻礙了其作為首選方法應(yīng)用［2］。FD Rapid Golgi StainTMKit是基于Golgi-Cox方法研發(fā)的，其以試劑盒的形式為分析神經(jīng)元形態(tài)提供了一種簡(jiǎn)單、可靠、可重復(fù)性好的神經(jīng)浸漬方法，且目前已廣泛用于神經(jīng)研究［3］。

目前基于Golgi-Cox染色原理，已有多種改良創(chuàng)新方法被提出，其中，F(xiàn)D Rapid GolgiStain Kit 的開(kāi)發(fā)，使神經(jīng)形態(tài)的觀察研究更加簡(jiǎn)便［4-6］。李方等［7］通過(guò)多聚甲醛固定組織、縮短浸膠時(shí)間、組織塊外包石蠟殼等實(shí)驗(yàn)調(diào)整，發(fā)現(xiàn)改良Golgi-Cox神經(jīng)元染色法在大鼠腦缺血研究中，染色結(jié)果較恒定，且省時(shí)。馮寶峰等［8］對(duì)固定、切片、脫水和顯色等環(huán)節(jié)進(jìn)行改良后，證明相較于傳統(tǒng)的Golgi-Cox染色方法，該方法更加穩(wěn)定和敏感，為海馬區(qū)神經(jīng)元樹突和樹突棘形態(tài)與結(jié)構(gòu)研究提供了一種可靠的技術(shù)方法。王蕾等［9］比較了冷凍切片、石蠟切片和振動(dòng)切片3 種切片方式對(duì)結(jié)果的影響，并闡述了各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

本研究采用4 種不同的灌注方法后使用相同的固定、染色和顯色液，結(jié)合流程化的商用實(shí)驗(yàn)步驟，進(jìn)行振動(dòng)切片脫水后，再使用明膠包埋的載玻片封片，最后使用光學(xué)顯微鏡成像比較不同灌注方法的腦切片制備效果。探索一種簡(jiǎn)單有效的神經(jīng)標(biāo)記方法，為實(shí)驗(yàn)科研、教學(xué)及神經(jīng)研究提供可選方案。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）動(dòng)物。6-8 周齡C57／BL小鼠4 只，分別編號(hào)為1＃、2＃、3＃、4＃。

（2）試劑。實(shí)驗(yàn)所使用的試劑如表1 所示。

表1 實(shí)驗(yàn)所需試劑

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)前24 h將A＼B液按1∶1混合，在混合時(shí)盡量避免搖晃與碰撞，且避光保存，使用錫紙包覆試管外壁。

（2）灌注。①1＃小鼠斷頸后，不做灌注處理；②2＃、3＃、4＃小鼠均先使用1.5 ml 10%水合氯醛麻醉，然后使用生理鹽水灌流去血；③3＃小鼠使用4%多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）灌注固定；④4＃小鼠用AB混合液灌注。

（3）取材。打開(kāi)小鼠的頭骨，小心取出腦組織。

（4）固定。使用提前配制的AB混合液浸泡24 h后，置換試管中的AB混合液，繼續(xù)浸泡13 d。然后將腦組織轉(zhuǎn)移至C液中室溫避光72 h，首次浸泡24 h后更換C液1 次。具體參見(jiàn)FD Rapid Golgi StainTMKit protocol［6］。

（5）切片和貼片。將腦組織用3%的瓊脂糖包埋后進(jìn)行振動(dòng)切片，切片厚100 和200 μm。載玻片提前用鉀礬明膠包被液進(jìn)行涂布，干燥后，將切好的腦片貼于明膠玻片上，用吸水紙吸干多余的C液。

（6）染色。將D液、E 液與雙蒸餾水以1∶1∶2的體積比混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，然后于混合溶液中10 min；再用雙蒸餾水沖洗切片2 次，每次4 min。

（7）脫水脫脂。使用50%、75%和95%的乙醇梯度脫水，各4 min，再使用無(wú)水乙醇脫水4 次，每次4 min；二甲苯浸泡3 次，每次4 min。

（8）封片。使用中性樹脂封片。

（9）成像。使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 切片性能

圖1 所示為Golgi-Cox 方法的實(shí)驗(yàn)流程。通過(guò)觀察4 種不同灌注方式處理后的小鼠腦組織切片，對(duì)比分析了其在光學(xué)顯微鏡下的神經(jīng)標(biāo)記情況，如圖2、3所示。實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行振動(dòng)切片時(shí)，盡管都經(jīng)過(guò)AB混合液固定，但3＃切片更穩(wěn)定，切片更完整。4＃效果最差，無(wú)法獲得完整切片，將一張100 μm 的切片進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn)，組織破碎嚴(yán)重，幾乎全是非特異性黑色沉積物［圖2（j）］。結(jié)果表明PFA 灌注更有利于切片的完整性。

圖1 Golgi-Cox方法實(shí)驗(yàn)流程

圖2 100 μm厚小鼠腦片的神經(jīng)標(biāo)記結(jié)果 （1＃：斷頸，無(wú)灌注；2＃：麻醉，生理鹽水灌注；3＃：麻醉，生理鹽水、PFA 灌注；4＃：麻醉，生理鹽水、AB混合液灌）

2.2 光學(xué)顯微成像結(jié)果及分析

2.2.1 1＃制備方法

依據(jù)FD Rapid Golgi StainTMKit說(shuō)明書指示，無(wú)需進(jìn)行去血灌注操作，取出腦組織后直接浸泡于AB 混合液中。1＃結(jié)果表明其切片背景呈黑灰色，神經(jīng)元數(shù)量隨著切片厚度增加而增多［見(jiàn)圖2（a）、圖3（a）］。海馬區(qū)呈帶狀排列的神經(jīng)細(xì)胞染色不清晰，無(wú)法有效地區(qū)分出單個(gè)神經(jīng)元的胞體及樹突［見(jiàn)圖2（b）、圖3（b）］。大腦皮層區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的胞體、樹突染色標(biāo)記模糊，樹突相互交錯(cuò)似網(wǎng)狀［見(jiàn)圖2（c）、圖3（c）］。

圖3 200 μm厚小鼠腦片的神經(jīng)標(biāo)記結(jié)果 （1＃：斷頸，無(wú)灌注：2＃：麻醉，生理鹽水灌注；3＃：麻醉，生理鹽水、PFA灌注）

2.2.2 2＃制備方法

在1＃的基礎(chǔ)上，增加了灌流去血的步驟，結(jié)果表明，背景依然呈灰黑色［見(jiàn)圖2（d）、圖3（d）］。因?yàn)榍衅恢玫牟町悾疚恼故玖瞬话ｑR區(qū)域的切片，其內(nèi)部核團(tuán)區(qū)域的顆粒細(xì)胞明顯標(biāo)記［見(jiàn)圖2（e）、圖3（e）］。大腦皮層相較于1＃標(biāo)記清晰，但依然存在與背景無(wú)法明顯區(qū)分的問(wèn)題［見(jiàn)圖2（f）、圖3（f）］。

2.2.3 3＃制備方法

3＃通過(guò)PFA 灌注，在腦組織離體前進(jìn)行固定，取出腦后再在AB 混合液中浸漬，可見(jiàn)背景干凈呈灰白色，于黑色標(biāo)記的神經(jīng)元呈明顯反差［見(jiàn)圖2（g）、圖3（g）］。海馬區(qū)域的神經(jīng)元呈規(guī)則排列，大腦皮層的神經(jīng)元胞體及樹突也被清晰標(biāo)記上［見(jiàn)圖2（h）～圖2（i）、圖3（h）～圖3（i）］。

2.2.4 腦組織結(jié)構(gòu)分析及意義

按照?qǐng)D1 的實(shí)驗(yàn)流程，經(jīng)過(guò)普通光學(xué)顯微鏡成像后，觀察到如圖2、3 中的海馬和大腦皮層結(jié)構(gòu)。海馬在學(xué)習(xí)記憶功能中扮演著重要的角色，且結(jié)構(gòu)相對(duì)較簡(jiǎn)單，適合作為腦模型的重點(diǎn)觀察研究部位。此外，研究發(fā)現(xiàn)海馬的結(jié)構(gòu)功能完整性對(duì)癲癇、阿茲海默癥等相關(guān)精神疾病也尤為重要［10］。海馬結(jié)構(gòu)是由海馬齒狀回和下托三部分構(gòu)成，該區(qū)域細(xì)胞緊密排列，界限明顯，細(xì)胞排列呈帶狀［見(jiàn)圖2（g）］［11］。當(dāng)海馬在更高倍數(shù)下成像后，可以觀察到海馬的主要神經(jīng)元是錐體細(xì)胞，齒狀回則是顆粒細(xì)胞。海馬的皮質(zhì)可分為CA1、CA2、CA3和CA4四部分，可分為分子層（stratum moleculare）、腔隙層（stratum lacunosum）、輻射層（stratum radiatum）、錐體層（stratum pyramidale）和始層（stratum oriens）。齒狀回皮質(zhì)分為分子層、顆粒細(xì)胞層和多形細(xì)胞層3 層，呈馬蹄鐵形。

大腦皮層是人腦的高級(jí)中樞，思考、感知、處理、理解語(yǔ)言信息等過(guò)程都與大腦皮層密切相關(guān)，其主要的功能分區(qū)有感覺(jué)區(qū)、運(yùn)動(dòng)區(qū)、言語(yǔ)區(qū)、聯(lián)合區(qū)。大腦皮層主要有三大細(xì)胞類型：錐體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和梭形細(xì)胞，其中顆粒細(xì)胞最多，錐體細(xì)胞次之。如圖2（i）所示，大腦皮層由淺至深又可以分為6 層：分子層（神經(jīng)元小而少）、外顆粒層（包含星形細(xì)胞和少量錐體細(xì)胞）、外錐體細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層（主要是星形細(xì)胞）、內(nèi)錐體細(xì)胞層、多形細(xì)胞層（以梭形細(xì)胞為主）［12］。

2.2.5 樹突棘結(jié)構(gòu)的觀察

將100 μm的腦片切換到40 倍物鏡下進(jìn)行更高分辨的觀察，可見(jiàn)圖4 中的紅色箭頭所指示的突起狀結(jié)構(gòu)-樹突棘，其密度和形態(tài)表明了參與神經(jīng)可塑性的細(xì)胞過(guò)程，這與學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能相關(guān)，并且在一些神經(jīng)病變中是表現(xiàn)有癥狀的，如智力遲鈍和神經(jīng)退行性疾病。值得注意的是，通過(guò)本研究所建立的實(shí)驗(yàn)方法，在高倍鏡下成功觀察到樹突棘，后期可結(jié)合高分辨的成像技術(shù)及有效的數(shù)據(jù)分析，在不同的動(dòng)物模型或疾病模型中對(duì)樹突棘進(jìn)行結(jié)構(gòu)和數(shù)量的差異分析。樹突棘是由許多類型的神經(jīng)元的樹突突起產(chǎn)生的，主要由一個(gè)稍細(xì)的與樹突小分支相連的棘柄和一個(gè)與棘柄末端相連的終球組成。根據(jù)棘柄和終球的形態(tài)特征可分為三類：纖細(xì)型、蘑菇型和短粗型［13］。樹突棘密度和大小在不同個(gè)體間也是不相同的，一個(gè)神經(jīng)元上也可能出現(xiàn)幾種不同類型的棘突。Nishiyama 等［14］研究發(fā)現(xiàn)樹突棘的結(jié)構(gòu)變化是突觸可塑性的關(guān)鍵，表明樹突棘的形態(tài)和可塑性在神經(jīng)發(fā)育障礙中會(huì)發(fā)生改變。Weir等［15］也報(bào)告了自閉癥病例中樹突棘密度增加。

圖4 100 μm厚小鼠神經(jīng)元樹突棘的標(biāo)記結(jié)果 （紅色箭頭指示的結(jié)構(gòu)為樹突棘）

3 結(jié) 語(yǔ)

本文主要開(kāi)展了基于4 種小鼠腦組織樣品制備方法，探索一種簡(jiǎn)單有效的神經(jīng)標(biāo)記方法的實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)觀察4 種腦切片在光學(xué)顯微鏡下的制備效果，一方面發(fā)現(xiàn)通過(guò)在小鼠麻醉后使用PFA灌流，再取腦組織進(jìn)行AB混合液浸漬所制備的切片背景干凈，神經(jīng)元呈明顯反差，海馬和大腦皮層神經(jīng)結(jié)構(gòu)被標(biāo)記清晰；同時(shí)還對(duì)切片進(jìn)行了高倍成像，證明該樣品制備方法也能為樹突棘結(jié)構(gòu)的研究提供參考。然而，對(duì)于海馬及大腦皮層的細(xì)胞類型和樹突棘的類型，需要進(jìn)一步進(jìn)行更高分辨率的成像。

綜上，本文基于該商業(yè)化的試劑盒，結(jié)合前期有效的生物樣品處理方式及后期脫水、包埋等實(shí)驗(yàn)步驟，探索了一套簡(jiǎn)便，快捷的神經(jīng)標(biāo)記方法，為教學(xué)、實(shí)驗(yàn)科研及神經(jīng)研究提供可選方案，使神經(jīng)研究在基礎(chǔ)設(shè)施有限的實(shí)驗(yàn)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)教學(xué)中也能高效進(jìn)行。