馬麗貞， 梁夢蕊， 鄒 勇， 智維佳， 喬 楠， 王 陽， 胡向軍， 王麗峰

(軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850)

0 引言

微波是一種高頻電磁波，隨著經(jīng)濟(jì)與科學(xué)發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于科研、醫(yī)療、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域，因而成為新的環(huán)境污染源而倍受各國學(xué)者的廣泛關(guān)注[1-2]。有研究表明，微波輻射最敏感靶位之一是腦組織，即微波輻射可以引起學(xué)習(xí)和記憶能力的改變，其效應(yīng)主要表現(xiàn)在空間學(xué)習(xí)和記憶障礙，但其具體機(jī)制尚不明確[3-4]。目前，關(guān)于微波輻射生物效應(yīng)的研究，大多采用單一波段微波照射，而人類真實生活與工作環(huán)境中，往往是多種頻率電磁波的復(fù)合暴露[5]。近年來陸續(xù)開展了微波復(fù)合暴露的生物學(xué)效應(yīng)研究：Tan S Z和Zhu R Q等研究發(fā)現(xiàn)，S波段和L波段平均功率密度5 mW/cm2或10 mW/cm2微波復(fù)合暴露6 min對Wistar大鼠認(rèn)知和記憶功能的影響，較單一波段微波暴露明顯[6-7]；朱睿卿等發(fā)現(xiàn)，平均功率密度5 mW/cm2或10 mW/cm2的L和C波段微波復(fù)合暴露大鼠6 min，可致認(rèn)知功能損傷及海馬組織結(jié)構(gòu)損傷、能量代謝改變，且損傷與輻射劑量成正比，復(fù)合暴露重于單一暴露[8]。姚傳福等采用平均功率密度為3 mW/cm2或15 mW/cm2的X和S波段微波復(fù)合照射C57BL/6N小鼠6 min，發(fā)現(xiàn)微波復(fù)合暴露可造成機(jī)體免疫功能紊亂，且與復(fù)合暴露劑量呈正相關(guān)[9]；董霽等發(fā)現(xiàn)，平均功率密度為10 mW/cm2的S和X波段微波連續(xù)復(fù)合暴露大鼠30 d，外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量減少、免疫球蛋白和補(bǔ)體的水平降低，并造成胸腺和脾臟組織結(jié)構(gòu)損傷，但于輻射后7 d逐步恢復(fù)[10]。盡管關(guān)于微波復(fù)合暴露生物效應(yīng)影響的研究已有一些報道，但微波生物效應(yīng)與其功率密度、頻率、波形、調(diào)制和暴露持續(xù)時間有關(guān)，不同種類的微波引起的效果可能不同，復(fù)合效應(yīng)也會存在差異。本研究以Wistar大鼠為實驗對象，運(yùn)用行為學(xué)和病理學(xué)等相關(guān)實驗技術(shù)，探索L和C波段微波復(fù)合暴露致大鼠突觸結(jié)構(gòu)和認(rèn)知功能的影響，從而為評估微波復(fù)合暴露的安全性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

二級雄性Wistar大鼠128只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體重180～200 g。隨機(jī)分為L波段微波暴露組(L組)、C波段微波暴露組(C組)、微波復(fù)合暴露組(C+L組)和假輻射組(Sham組)，每組32只。

1.2 微波輻射方法

大鼠固定于照射圓盤內(nèi)，分別采用L(1.5 GHz)或C波段(4.3 GHz)脈沖微波單獨照射以及L和C波段脈沖微波復(fù)合照射，平均功率密度均為30 mW/cm2，暴露時長均6 min。假輻射組大鼠采取相同處理，但不開啟照射源。

1.3 Morris水迷宮

照射前兩天利用水迷宮實驗篩選大鼠，淘汰不適合游泳的大鼠，最終保證每組15只大鼠進(jìn)行水迷宮實驗。將水迷宮實驗箱體劃分為一、二、三和四象限，每個象限的中點為大鼠的入水點，池壁周圍粘貼顏色與形狀不同的4個圖案標(biāo)記，分別為紅三角形、綠圓形、白四邊形與黃六邊形。逃生平臺直徑約10 cm，高度19 cm，放置在第一象限，具體定位在水池中心與第一象限池壁中點的連線中點處，平臺隱匿于水下1.5 cm處。實驗過程中水溫保持在23±2℃，水池以遮光布圍住，圖像采集攝像頭位于水池正上方，防止周圍環(huán)境的變動和實驗人員走動對于實驗動物的影響。實驗大鼠在照后0～4 d，進(jìn)行水迷宮定位航行實驗，每只實驗大鼠分別從水迷宮池壁選定的四個象限入水點處入水，在每個象限的探索時長為60 s，軟件記錄大鼠在60 s內(nèi)找到平臺的時間，即平均逃避潛伏期，找到平臺后，保持大鼠在平臺上停留15 s，若大鼠在入水后60 s內(nèi)未能成功找到水下平臺，則人為引導(dǎo)其至平臺，學(xué)習(xí)15 s。照射后6 d進(jìn)行水迷宮空間探索實驗。將水下的隱匿平臺撤除，其余條件保持不變，將實驗大鼠從實驗箱體的第三象限(即原平臺所在象限的對側(cè)象限)放入水中，以軟件記錄下大鼠在30 s時間內(nèi)穿越原平臺象限的次數(shù)與原平臺象限的時間比。

1.4 曠場和高架十字迷宮實驗

曠場實驗設(shè)備由100 cm×100 cm×40 cm(長×寬×高)不透明黑色開放箱體構(gòu)成，實驗過程中以遮光布圍住四周。在電腦上將曠場底部劃分為9個正方形小格，中心方格為中心區(qū)，周圍8個小方格為周圍區(qū)。每只實驗動物的測試時間為5 min。實驗大鼠于照后6 h開始曠場實驗。捏住大鼠尾巴根部2/3處將大鼠放置在中心區(qū)，記錄5 min內(nèi)大鼠的中心區(qū)路程、周圍區(qū)路程、抬頭次數(shù)(后肢垂直站立計入抬頭次數(shù))、糞便顆粒數(shù)。每只實驗動物完成該行為學(xué)檢測后，以75%酒精擦拭實驗敞箱，防止該只大鼠氣味殘留，造成對后續(xù)實驗動物的影響。

高架十字迷宮由距離地面70 cm的中央平臺、兩個開放臂和兩個閉合臂組成。高架地板面用不透明布遮蓋，防止因反光增加實驗動物恐懼感。實驗員距離高架設(shè)備1米以上，防止干擾實驗結(jié)果。照后3 d進(jìn)行高架十字迷宮實驗。將實驗大鼠從中央?yún)^(qū)面朝開放臂放入設(shè)備，記錄5 min內(nèi)大鼠在閉合臂與開放臂的時間。每只實驗動物完成該行為學(xué)檢測后，用75%酒精擦拭實驗箱架，防止大鼠殘留氣味，影響后續(xù)實驗動物。

1.5 Golgi染色

輻射后6 h、7 d、14 d和1個月，每組隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行實驗。采用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠后斷頭，冰上操作剝離腦組織。①浸液：立即將取出的腦組織浸入1∶1混合的Golgi染色A、B試劑中，腦組織在AB混合液中固定2～3周后取出，換至C液再次固定，時間不超過1周，全程避光操作。②冰凍切片：提前將冰凍切片機(jī)預(yù)冷>2 h，將腦組織從C液取出后進(jìn)行快速冰凍，隨后以冰凍包埋劑(Tissue Freezing Medium，OCT)將腦組織固定在樣品托(無需OCT包埋腦組織)進(jìn)行冰凍，切片溫度-23℃，根據(jù)腦組織的情況適當(dāng)調(diào)整，切片厚度100 μm。腦片固定在載玻片后立即滴加C液，防止干片，隨后以濾紙吸干周圍多余液體，切片盒常溫避光保存。③染色：雙蒸水潤洗切片2次，5 min/次；Solution D∶Solution E∶ddH2O=1∶1∶2(現(xiàn)用現(xiàn)配)使切片重新水化，時長10 min，期間以玻璃棒不斷攪拌；雙蒸水潤洗2次，4 min/次，以膠頭滴管滴加防脫片；梯度(50%、75%、95%、100%)酒精脫水，每個梯度脫水4 min；二甲苯透明3次，4 min/次；中性樹脂膠封片；晾干后，用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，采集不同分組染色圖。④圖像分析：采用Image J軟件分析大鼠海馬樹突棘數(shù)量及蘑菇狀樹突棘所占比例。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 微波輻射對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

在照射前2 d及照射后0～4 d的Morris水迷宮定位航行實驗中，與Sham組和C+L組相比，L組大鼠在微波暴露后2 d平均逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，其余各組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，如圖1A所示。照后6 d的Morris水迷宮空間探索實驗結(jié)果顯示，各組間大鼠穿越平臺次數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，如圖1B所示。

圖1 微波復(fù)合暴露后大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果A：照射前2 d及照射后0～4 d，Morris水迷宮定位航行實驗平均逃避潛伏期，其中-1 d表示照射前1 d，-2 d表示照射前2 d，0～4 d表示照射后0～4 d；B：照射后6 d，Morris水迷宮空間探索實驗穿越平臺次數(shù)

2.2 微波輻射對大鼠情緒的影響

2.2.1 曠場實驗

微波暴露后6 h曠場實驗結(jié)果顯示，與Sham組相比，C組大鼠在中央?yún)^(qū)的探索時間和探索路程無顯著差異(P>0.05)，L組、C+L組大鼠在中央?yún)^(qū)的探索時間和探索路程顯著延長(P<0.05)；與C組相比，C+L組大鼠在中央?yún)^(qū)探索時間也顯著延長(P<0.05)，如圖2A和圖2B所示。各組間大鼠探索總路程無顯著差異(P>0.05)，如圖2C所示。結(jié)果提示，平均功率密度為30 mW/cm2的L波段單獨暴露與L和C波段復(fù)合暴露6 min，可降低大鼠焦慮程度。

圖2 微波復(fù)合暴露后大鼠曠場實驗結(jié)果A：中央?yún)^(qū)探索時間；B：中央?yún)^(qū)探索路程；C：探索總路程

2.2.2 高架十字迷宮實驗

微波暴露后3 d高架十字迷宮實驗結(jié)果顯示，與Sham組相比，C組大鼠在開放臂停留時間顯著延長(P<0.05)，L組與C+L組均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，如圖3所示。

圖3 微波復(fù)合暴露后大鼠高架十字迷宮實驗結(jié)果

2.3 微波輻射對大鼠海馬樹突棘可塑性的影響

2.3.1 微波暴露后海馬錐體細(xì)胞樹突棘密度與蘑菇狀樹突比例改變

由圖4A和4B可知，與Sham組相比，照射后6 h、7 d、14 d和1個月，C組和C+L組海馬錐體細(xì)胞樹突棘密度均無顯著差異(P>0.05)；L組海馬錐體細(xì)胞樹突棘密度僅在照射后14 d顯著降低(P<0.01)。由圖4C可知，與Sham組相比，C組海馬錐體細(xì)胞蘑菇狀樹突棘占比在照射后6 h顯著升高(P>0.05)，照射后7 d、14 d和1個月均無顯著差異(P>0.05)；L組海馬錐體細(xì)胞蘑菇狀樹突棘占比在照射后7 d顯著降低(P>0.05)，照射后6 h、14 d和1個月均無顯著差異(P>0.05)；C+L組在照射后6 h和7 d海馬錐體細(xì)胞蘑菇狀樹突棘占比均無顯著差異(P>0.05)，照射后14 d和1個月錐體細(xì)胞蘑菇狀樹突棘占比顯著升高(P<0.01或P<0.05)。

圖4 微波復(fù)合暴露對海馬錐體細(xì)胞樹突棘的影響A：海馬錐體細(xì)胞樹突棘形態(tài)；B：樹突棘密度；C：蘑菇狀樹突棘比例

2.3.2 微波暴露后海馬顆粒細(xì)胞樹突棘密度與蘑菇狀樹突比例改變

由圖5A和5B可知，與Sham組相比，C組海馬顆粒細(xì)胞樹突棘密度在照射后6 h和1個月顯著升高(P<0.05)，照射后7 d和14 d均無顯著差異(P>0.05)；L組海馬顆粒細(xì)胞樹突棘密度僅在照射后7 d極顯著降低(P<0.01)，照射后6 h、14 d和1個月均無顯著差異(P>0.05)；照射后6 h、7 d、14 d和1個月，C+L組海馬顆粒細(xì)胞樹突棘密度均無顯著差異(P>0.05)。由圖5C可知，與Sham組相比，C組和L組海馬顆粒細(xì)胞蘑菇狀樹突棘占比在照射后14 d顯著升高(P<0.01)，照射后6 h、7 d和1個月均無顯著差異(P>0.05)；C+L組在照射后6 h海馬顆粒細(xì)胞蘑菇狀樹突棘占比顯著降低(P<0.05)，照射后14 d顆粒細(xì)胞蘑菇狀樹突棘占比顯著升高(P<0.05)，照射后7 d和1個月均無顯著差異(P>0.05)。

圖5 微波輻射對海馬顆粒細(xì)胞樹突棘的影響A：海馬顆粒細(xì)胞樹突棘形態(tài)；B：樹突棘密度；C：蘑菇狀樹突棘比例

3 討論

研究表明，腦組織是微波輻射最為敏感的靶器官之一，一定劑量的微波對腦的損傷主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能損傷。海馬是哺乳類動物學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，微波輻射致海馬損傷常表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能障礙，但微波輻射引起突觸可塑性損傷、學(xué)習(xí)記憶能力下降等功能障礙的原因尚未完全闡明，且目前相關(guān)研究多集中于某一波段微波的單獨暴露。

Morris水迷宮廣泛應(yīng)用于評估空間學(xué)習(xí)記憶等功能[11-13]。研究表明，一定劑量的微波照射后大鼠平均逃避期顯著延長[14-15]，也有研究顯示，微波輻射不影響大鼠的平均逃避潛伏期，安廣洲等[11]發(fā)現(xiàn)亞納秒瞬態(tài)電磁脈沖對SD大鼠水迷宮實驗中的平均逃避潛伏期和目標(biāo)象限百分比沒有影響。朱睿卿等研究發(fā)現(xiàn)10 mW/cm2的L和C波段微波單一及復(fù)合輻射后大鼠AEL延長，大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶水平下降[5]。本研究結(jié)果顯示，平均功率密度為30 mW/cm2的L波段和C波段微波單獨/復(fù)合暴露6 min對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力無顯著影響。

曠場實驗用于評價實驗動物處于新環(huán)境中的自主行為、探究行為以及緊張度，以中央?yún)^(qū)探索時間百分比評價大鼠焦慮情緒，中央?yún)^(qū)探索時間越短，焦慮情緒越嚴(yán)重。高架十字迷宮可評價嚙齒類動物焦慮樣情緒與焦慮樣行為，設(shè)備由開放臂與閉合臂兩部分組成，大鼠在開放臂時，表示好奇天性戰(zhàn)勝恐懼心理，即焦慮情緒不嚴(yán)重；在閉合臂時，表示恐懼心理戰(zhàn)勝好奇天性，焦慮程度較高[17-18]。Rakesh (2008年)發(fā)現(xiàn)2450 MHz長期非熱微波暴露后，大鼠在高架十字迷宮中心區(qū)的時間顯著增加[19]。林丹等發(fā)現(xiàn)，功率密度為10 mW/cm2的1～6 GHz多頻復(fù)合微波輻射照射1周后可導(dǎo)致小鼠發(fā)生焦慮樣行為，而1 mW/cm2或5 mW/cm2的1～6 GHz多頻復(fù)合微波照射未引發(fā)小鼠焦慮樣行為[20]。孫立君等將小鼠分別暴露于高頻電磁輻射箱(頻率為3 GHz，SAR值為4 W/kg，4 h/d)1 d、3 d和7 d后發(fā)現(xiàn)，持續(xù)高頻電磁輻射可時間依賴地導(dǎo)致小鼠焦慮樣-抑郁樣行為，當(dāng)SAR值為8 W/kg時，各項行為學(xué)指標(biāo)出現(xiàn)了非規(guī)律性、無法解釋的改變[21]。研究表明，長期接受微波暴露的小鼠可能存在焦慮樣情緒加重的情況，接受短期微波暴露的動物，焦慮樣情緒改變結(jié)果差異大，表現(xiàn)為無焦慮樣情緒改變、焦慮樣情緒增加或降低等。本研究采用曠場和高架十字迷宮實驗檢測微波照射后大鼠焦慮樣情緒變化。曠場實驗顯示，L組、C+L組大鼠的中央?yún)^(qū)探索時間和路程顯著延長，高架十字迷宮結(jié)果顯示，C組大鼠在開放臂滯留時間百分比顯著上升；提示大鼠在C波段或L波段微波單獨/復(fù)合暴露后，焦慮情緒出現(xiàn)不同程度的降低，且對新事物的探究增加。與以往研究結(jié)果存在一定的差異，主要與使用的暴露系統(tǒng)頻率或信號、暴露方式、動物吸收的能量和遺傳背景等有關(guān)[22]，其機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，不同區(qū)域由不同的神經(jīng)元構(gòu)成，其中海馬CA1與CA3區(qū)主要分布有錐體細(xì)胞，海馬DG區(qū)主要分布有顆粒細(xì)胞。樹突分枝的棘狀凸起成為樹突棘，是神經(jīng)元間形成突觸的重要部位。對于哺乳類動物的學(xué)習(xí)與記憶過程，樹突棘的形態(tài)與形成脫落等現(xiàn)象均可認(rèn)為與突觸可塑性密切相關(guān)[23]。樹突棘的典型形態(tài)由末端樹突棘頭部與連接樹突的頸部構(gòu)成。樹突棘的發(fā)育共可分為以下四個階段：發(fā)育前體/絲狀偽足型、細(xì)長型、斷株型和成熟蘑菇型。其中成熟蘑菇型樹突棘異于其他三個類型的突出特征，具有大約0.8 μm長的頸部。

樹突棘的形態(tài)變化與分布差異對于學(xué)習(xí)記憶形成與功能性維持具有重要意義，是突觸可塑性中結(jié)構(gòu)可塑性的關(guān)鍵。由海馬區(qū)傳入一定刺激所引起的長時程增強(qiáng)過程中存在樹突棘密度增加、樹突棘頭部增大等現(xiàn)象[23]。過度的刺激同樣會造成樹突棘萎縮等損傷。刺激與突觸可塑性相互作用，各種行為會刺激樹突棘可塑性，而樹突棘結(jié)構(gòu)的變化同樣可以反作用于行為發(fā)生，從而影響哺乳類動物行為[24-25]。已有研究表明，微波輻射對海馬錐體細(xì)胞的蘑菇狀樹突占比影響較大，接受微波輻射后成熟蘑菇狀樹突棘形態(tài)發(fā)生了一系列改變，或表現(xiàn)為成熟蘑菇狀樹突棘萎縮變小為未成熟形態(tài)，或成熟蘑菇狀樹突棘增多。本研究結(jié)果可見，C波段微波單獨暴露可引起大鼠海馬顆粒細(xì)胞樹突棘密度的增加，顆粒細(xì)胞和錐體細(xì)胞蘑菇狀樹突棘比例的增加，表明C波段微波暴露可不同程度促進(jìn)海馬錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞樹突棘可塑性；L波段單一暴露可引起大鼠海馬錐體細(xì)胞(14 d)以及顆粒細(xì)胞(7 d)樹突棘密度的減低，顆粒細(xì)胞蘑菇狀樹突棘比例(14 d)的增加，表明L波段微波暴露對海馬錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞樹突棘可塑性呈一過性抑制作用，顆粒細(xì)胞成熟樹突棘代償性增加；C波段和L波段復(fù)合暴露僅引起大鼠海馬錐體細(xì)胞蘑菇狀樹突棘比例的增加(14 d)，表明復(fù)合暴露可一過性促進(jìn)錐體細(xì)胞樹突棘可塑性。因此，微波暴露后樹突棘密度和成熟樹突棘比例的增加，可能促進(jìn)了大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的維持和恢復(fù)，但這與行為學(xué)之間的關(guān)聯(lián)性仍需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)30 mW/cm2的L波段和C波段微波照射大鼠6 min，對大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力無影響，可降低焦慮情緒；對大鼠海馬樹突棘結(jié)構(gòu)的影響存在頻率差異性：C波段單獨暴露促進(jìn)大鼠海馬樹突棘可塑性；L波段單獨暴露對海馬錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞樹突棘可塑性呈一過性抑制作用，顆粒細(xì)胞成熟樹突棘代償性增加；C和L波段復(fù)合暴露一過性促進(jìn)錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞成熟樹突棘的增加；這為進(jìn)一步深入探討微波復(fù)合暴露對腦損傷機(jī)制及防護(hù)奠定了基礎(chǔ)。