張兆文 ， 周桂強 ， 柳先進 ， 郭 玲 ， 荊云濤， 臧宇航 ， 丁桂榮

(1.空軍軍醫(yī)大學 軍事預防醫(yī)學系輻射防護醫(yī)學教研室， 西安 710032； 2.萊州市人民醫(yī)院， 煙臺 261400)

0 引言

近年來，第五代(Fifth generation，5G)移動通信得到迅猛發(fā)展。工信部發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，截至2022年底，我國三大手機運營商累計將建成231.2萬個5G基站。5G手機通信的普及以及相應(yīng)基站數(shù)量的迅猛增長，使得生活環(huán)境中5G手機射頻輻射(radio frequence radiation，RFR)的強度不斷增加[1]，其對人體健康的影響也受到人們的廣泛關(guān)注。既往研究顯示，睪丸是電磁輻射的敏感器官[2]。據(jù)報道，900 MHz的手機輻射可導致大鼠睪丸曲精小管排列紊亂，精原細胞數(shù)量減少和精子的凋亡[3]。姚斌偉等[4]研究發(fā)現(xiàn)，電磁波暴露會導致大鼠精子活力降低。Pandey等[5]觀察到2G移動電話RFR全身暴露可抑制小鼠精子的發(fā)生。截至目前，關(guān)于手機信號RFR對雄性生殖健康影響的報道多集中于5G通信之前的信號頻段。因此，在本實驗，我們重點觀察了3.5 GHz(5G通信頻段)手機RFR對睪丸結(jié)構(gòu)和精子發(fā)生的影響，以期為5G手機RFR對生殖健康的評估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性C57BL/6的小鼠(體重21.5±2.2 g)，自購于空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心(中國西安)，在標準飼養(yǎng)條件中飼養(yǎng)(循環(huán)通風；溫度，23±2℃；濕度，50%±2%；12 h光照，12 h黑暗)，小鼠可隨時進食和飲水。本研究中所有的動物實驗均經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(中國西安)動物福利委員會批準(批準號：IACUC-20220123)。

1.2 RFR暴露條件及分組

RFR暴露系統(tǒng)由信號發(fā)生器、輻射天線和放大器三部分組成。信號發(fā)生器為Keysight N5171B(是德科技，美國)；功放器型號為波恩BLMA0860-100(BONE，德國)；天線為新加騰XJT-DR10180(西安新佳滕，中國)為雙脊喇叭天線，天線對角長度D為280 mm。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為假暴露組(Sham)和3.5 GHz RFR暴露組(3.5 GHz組)，每組12只。將小鼠放在有機玻璃盒內(nèi)，置于RFR遠場區(qū)域(距離天線大約70 cm)。盒子周圍有小孔，小鼠可自由呼吸。3.5 GHz組小鼠全身連續(xù)暴露于3.5 GHz RFR 35 d，每天1 h，峰值功率密度(power density，PD)為50 W/m2，全身平均比吸收率(specific absorptionratio，SAR)為3.6 W/Kg。Sham組小鼠所處環(huán)境無RFR輸出，其余處理方式與3.5 GHz組相同。

1.3 小鼠血清采集和組織取樣

在連續(xù)暴露35 d后，小鼠用1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉。小鼠經(jīng)心臟左心室采血，室溫靜置0.5 h后離心機離心(4℃，3000 rpm，15 min)，收集上層血清用于性激素檢測。取出12只小鼠的雙側(cè)睪丸稱重，并計算小鼠的睪丸系數(shù)(睪丸重量(g)/體質(zhì)量(g)× 100%)9只小鼠的睪丸凍存于-80℃待用，3只小鼠雙側(cè)睪丸用Bouin’s液(北京雷根公司)固定，檢測睪丸組織形態(tài)；將雙側(cè)附睪尾剪切后置于精子培養(yǎng)液中，游離出精子后檢測精子的質(zhì)量。

1.4 小鼠精子數(shù)量及畸形率分析

在12孔板各孔中加入1 mL 37℃預熱的精子培養(yǎng)液。將小鼠雙側(cè)附睪尾豎剪3次，放入精子培養(yǎng)基中，在37℃孵箱內(nèi)搖床緩慢搖動，40 min后取出，將精子懸液稀釋至合適濃度后沖入一次性尿沉渣計數(shù)板(BMJ Ventures Inc，加拿大)，在光學顯微鏡下(Leica，德國)計數(shù)；將精子懸液均勻涂在載玻片上并自然風干，放入預冷的丙酮中固定20 min，自然風干后浸泡于2%伊紅溶液中30 min進行染色。在光學顯微鏡下觀察約500個完整精子的形態(tài)，以計算精子畸形率。精子畸形類型包括無定形、無鉤、雙頭、雙體或頸、尾折疊。

1.5 小鼠精子存活率和凋亡率分析

各組小鼠精子懸液樣本經(jīng)1000 rpm離心5 min，棄去上清液后，采用Annexin V-FITC/PI雙標法進行染色，室溫孵育30 min，PBS洗滌后用流式細胞儀檢測精子的存活率和凋亡率，每組5個樣本。在流式圖中，B1象限表示精子壞死率；B2象限表示精子晚期凋亡率；B3象限表示精子存活率，B4象限表示精子早期凋亡率。

1.6 小鼠睪丸組織HE染色

小鼠睪丸經(jīng)Bouin’s液固定24 h后，流水沖洗3 h，用脫水機(LeicaTP1020，德國)脫水，生物組織包埋機(宏業(yè)BM-IX，中國)進行石蠟包埋，然后用旋轉(zhuǎn)切片機(LeicaRM2135，德國)切片，厚度為5 μm。切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟、復水后進行HE染色。

1.7 伊文思藍熒光實驗

在取材前的 1 h，在尾靜脈注射固定器輔助下給予小鼠尾靜脈注射 2%伊文思藍(生理鹽水配制)，劑量為 4 mL/kg。在體內(nèi)循環(huán) 1 h 后，對小鼠進行麻醉。取出睪丸后，放入包埋盒內(nèi)并加入最佳切割溫度(optimal cutting temperature，O.C.T)包埋劑包埋組織，避光凍存于-80℃冰箱。對睪丸進行冰凍切片，切片厚度為8 μm，貼片后直接在熒光顯微鏡下觀察伊文思藍(Evans blue，EB)的滲出情況，采用 EB 的累積熒光強度反映視野內(nèi) EB 的滲出總量。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

使用ELISA試劑盒(北京華英生物)測定小鼠血清中性激素水平，包括睪酮(testosterone，T)、促卵泡激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)和促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)，具體步驟參照說明書進行。

1.9 蛋白免疫印跡(western blot)

使用凱基生物全蛋白提取試劑盒對小鼠睪丸組織進行全蛋白提取，BCA法測定蛋白濃度后，使用10%的SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后用脫脂牛奶封閉，隨后加入以下一抗4℃過夜：Anti-β-actin (CMCTAG，美國，1∶5000)；Anti-β-tubulin(Affinity，中國，1∶5000)；Anti-ZO-1(Proteintech，中國，1∶1000)；Anti-Occludin(Proteintech，中國，1∶2000)；Anti-GDNF(Abcam，英國，1∶1000)；Anti-SCF(SAB，美國，1∶1000)。第二天復溫30 min，與相應(yīng)種屬的二抗(CWBIO，中國，1∶5000，)室溫下孵育2 h，使用電泳成像儀(Bio-Rad，意大利)進行發(fā)光，并用ImageJ分析條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差(SD)表示，符合條件的計量資料使用GraphPad Prism 8.2軟件對組間進行兩個獨立樣本t進行檢驗并作圖；P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3.5 GHz RFR對小鼠一般健康狀況的影響

如圖1所示，與Sham組相比，3.5 GHz組小鼠體重和睪丸系數(shù)的變化均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。提示，3.5 GHz RFR對小鼠的一般健康狀況無明顯影響。

圖1 3.5 GHz RFR連續(xù)暴露35 d對小鼠一般健康狀況的影響(A)體重；(B)睪丸系數(shù)。數(shù)據(jù)表示為Mean±SD，n=12

2.2 3.5 GHz RFR對小鼠精子質(zhì)量的影響

如圖2所示，與Sham組相比，3.5 GHz 組小鼠精子數(shù)量和精子畸形率無明顯變化(P>0.05)。提示，3.5 GHz手機RFR對小鼠精子數(shù)量和畸形率無影響。

圖2 3.5 GHz RFR連續(xù)暴露35 d對小鼠精子數(shù)量和畸形率的影響(A)精子數(shù)量；(B)精子畸形率。數(shù)據(jù)顯示為Mean±SD，n=10

如圖3所示，與Sham組相比，3.5 GHz組小鼠成熟精子存活率、總凋亡率、早期凋亡率和晚期凋亡率均無明顯差異。提示3.5 GHz RFR不能誘導小鼠精子凋亡的發(fā)生。

圖3 3.5 GHz RFR連續(xù)暴露35 d對小鼠精子存活率和凋亡率的影響(A)精子細胞流式圖；(B)精子存活率；(C)精子總凋亡率；(D)精子早期凋亡率；(E)精子晚期凋亡率。數(shù)據(jù)顯示為Mean±SD，n=5

2.3 3.5 GHz RFR對小鼠睪丸組織形態(tài)的影響

睪丸HE染色結(jié)果如圖4所示，兩組小鼠的睪丸組織生精上皮基膜完整，生精小管及間質(zhì)組織結(jié)構(gòu)正常，生精小管內(nèi)各級生精細胞排列整齊、層次清楚，管腔內(nèi)有大量成熟精子。與Sham組相比，3.5 GH組小鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯變化。提示，3.5 GHz手機RFR對小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)無明顯影響。

圖4 3.5 GHz RFR連續(xù)暴露35 d對小鼠睪丸睪丸組織的影響(A)睪丸組織HE染色結(jié)果(標尺 = 100 μm)，n = 3；(B)生精小管直徑；(C)生精上皮厚度

2.4 3.5 GHz RFR對小鼠血睪屏障通透性的影響

伊文思藍熒光顯色結(jié)果如圖5所示，兩組生精小管內(nèi)均無明顯伊文思藍滲出；Western blot檢測結(jié)果如圖6所示，與Sham組相比，3.5 GHz組睪丸中血睪屏障(Blood-testis Barrier，BTB)緊密連接蛋白(Zona Occludens 1，ZO-1)、Occludin和Connexin 43蛋白表達水平均無明顯改變(P>0.05)。提示，3.5 GHz手機RFR對小鼠BTB通透性無明顯影響。

圖5 3.5 GHz RFR連續(xù)暴露35 d對小鼠血睪屏障通透性的影響伊文思藍熒光顯色法檢測結(jié)果，標尺 = 100 μm

圖6 3.5 GHz RFR連續(xù)暴露35 d對小鼠血睪屏障緊密連接相關(guān)蛋白的影響(A)Western Blot 代表性條帶；(B)ZO-1灰度值；(C)Occludin灰度值；(D)Connexin 43灰度值。數(shù)據(jù)顯示為Mean±SD，n =3

2.5 3.5 GHz RFR對小鼠血清性激素的影響

如圖7所示，與Sham組相比，3.5 GHz組小鼠血清LH和FSH的含量均明顯上升(P<0.01，圖7B和7C)，血清GnRH和T含量均顯著降低(P<0.01，圖7A和7D)。提示，3.5 GHz手機RFR可致小鼠血清性激素水平紊亂。

圖7 3.5 GHz RFR連續(xù)暴露35 d對小鼠血清性激素含量的影響(A)GnRH濃度；(B)LH濃度；(C)FSH濃度；(D)T濃度。數(shù)據(jù)顯示為Mean±SD，**P< 0.01，與Sham組相比，n=7

2.6 3.5 GHz RFR對小鼠睪丸支持細胞分泌功能的影響

Western Blot檢測睪丸組織中干細胞因子(Stem Cell Factor，SCF)和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor，GDNF)蛋白水平結(jié)果顯示，與Sham組相比，3.5 GHz組小鼠睪丸SCF和GDNF相對表達量無明顯變化(P>0.05)，如圖8所述。上述結(jié)果提示，3.5 GHz手機RFR對小鼠睪丸支持細胞分泌功能無明顯影響。

圖8 3.5 GHz RFR連續(xù)暴露35 d對小鼠支持細胞分泌功能的影響(A)Western Blot代表性條帶圖；(B)SCF灰度值；(C)GDNF灰度值。數(shù)據(jù)顯示為Mean±SD，n=3

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，在全球范圍內(nèi)不孕不育癥影響了約18%的育齡夫婦，其中男性原因占50%。流行病學調(diào)查結(jié)果提示，手機RFR對人類生殖健康可能產(chǎn)生不利影響。芬蘭一項針對344名前往醫(yī)院就診的不孕不育癥患者的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，使用手機十年以上男性的精子活力顯著下降，精子畸形率顯著升高[6]。Zhang等[7]對1634名在中國浙江大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖內(nèi)分泌科接受精液檢查的男性進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)每天使用手機可能會對精子活力產(chǎn)生負面影響，并損害男性生育能力。

研究人員針對4G、3G和2G頻段手機的潛在健康危害，包括對雄性生殖健康的影響開展了大量實驗室研究，遺憾的是，由于各種原因，并未獲得一致性結(jié)論。Kumar等[8]將雄性Wistar大鼠暴露于1.9 GHz RFR后發(fā)現(xiàn)大鼠精子數(shù)量、生精小管直徑、睪丸重量顯著降低，DNA單鏈斷裂和MDA水平明顯增加。Singh等[9]報道，暴露于1966.1 MHz的手機RFR可誘發(fā)大鼠睪丸氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。然而，也有研究顯到手機RFR暴露對雄性生殖系統(tǒng)無明顯影響，如Jonj等[10]將雄性SD大鼠暴露于2.1 GHz手機RFR后大鼠體重、體溫、精子數(shù)量和睪丸組織形態(tài)均未見明顯變化。目前，有關(guān)5G手機RFR對生殖系統(tǒng)的影響鮮有報導。

精子質(zhì)量是評價雄性生殖健康的重要指標之一，在本實驗中，我們首先通過檢測精子數(shù)量、畸形率、存活率等觀察了3.5 GHz手機射頻輻射對精子質(zhì)量的影響，結(jié)果顯示本實驗條件下，手機射頻輻射對精子質(zhì)量無影響。這與Jonj等[10]的研究結(jié)果一致。后者將SD雄性大鼠暴露于2.1 GHz手機RFR 1個月，精子質(zhì)量未發(fā)生改變。睪丸組織正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)和BTB完整性對精子發(fā)生至關(guān)重要[11]。為了明確5G手機RFR對小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)影響，我們使用HE染色觀察小鼠睪丸組織形態(tài)，伊文思藍顯色法觀察小鼠BTB完整性，并使用Western Blot檢測與BTB緊密連接相關(guān)蛋白(ZO-1、Occludin和Connexin 43)水平，結(jié)果顯示，兩組小鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯變化，生精小管內(nèi)均無伊文思藍滲出，緊密連接相關(guān)蛋白的含量無明顯變化。提示，3.5 GHz手機RFR連續(xù)暴露35 d對小鼠睪丸組織形態(tài)和BTB完整性無明顯影響。Ma等[12]研究發(fā)現(xiàn)手機RFR會影響睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)。他們將成年雄性SD大鼠暴露于900 MHz手機RFR(功率密度100 mW/cm2，SAR值為1.22 W/kg)，可導致大鼠的精母細胞結(jié)構(gòu)明顯疏松，各級生精細胞層數(shù)減少。但是也有實驗表明，手機RFR不會損傷睪丸的組織形態(tài)。Yan等[13]將雄性C57BL/6小鼠暴露于2.0 GHz手機RFR中(功率密度1 W/cm2，SAR值為0.08 W/kg)，小鼠睪丸組織形態(tài)無明顯改變。Yu等[14]的研究表明，890～915 MHz手機RFR(功率密度2.4 W/cm2，SAR值為0.6 W/kg)可致成年SD大鼠BTB完整性受到損傷。關(guān)于手機RFR對睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響目前尚無一致性的結(jié)論，可能是各實驗室的暴露裝置、實驗參數(shù)、實驗體系不一致造成的。

下丘腦-垂體-性腺(Hypothalamic-Pituitary-Gonadal，HPG)對精子發(fā)生有重要的調(diào)控作用[15]。我們用ELISA試劑盒測定血清中性激素的含量，發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)過3.5 GHz手機RFR連續(xù)暴露35 d后血清GnRH和T含量明顯降低，F(xiàn)SH和LH含量升高。提示，3.5GHz手機輻射可擾亂性激素水平。Eskander等[16]對682名14～60歲的志愿者進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)暴露于手機或基站RFR的人群血清T水平顯著下降。Oyewopo等[17]發(fā)現(xiàn)800 MHz手機RFR可引起大鼠血清中的FSH、LH、T含量顯著降低。Shahin等[18]發(fā)現(xiàn)暴露于1800 MHz手機RFR，小鼠血清中T含量顯著降低。這些研究表明，RFR會引起血清中性激素水平的變化，但也有報道，手機RFR暴露后動物血清性激素無明顯變化。?etkin等[19]發(fā)現(xiàn)暴露于890～915 MHz的手機RFR中，大鼠的血液中的FSH、LH、T含量均無變化。支持細胞被認為是生精上皮的支持結(jié)構(gòu)，也是生精小管內(nèi)唯一的體細胞，它不僅為生精細胞提供支架，還可以通過分泌GDNF和SCF直接調(diào)節(jié)精原干細胞的增殖和分化。為了明確3.5 GHz手機RFR是否造成小鼠睪丸支持細胞分泌功能的變化，我們檢測了睪丸中GDNF和SCF的含量，結(jié)果顯示兩者含量均無明顯改變，提示，3.5 GHz手機RFR對小鼠睪丸支持細胞分泌功能無明顯影響。有文獻指出，垂體分泌的性激素FSH可以調(diào)控睪丸支持細胞的分泌功能[20]，但在本實驗中，血清FSH的含量顯著升高，但是睪丸內(nèi)支持細胞的分泌GDNF和SCF的功能無明顯變化，RFR暴露導致的血清FSH水平改變是否會影響睪丸支持細胞對其他因子的分泌尚不清楚。

4 結(jié)論

綜上說明，3.5 GHz手機RFR(50 W/m2)連續(xù)暴露35 d對小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)和精子數(shù)量和畸形率無顯著影響，但可導致性激素水平紊亂。關(guān)于性激素水平紊亂的機制以及對雄性生殖的影響有待進一步研究。