趙海霞， 趙江豪， 岳含霖， 董 霽， 徐新萍，趙 黎， 張 靜， 王 惠， 姚斌偉， 王浩宇，杜秀敏， 彭瑞云

(1. 河北大學(xué) 教育學(xué)院， 河北 保定 071002；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850)

0 引言

微波是指頻率為0.3～300 GHz的電磁波，目前被廣泛應(yīng)用于軍事、醫(yī)療、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和日常生活[1-2]等領(lǐng)域。在對(duì)現(xiàn)代社會(huì)做出重大貢獻(xiàn)的同時(shí)，微波輻射對(duì)健康的潛在影響也引起了廣泛關(guān)注。既往研究表明，腦是微波輻射最敏感的靶器官之一[3-4].單一頻段微波輻射可導(dǎo)致腦損傷，進(jìn)而引發(fā)包括記憶功能在內(nèi)的多種認(rèn)知功能障礙[5-12]。當(dāng)前，隨著微波應(yīng)用日益遍及，無(wú)論是職業(yè)人員還是公眾，在實(shí)際工作和生活中接觸到的往往是不同頻段微波復(fù)合暴露的環(huán)境[13-15]。因此，相較于單一頻段微波輻射，針對(duì)不同頻段微波復(fù)合暴露生物損傷效應(yīng)及相關(guān)防治方法的研究已成為當(dāng)前焦點(diǎn)。2.856 GHz和9.375 GHz是在通信領(lǐng)域中常用的兩個(gè)微波頻率。但到目前為止，2.856 GHz和9.375 GHz微波復(fù)合暴露對(duì)記憶功能的影響及其組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)尚不明確。

本文將針對(duì)2.856 GHz和9.375 GHz微波復(fù)合暴露對(duì)大鼠記憶功能及海馬組織結(jié)構(gòu)的影響開展研究。為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，首先采用新物體識(shí)別(novel object recognition，NOR)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)范式檢測(cè)2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露后大鼠記憶功能改變情況，來(lái)揭示2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露對(duì)大鼠記憶功能的影響規(guī)律。其次，采用蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)技術(shù)、尼氏染色(Nissl staining)技術(shù)以及透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)技術(shù)分別對(duì)各組大鼠海馬神經(jīng)元顯微結(jié)構(gòu)、海馬神經(jīng)元尼氏體含量以及海馬超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量和定性分析，來(lái)揭示2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露所致記憶功能障礙的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本研究有助于理解2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露對(duì)記憶功能的影響規(guī)律和組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，能夠?yàn)殚_發(fā)不同頻段微波復(fù)合暴露所致記憶功能障礙的相關(guān)診斷和防治方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

將32只清潔級(jí)(specific pathogen free，SPF)雄性Wistar大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，中國(guó))，體重為280±20 g，隨機(jī)分為4組(n=8)，分別為假輻射組(Sham組)、2.856 GHz微波輻射組(S組)、9.375 GHz微波輻射組(X組)以及2.856 GHz和9.375 GHz微波復(fù)合暴露組(SX組)。

實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠均按照統(tǒng)一的條件飼養(yǎng)：溫度為22～24 ℃，濕度為45%～55%，照射條件為12 h光照12 h黑暗循環(huán)，光照時(shí)間為8：00-20：00，大鼠可以自由活動(dòng)并獲取食物和水。行為學(xué)檢測(cè)在光照時(shí)段進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理3R原則。

1.2 微波輻射方法

分別將各組大鼠等間距放置于專用的圓形照射盒中，之后將圓形照射盒放置于照射臺(tái)上，對(duì)S組大鼠進(jìn)行2.856 GHz微波單次全身均勻輻射，輻射時(shí)間為30 min，平均功率密度為50 mW/cm2；對(duì)X組大鼠進(jìn)行9.375 GHz微波單次全身均勻輻射，輻射參數(shù)同S組；對(duì)SX組大鼠先進(jìn)行2.856 GHz微波輻射，隨后進(jìn)行9.357 GHz微波輻射，輻射參數(shù)同單一輻射組，兩次輻射間隔較短，可忽略不計(jì)。輻射期間，為了確保同組大鼠的輻射劑量均勻，照射臺(tái)以180°/min的速度勻速旋轉(zhuǎn)。Sham組大鼠除不接受微波輻射外，其余條件均與復(fù)合暴露組相同。輻射完成后將各組大鼠放回飼養(yǎng)籠。

1.3 新物體識(shí)別(novel object recognition，NOR)實(shí)驗(yàn)

采用NOR行為學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)各組大鼠記憶功能相關(guān)行為學(xué)指標(biāo)偏好指數(shù)(Preference Index，PI)進(jìn)行檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)共分為3個(gè)階段，分別為適應(yīng)階段、學(xué)習(xí)階段和測(cè)試階段，具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如圖1A所示。

圖1 2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露導(dǎo)致大鼠記憶功能障礙A：NOR實(shí)驗(yàn)流程示意圖；B：代表性大鼠新舊物體探索時(shí)間熱圖；C-D分別表示偏好指數(shù)和平均速度比較結(jié)果*表示與Sham組相比，p < 0.05；&表示與X組相比，p < 0.05

微波輻射后當(dāng)天進(jìn)行適應(yīng)階段。將大鼠面向墻壁放置于一個(gè)由黑色塑料板組成的曠場(chǎng)內(nèi)(50 cm×50 cm×50 cm)，其內(nèi)不放置任何物體，任由大鼠自由探索5 min以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)流程和環(huán)境。大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將其放回飼養(yǎng)籠。用75%乙醇溶液噴灑、擦拭曠場(chǎng)后再進(jìn)行下一只大鼠的適應(yīng)操作，以避免上一只大鼠殘留的氣味對(duì)后續(xù)適應(yīng)環(huán)節(jié)產(chǎn)生干擾。微波輻射后1 d，在適應(yīng)階段結(jié)束24 h后進(jìn)行學(xué)習(xí)階段。實(shí)驗(yàn)開始前，在曠場(chǎng)內(nèi)放置兩個(gè)完全相同的物體。實(shí)驗(yàn)開始后，任由大鼠自由探索、識(shí)記物體5 min。其余程序均與適應(yīng)階段相同。微波輻射后2 d，在學(xué)習(xí)階段結(jié)束24 h后進(jìn)行測(cè)試階段。實(shí)驗(yàn)開始前，將其中一個(gè)舊物體替換為新物體，其余程序均與學(xué)習(xí)階段相同。

采用Anymaze動(dòng)物行為學(xué)分析軟件(Stoelting，美國(guó))分別記錄大鼠頭部進(jìn)入新物體和舊物體外圍2 cm范圍內(nèi)的時(shí)間，并將該時(shí)間分別定義為大鼠探索新物體的時(shí)間(T新物體)和探索舊物體的時(shí)間(T舊物體)。運(yùn)用如下公式計(jì)算PI：

PI=T新物體/(T新物體+T舊物體)

(1)

此外，記錄和分析大鼠在曠場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)的平均速度(Speed)，從而排除運(yùn)動(dòng)能力可能會(huì)對(duì)行為學(xué)結(jié)果產(chǎn)生的影響。

1.4 大鼠海馬神經(jīng)元蘇木素-伊紅染色(hema-toxylin-eosin staining，HE)觀察和定量分析

通過(guò)HE染色技術(shù)，借助光學(xué)顯微鏡對(duì)各組大鼠的海馬神經(jīng)元顯微結(jié)構(gòu)(細(xì)胞核是否固縮深染)進(jìn)行觀察，使用Image J軟件(Media Cybernetics，USA)對(duì)海馬神經(jīng)元核固縮深染數(shù)量進(jìn)行定量分析。

當(dāng)NOR實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用1%戊巴比妥鈉溶液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))腹腔注射麻醉大鼠后，斷頭取腦，取左側(cè)半腦浸入10%福爾馬林溶液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))中固定。

把腦組織置于福爾馬林溶液中固定3周后，進(jìn)行石蠟切片制備。首先，將大鼠左側(cè)半腦從福爾馬林溶液中取出，切取2 mm厚切塊放入包埋盒中，流水沖洗過(guò)夜；之后，用全自動(dòng)脫水機(jī)(Sakura，日本)進(jìn)行脫水、透明和浸蠟；其次，用石蠟包埋機(jī)(Leica，德國(guó))對(duì)組織塊進(jìn)行包埋；最后，待石蠟塊完全干燥后脫離包埋盒，用全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(Leica，德國(guó))切取3 μm厚的切片，將切片平鋪于載玻片上，置于60 ℃烤片箱(Leica，德國(guó))內(nèi)干燥過(guò)夜。

石蠟切片制備完成后，進(jìn)行HE染色。首先，將切片先后置于二甲苯和系列濃度梯度的乙醇中脫蠟至水，結(jié)束后用蒸餾水沖洗30 s；其次，將切片依次進(jìn)行蘇木素染液染色10 min、溫水沖洗1 min、1% 鹽酸乙醇分化5 s、溫水反藍(lán)40 s和伊紅染液染色3 min；再次，用二甲苯和系列濃度梯度的乙醇對(duì)切片進(jìn)行脫水透明；最后，采用中性樹脂膠將切片封片，待自然晾干后于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照分析。

1.5 大鼠海馬神經(jīng)元尼氏染色(Nissl staining)觀察和定量分析

通過(guò)尼氏染色技術(shù)，借助光學(xué)顯微鏡對(duì)各組大鼠的海馬神經(jīng)元尼氏體含量進(jìn)行觀察，使用Image J軟件(Media Cybernetics，USA)對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元尼氏體平均光密度(mean optical density，MOD)進(jìn)行定量分析。組織取材、固定以及切片制備方法均與HE染色實(shí)驗(yàn)相同。

石蠟切片制備完成后，進(jìn)行尼氏染色。首先，將切片放入甲苯胺藍(lán)染液中染色10 min；其次，在95%乙醇溶液中分化3 s；再次，用二甲苯和系列濃度梯度的乙醇將切片脫水透明；最后，采用中性樹脂膠將切片封片，待自然晾干后于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照分析。

1.6 透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope，TEM)觀察大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)

通過(guò)TEM樣品制備技術(shù)，借助TEM對(duì)各組大鼠的海馬超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并進(jìn)行定性分析。

當(dāng)NOR實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用1%戊巴比妥鈉溶液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))腹腔注射麻醉大鼠后，斷頭取腦。首先，將右側(cè)半腦的海馬組織取出，并從中間切取1 mm厚橫截面，先后經(jīng)由2.5%戊二醛磷酸緩沖固定液固定、0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗以及1%鋨酸固定。其次，將固定好的組織經(jīng)梯度乙醇脫水、丙酮和包埋液浸透包埋后，制作為半薄切片。再次，對(duì)半薄切片進(jìn)行HE染色，借助光學(xué)顯微鏡對(duì)組織進(jìn)行定位，并制作超薄切片。最后，超薄切片經(jīng)醋酸鈾和硝酸鉛染色后，在TEM下觀察并拍照分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)的方式呈現(xiàn)。所有定量化指標(biāo)均使用SPSS 22.0軟件(IBM，America)進(jìn)行單因素方差分析，事后檢驗(yàn)采用LSD方法。

2 結(jié)果

2.1 2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露導(dǎo)致大鼠記憶功能障礙

表1 2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露后大鼠NOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露導(dǎo)致海馬神經(jīng)元顯微結(jié)構(gòu)損傷

如圖2所示，Sham組(圖2A-B)大鼠海馬神經(jīng)元排列整齊，染色質(zhì)均勻分布，細(xì)胞核表現(xiàn)為大、圓且淡染，無(wú)異常。S組(圖2C-D)、X組(圖2E-F)和SX組(圖2G-H)大鼠海馬神經(jīng)元表現(xiàn)出核固縮深染現(xiàn)象。

圖2 2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露導(dǎo)致海馬神經(jīng)元顯微結(jié)構(gòu)損傷A-H分別表示 Sham、 S、 X 和 SX 組大鼠HE染色結(jié)果，Scale Bars1= 50 μm，紅色箭頭指向核固縮深染現(xiàn)象；I表示各組海馬神經(jīng)元核固縮深染數(shù)量比較結(jié)果。*表示與Sham組相比，p < 0.05；***表示與Sham組相比，p < 0.001；#表示與S組相比，p < 0.05；&&表示與X組相比，p < 0.01

2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露后HE染色定量分析結(jié)果如表2所示。使用單因素方差分析對(duì)各組大鼠海馬神經(jīng)元核固縮深染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，大鼠海馬神經(jīng)元核固縮深染組間差異顯著，F(xiàn)(3，11)= 9.687，P= 0.005，ηp2=0.784。事后檢驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham組相比，S組大鼠和SX組大鼠海馬神經(jīng)元核固縮深染數(shù)量均顯著增加(S組：P= 0.043，SX組：P<0.001)。與S組大鼠相比，SX組大鼠海馬神經(jīng)元固縮深染數(shù)量顯著增加(P= 0.024)。與X組大鼠相比，SX組大鼠海馬神經(jīng)元固縮深染數(shù)量也顯著增加(P= 0.005)。

表2 2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露后大鼠HE和尼氏染色定量分析結(jié)果

2.3 2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露導(dǎo)致海馬神經(jīng)元尼氏體含量下降

如圖3所示，Sham組(圖3A-B)大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體含量豐富。S組(圖3C-D)和X組(圖3E-F)大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體含量相對(duì)減少。SX組(圖3G-H)大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體含量明顯減少。

圖3 2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露導(dǎo)致大鼠海馬尼氏體含量下降A(chǔ)-H分別表示Sham、S、X和SX組大鼠尼氏染色結(jié)果，Scale Bars 1 = 50 μm；I表示各組海馬神經(jīng)元尼氏體平均光密度比較結(jié)果。**表示與Sham組相比，P < 0.01

2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露后大鼠海馬區(qū)尼氏染色定量分析結(jié)果如表2所示。使用單因素方差分析對(duì)各組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體MOD進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體MOD組間差異顯著，F(xiàn)(3，11)= 6.514，P= 0.003，ηp2=0.494。事后檢驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham組相比，S組、X組和SX組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體MOD均顯著降低(S組：P= 0.005，X組：P= 0.001，SX組：P= 0.001)。

2.4 2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露導(dǎo)致大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)損傷

2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露后各組大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果如圖4所示，Sham組(圖4A-C)大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)正常。與Sham組相比，S組(圖4D-F)大鼠海馬線粒體嵴斷裂、腫脹空化、突觸間隙模糊、血管周間隙增寬；X組(圖4G-I)大鼠海馬線粒體嵴斷裂、突觸間隙模糊、血管周間隙未見異常；SX組(圖4J-L)大鼠海馬線粒體嵴斷裂、腫脹空化、突觸間隙模糊、血管周間隙增寬。

圖4 2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露導(dǎo)致大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)損傷A-C分別表示Sham組大鼠線粒體、突觸間隙和血管周間隙超微結(jié)構(gòu)，Scale Bars 1 = 50 nm；D-F分別示S組大鼠大鼠線粒體、突觸間隙和血管周間隙超微結(jié)構(gòu)，Scale Bars 1 = 50 nm；G-I分別示X組大鼠大鼠線粒體、突觸間隙和血管周間隙超微結(jié)構(gòu)，Scale Bars 1 = 50 nm；J-L分別示SX組大鼠大鼠線粒體、突觸間隙和血管周間隙超微結(jié)構(gòu)，Scale Bars 1 = 50 nm

3 討論

隨著相關(guān)技術(shù)的不斷成熟和縱深發(fā)展，微波應(yīng)用日益遍及，越來(lái)越多的人被動(dòng)的暴露于多種不同頻段微波復(fù)合暴露的環(huán)境中。既往流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，單一頻段微波輻射會(huì)導(dǎo)致腦損傷，進(jìn)而導(dǎo)致記憶功能障礙[16-18]。例如，Wang等研究表明S頻段微波輻射(輻射頻率為2.856 GHz，輻射功率為50 mW/cm2，輻射次數(shù)為單次，輻射時(shí)間為6 min)能夠?qū)е麓笫笥洃浌δ苷系K[8]。Sharma等研究發(fā)現(xiàn)X頻段微波輻射(輻射頻率為10 GHz，輻射功率為0.25 mW/cm2，輻射時(shí)間為2 h/d，長(zhǎng)期輻射30 d)會(huì)導(dǎo)致小鼠記憶功能障礙[12]。然而，既往研究大多以單一頻段微波輻射為主，可能與實(shí)際生活和工作情景存在差異。因此，探究不同頻段微波復(fù)合暴露對(duì)健康的危害十分必要。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用NOR行為學(xué)實(shí)驗(yàn)分別對(duì)輻射后大鼠的記憶功能進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2.856 GHz微波單一輻射以及2.856 GHz和9.375 GHz微波復(fù)合暴露均可導(dǎo)致大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中新物體偏好指數(shù)PI值顯著下降(S組：P< 0.05；SX組：P< 0.05)。而與X組相比，SX組大鼠PI值也顯著降低(P< 0.05)。上述結(jié)果提示，2.856 GHz微波單一輻射以及2.856 GHz和9.375 GHz微波復(fù)合暴露均可造成大鼠記憶功能損傷。且相較于9.375 GHz微波輻射，2.856 GHz和9.375 GHz復(fù)合暴露損傷顯著。

海馬在記憶功能執(zhí)行中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19-23]。大量研究表明，微波輻射可以導(dǎo)致海馬神經(jīng)元顯微結(jié)構(gòu)損傷。Xiong等運(yùn)用HE染色對(duì)暴露于30 mW/cm2、2.856 GHz微波輻射環(huán)境中的大鼠的海馬神經(jīng)元進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，微波輻射后海馬神經(jīng)元顯微結(jié)構(gòu)明顯受損，具體表現(xiàn)為神經(jīng)元排列紊亂、神經(jīng)元核固縮深染等[24]。Narayanan等運(yùn)用尼氏體染色對(duì)暴露于900 MHz微波輻射的大鼠的腦組織切片進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，微波輻射后海馬背側(cè)CA3亞區(qū)椎體神經(jīng)元尼氏體MOD顯著減少，提示海馬CA3椎體神經(jīng)元顯微結(jié)構(gòu)損傷。該研究認(rèn)為，海馬組織結(jié)構(gòu)改變可能是微波輻射致使大鼠記憶功能障礙的原因之一[25]。既往研究表明，微波輻射也可以導(dǎo)致海馬超微結(jié)構(gòu)損傷。Xiong等運(yùn)用TEM發(fā)現(xiàn)微波輻射后大鼠海馬區(qū)突觸間隙模糊[24]。趙黎等發(fā)現(xiàn)微波輻射后大鼠海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)改變，具體表現(xiàn)為線粒體嵴不規(guī)則、腫脹以及空泡化[26]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HE染色技術(shù)、尼氏染色技術(shù)以及TEM技術(shù)，分別對(duì)輻射后大鼠海馬神經(jīng)元顯微結(jié)構(gòu)、海馬神經(jīng)元尼氏體含量及海馬超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和分析，發(fā)現(xiàn)2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及其復(fù)合暴露均會(huì)導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元核固縮深染、海馬神經(jīng)元尼氏體MOD降低，導(dǎo)致海馬組織線粒體嵴斷裂、腫脹空化、突觸間隙模糊、血管周間隙增寬等，提示海馬組織結(jié)構(gòu)造成損傷，且較單一頻段微波輻射，微波復(fù)合暴露造成的損傷更重。

4 結(jié)論

2.856 GHz和9.375 GHz微波單一及復(fù)合暴露均可導(dǎo)致大鼠記憶功能障礙和海馬組織結(jié)構(gòu)損傷。且復(fù)合暴露所致?lián)p傷效應(yīng)重于單一頻段微波輻射。本研究不僅有助于理解單一頻段微波輻射以及不同頻段微波復(fù)合暴露對(duì)記憶功能的影響規(guī)律及其組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而且能夠?yàn)殚_發(fā)微波復(fù)合暴露所致記憶功能障礙的相關(guān)診斷和防治方法奠定基礎(chǔ)。