劉 坤，楊明昊，周雄峰，白 楊，冉從福

（輸變電裝備技術(shù)全國重點實驗室,重慶大學電氣工程學院,重慶 400044）

等離子體活化水（Plasma activated water，PAW）是指利用大氣壓非熱等離子體對液體進行處理而得到的活化溶液［1～4］.在處理的過程中，等離子體產(chǎn)生的大量活性物種會通過液相次級反應(yīng)轉(zhuǎn)移至PAW中，使其含有豐富的活性氧物種（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮物種（Reactive nitrogen species，RNS）［5，6］，在醫(yī)療衛(wèi)生滅菌領(lǐng)域展現(xiàn)出極高的應(yīng)用價值［7，8］.近年來，研究者發(fā)現(xiàn)在大氣壓放電制備PAW的系統(tǒng)中引入永磁鐵產(chǎn)生的磁場能夠改變PAW中的化學產(chǎn)物濃度，影響PAW的滅菌應(yīng)用效果［9～11］.如，Liu等［9］利用0.587 T的磁場輔助大氣壓等離子體射流處理水溶液，發(fā)現(xiàn)此時溶液中的羥自由基（·OH）生成量比無磁場輔助時的生成量提高了0.5倍.Xu等［10］利用0.5 T的磁場輔助大氣壓等離子體射流制備PAW并用以滅活大腸桿菌和骨髓瘤細胞，結(jié)果表明，與單獨放電相比，磁場輔助放電制備的PAW 中過氧化氫（H2O2）與超氧根陰離子自由基（）濃度能分別增加12%和25%，此時，大腸桿菌和骨髓瘤細胞的存活率分別從43%和60%下降至26%和36%.Tschang 等［11］利用0～2 T 的磁場輔助大氣壓等離子體射流處理水溶液，發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)磁場強度可以調(diào)控溶液中生成的H2O2、硝酸根離子和亞硝酸根離子的濃度及其比例關(guān)系.可以看出，磁場能夠影響放電制備的PAW中的化學產(chǎn)物濃度，并以此影響PAW的生物滅活效果，有利于提升PAW在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用潛力.但是現(xiàn)有研究集中在磁場對大氣壓等離子體射流制備PAW的影響，而等離子體射流制備PAW因其處理面積相對較小，因此單位時間內(nèi)的制備量相對較少、制備效率較低、不利于大規(guī)模PAW需求的應(yīng)用拓展.

大氣壓沿面介質(zhì)阻擋放電（Surface dielectric barrier discharge，SDBD）作為一種常見的大氣壓放電等離子體源［12～16］，可以在大氣壓條件下于介質(zhì)表面產(chǎn)生較大面積的等離子體層，是大規(guī)模制備PAW的理想放電結(jié)構(gòu).但是，目前關(guān)于磁場影響SDBD 制備PAW 的實驗研究還未見報道，磁場輔助SDBD 制備的PAW的化學特性及其滅菌效果還需進一步驗證與分析.因此，本文利用永磁鐵產(chǎn)生的均勻磁場輔助SDBD制備PAW，對比研究了不同放電電壓與放電頻率下有無磁場輔助時放電制備PAW的酸度、電導率及H2O2和過氧亞硝酸（ONOOH）的濃度等溶液性質(zhì)差異，并結(jié)合空氣SDBD等離子體氣液兩相的相關(guān)化學反應(yīng)體系網(wǎng)絡(luò)，分析了磁場影響SDBD制備PAW的物理化學機制；此外，選取大腸桿菌作為指示菌，比較了不同放電條件下有無磁場制備的等離子體活化水的滅菌效果.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

對氨基苯磺酸（分析純）、N-（1-萘基）乙二胺（分析純）和辣根過氧化物酶（HRP），上海阿拉丁試劑公司；H2O2探針（Amplex Red），上海懋康生物科技公司.

高壓交流電源，重慶大學電氣工程學院；P6015A型高壓探頭，美國Tektronix公司；GDS2304A型數(shù)字示波器，臺灣Gwinstek公司；TD8650型高斯計，長沙tunkia公司；UV-2200型紫外分光光度計，北京Beifen-Ruili 公司；RF-6000 型熒光分光光度計，日本Shimadzu 公司；PHS-25 型pH 計，上海Leici 公司；DDS-11A型電導儀，上海Leici公司；RI-150型恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo-Fisher公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 實驗裝置 磁場輔助SDBD制備PAW用于滅菌的實驗裝置如Scheme 1（A）所示，主要由PAW制備單元與磁場建立單元以及相關(guān)測量儀器構(gòu)成.PAW制備單元由SDBD反應(yīng)器和石英玻璃腔室構(gòu)成.SDBD 反應(yīng)器由9 根條狀鎢電極、1 塊面狀鎢電極和1 塊陶瓷板絕緣介質(zhì)3 部分構(gòu)成，其放電形貌如Scheme 1（B）所示.SDBD反應(yīng)器更詳細的參數(shù)見文獻［17，18］.石英玻璃腔室內(nèi)盛有10 mL待處理的去離子水.將SDBD 置于腔室內(nèi)，與液面之間的距離為6 mm，每次放電處理150 s.驅(qū)動SDBD 的高壓交流電源由實驗室自主研發(fā)［19］，輸出電壓范圍為峰-峰值0～26 kV，頻率范圍4～20 kHz，電壓抖動小于0.2 kV.電壓信號由高壓探頭采集，然后顯示在數(shù)字示波器上，以此來確定施加的放電電壓和頻率.實驗中為了獲得較穩(wěn)定的放電，選取放電參數(shù)調(diào)節(jié)范圍為：放電電壓峰-峰值5.5～6.5 kV，頻率6.5～9.0 kHz.磁場建立單元由兩塊相向排列的釹鐵硼（Nd2Fe14B）永磁鐵構(gòu)成.兩塊永磁鐵相距8.5 cm，PAW制備單元放置在其中.利用高斯計測得放電空間內(nèi)的磁感應(yīng)強度大小約為55 mT.放電制備PAW所需的能耗可以通過放電功率和放電處理時間（150 s）得到，其中放電功率隨放電電壓和放電頻率條件變化而改變，其具體數(shù)值可以通過Lissajous圖形法計算得到［20］.

Scheme 1 Experimental setup of magnetic field assisting SDBD to prepare PAW(A) and SDBD discharge image(B)

1.2.2 溶液性質(zhì)檢測 實驗中對有無磁場情況下放電制備的PAW中的H2O2和ONOOH等活性物種進行檢測.其中，的測量原理如下［21］：利用紫外分光光度計測量PAW在220和275 nm波長處的吸光度（A220和A275），然后由A220－2A275得到的吸光度［圖1（A）］.的測量原理如下［22］：與對氨基苯磺酸反應(yīng)的產(chǎn)物能與N-（1-萘基）乙二胺溶液反應(yīng)生成玫瑰紅色復合物，利用紫外分光光度計測量該復合物在540 nm波長處的吸光度值［圖1（B）］.H2O2的測量過程如下［23］：H2O2在辣根過氧化物酶的作用下氧化H2O2探針生成具有熒光效應(yīng)的產(chǎn)物，利用熒光分光光度計測量在571 nm波長光照射下585 nm 波長處的熒光強度［圖1（C）］.ONOOH 測量過程如下［24］：ONOOH 與特異性探針（自制）反應(yīng)生成具有熒光效應(yīng)的產(chǎn)物，利用熒光分光光度計測量在600 nm波長光照射下646 nm波長處的熒光強度［圖1（D）］.利用上述吸光度值或熒光強度值，結(jié)合相應(yīng)的定標曲線，即得到PAW不同活性物種的濃度.實驗中PAW的pH值和電導率分別利用pH計和電導儀進行測量.

Fig.1 Absorbance curve or fluorescence curve for measuring nitrate ion(A),nitrite ion(B),hydrogen peroxide(C) and peroxynitrous acid(D)

1.2.3 滅菌效果表征 利用大腸桿菌（E.coli）進行PAW的生物滅活效應(yīng)評價.分別制備無磁場與有磁場時不同放電條件下的PAW，取10 μL大腸桿菌菌液與1000 μL PAW混合，然后利用渦旋振動器振動5 s混勻；混合液靜置5 min后按10倍梯度稀釋法進行梯度稀釋，并接種于LB固體培養(yǎng)基中；將接種后的培養(yǎng)基放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h［25］.圖2為有無磁場輔助情況時，在6.5 kV，6.5 kHz條件下放電制備的PAW的滅菌效果示意圖，圖中的數(shù)字表示稀釋的倍數(shù)，對照組表示用去離子水處理.采用菌落形成單位（Colony forming units，CFU）表示微生物的存活數(shù)量，用平板計數(shù)法統(tǒng)計LB培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目［26］，本文使用的大腸桿菌原始濃度為5.5×108CFU/mL，檢出限為102CFU/mL.

Fig.2 Bacterial colony diagram treated by PAW prepared with conditions of control group(A),solo SDBD(B) and magnetic field assisted SDBD(C)

2 結(jié)果與討論

2.1 溶液性質(zhì)

圖3（A）～（F）分別示出了無磁場以及有磁場輔助下放電制備的PAW 的pH 值、電導率以及H2O2與ONOOH的濃度隨放電電壓和放電頻率的變化規(guī)律.可知，在不同的放電電壓和放電頻率條件下，磁場輔助放電制備的PAW有更高的酸性、電導率以及H2O2與ONOOH 濃度.如在最低放電條件（5.5 kV，6.5 kHz）下，相比于無磁場情況時，磁場輔助使所制備PAW 的pH 值從6.4降低到6.2，電導率從394.0 μS/cm 增大到465.0 μS/cm，H2O2與ONOOH 的濃度 從1.39 mmol/L，28.18，13.89 和5.64 μmol/L 增大到1.92 mmol/L，41.97，27.45 和7.50 μmol/L.在最高放電條件（6.5 kV，9.0 kHz）下，相比于無磁場情況時，磁場輔助使所制備PAW的pH值從2.6降到2.3，電導率從1680.7 μS/cm 增大到1852.3 μS/cm，H2O2與ONOOH 的濃度 從6.58 mmol/L，541.90，143.58和7.57 μmol/L增大到7.19 mmol/L，675.47，226.02和10.27 μmol/L.

Fig.3 pH value(A),conductivity(B),concentrations of nitrate ion(C),nitrite ion(D),hydrogen peroxide(E),and peroxynitrous acid(F) of PAW solution properties with and without magnetic field

從上述數(shù)據(jù)還可以看出，磁場輔助高電壓-高頻率的放電對于PAW 溶液性質(zhì)的提升效果更顯著.如在最高放電條件（6.5 kV，9.0 kHz）下，磁場輔助使得PAW的pH值降低了0.3，并且電導率及，H2O2和ONOOH 的濃度分別增加了171.6 μS/cm，0.61 mmol/L，133.57，82.44 和2.7 μmol/L；但是在最低放電條件（5.5 kV，6.5 kHz）下，磁場輔助時，PAW 的pH 值僅降低了0.2，電導率及H2O2和ONOOH的濃度僅分別增加了71 μS/cm，0.53 mmol/L，13.79，13，56和1.86 μmol/L.

2.2 磁場輔助放電制備PAW化學活性提升的機理

在空氣SDBD放電制備PAW的體系中引入磁場時，放電等離子體氣相空間內(nèi)的電子受洛倫茲力作用，其運動軌跡發(fā)生改變［27］，進而影響其從電場中獲得的能量.如表1［28～34］所示，電子碰撞反應(yīng)（R1～R5）的反應(yīng)速率系數(shù)是電子平均能量（ε）的函數(shù)，因而磁場能夠通過作用于電子從而影響相關(guān)電子碰撞反應(yīng)的進程.大量文獻表明磁場的加入會使得ε增大［35～37］.此時，電子與空氣中的氮氣、氧氣和水分子等粒子的碰撞反應(yīng)的反應(yīng)速率系數(shù)增大，促進產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)氮分子N2（A）、激發(fā)態(tài)氮原子·N（2D）、激發(fā)態(tài)氧分子O2（a）、氧原子·O以及羥自由基·OH等粒子.為鏈式化學反應(yīng)R6～R9提供了更多的反應(yīng)物，促進了·NO和H2O2的產(chǎn)生.而·NO作為重要的前體物，可以通過R10～R12生成氣相HNO2和HNO3.因此，磁場的加入有利于SDBD在氣相區(qū)域生成更多的H2O2，HNO2和HNO3等活性物種.

Table 1 Related reaction process for preparing PAW by an air discharge plasma

磁場影響放電等離子體氣相產(chǎn)物后，會進一步影響通過液相次級反應(yīng)轉(zhuǎn)移至PAW中的活性物種.相關(guān)研究表明，大氣壓放電等離子體與液體相互作用時，液相中的H2O2，主要來源于氣相H2O2，HNO2和HNO3溶解所產(chǎn)生［22，38］.Scheme 2 給出了SDBD 中考慮的生成PAW 活性物種的主要反應(yīng)過程.磁場加入SDBD 時氣相中增加的H2O2，HNO2和HNO3等活性物種通過傳質(zhì)過程溶于液相，使得液相中的H2O2，H+，等粒子濃度增加（R13和R14，反應(yīng)式中的aq表示液相），從而使得圖3中表征的PAW溶液性質(zhì)提升.因此，磁場輔助SDBD制備PAW時，通過磁化電子來影響電子碰撞反應(yīng)和后續(xù)的鏈式化學反應(yīng)和液相次級反應(yīng)，促進溶液中H+，和ONOOH等活性物種的生成.

Scheme 2 Main reaction network for generating reactive species in PAW

2.3 滅菌效應(yīng)

圖4（A）～（C）分別為無磁場以及有磁場輔助下放電制備的PAW對大腸桿菌的滅菌效果隨放電電壓和放電頻率的變化規(guī)律，圖中的紅色虛線表示檢出限（102CFU/mL）.可見，在所有相同的放電電壓和放電頻率下，磁場輔助放電制備的PAW都能顯著增強對大腸桿菌的滅活效果.如無磁場時，最高放電條件（6.5 kV，9.0 kHz）下制備的PAW 處理時，大腸桿菌的存活數(shù)量僅能從對照組的5.5×108CFU/mL降至1.2×108CFU/mL，殺滅率僅約為78%［圖4（C）］.而相同的放電條件下，磁場輔助放電制備的PAW處理時，大腸桿菌的存活數(shù)量低至檢出限（102CFU/mL），殺滅率在99.9999%以上.即使在最低的放電條件（5.5 kV，6.5 kHz）下，磁場輔助SDBD制備的PAW處理時，大腸桿菌的存活數(shù)量也能從對照組的5.5×108CFU/mL顯著下降至6.6×105CFU/mL［圖4（A）］，而此時相同放電條件下無磁場輔助SDBD制備的PAW 處理時，大腸桿菌的存活數(shù)量還高達1.1×108CFU/mL.上述現(xiàn)象表明，磁場輔助放電制備的PAW顯著提高了對大腸桿菌的滅菌效果；而且對于獲得相同的殺菌效果，磁場的引入顯著降低了所需的放電電壓和頻率，也意味著此時能耗降低.5.5 kV，6.5 kHz下有磁場輔助制備的PAW［圖4（A）］和6.0 kV，8.5 kHz下無磁場輔助制備的PAW［圖4（B）］處理時，大腸桿菌的存活數(shù)量相差不大，分別為6.7×108和7.5×108CFU/mL，但此時前者制備PAW所需的能耗（2337 J）僅為后者（5625 J）的41.5%；而且有磁場輔助放電制備的PAW 處理時，使大腸桿菌存活數(shù)量低至檢出限所需的最低能量也僅需為5574 J［對應(yīng)圖4（A）中5.5 kV，8.5 kHz情況］，低于5625 J.

Fig.4 Sterilization effect of PAW prepared under 5.5 kV(A),6.0 kV(B),6.5 kV(C) with different frequencies

此外，對比圖4（A）～（C）還可見，磁場輔助高電壓-高頻率放電制備的PAW對于殺菌效果的提升效應(yīng)更顯著.如在最低的放電條件［5.5 kV，6.5 kHz，圖4（A）］下，磁場輔助放電制備的PAW 的殺菌效率僅能提高3個量級；而在最高的放電條件［6.5 kV，9.0 kHz，圖4（C）］下，磁場輔助放電制備的PAW的殺菌效率則提高了6 個量級，此時，大腸桿菌的存活數(shù)量低至檢出限.而且隨著放電頻率或電壓的升高，磁場輔助放電制備的PAW使大腸桿菌存活數(shù)量低至檢出限所需的放電電壓或頻率會降低.如圖4（A）所示，固定放電電壓為5.5 kV，此時，磁場輔助放電制備的PAW使大腸桿菌存活數(shù)量低至檢出限所需的放電頻率為8.5 kHz；而如圖4（C）所示，當固定放電電壓為6.5 kV時，此時，使大腸桿菌存活數(shù)量低至檢出限所需的放電頻率降至7.5 kHz.

PAW 中的氫離子（H+）提供了酸性的環(huán)境，H+對于病原體的滅活提供了一定的作用［39］.PAW 中的H2O2具有強氧化性，其在消毒滅菌等應(yīng)用中也扮演了重要角色［40］.此外，也有研究表明，H2O2和H+反應(yīng)生成的ONOOH（R15）是殺菌的關(guān)鍵物質(zhì)［41，42］.為了更直觀體現(xiàn)H+，H2O2和ONOOH 等活性物種與殺菌效率之間的關(guān)聯(lián)，繪制了大腸桿菌存活數(shù)量隨PAW 的pH 值、H2O2與ONOOH 濃度的變化規(guī)律圖（圖5）.可見，大腸桿菌存活量的確隨PAW的酸性、H2O2以及ONOOH濃度的增加而下降.如無磁場輔助放電時，當PAW 的pH 值從6.4 降至2.6、H2O2濃度從13.89 μmol/L 增至143.58 μmol/L、ONOOH濃度從5.64 μmol/L 增至7.57 μmol/L 時，大腸桿菌的存活數(shù)量將從1.1×108CFU/mL 降至1.2×105CFU/mL.因此，磁場輔助SDBD制備PAW時，可以通過磁化電子來影響電子碰撞反應(yīng)和后續(xù)的鏈式化學反應(yīng)和液相次級反應(yīng)，從而促進溶液中H+，和ONOOH等活性物種的生成，進而提高殺菌效果.如有磁場輔助放電時，PAW的最低pH值能降至2.3，最高H2O2和ONOOH的濃度能分別提升至226.02和10.27 μmol/L，此時，大腸桿菌的存活數(shù)量將低至檢出限.值得注意的是，在圖5中，當無磁場與存在磁場情況下制備的PAW中的pH值、H2O2和ONOOH濃度三者中某兩個指標達到近似相同值時，此時另外一個指標不同，大腸桿菌的存活量卻相差很大.如磁場輔助6.5 kV放電制得H2O2和ONOOH濃度相近的兩種PAW（圖5紅色圓圈標記點），但是由于此時溶液pH值相差較大，兩種PAW的殺菌性能存在很大差異.而且，較低的pH值并不能保證大腸桿菌殺滅率始終很高［圖5（A）］.上述現(xiàn)象說明PAW對大腸桿菌的滅活效應(yīng)主要來自于三者的協(xié)同作用.如Ma等［43］發(fā)現(xiàn)，H+，H2O2和ONOOH 3種粒子能協(xié)同產(chǎn)生超氧陰離子自由基（）和單線態(tài)氧1O2，顯著提升PAW的殺菌性能.同時，上述滅菌率的突變現(xiàn)象也說明實現(xiàn)高效殺菌（大腸桿菌存活數(shù)量基本低至檢出限）會存在閾值濃度（所需的最低pH值為4.2，H2O2與ONOOH 濃度分別為93.31 與8.26 μmol/L），只有當這三者條件同時滿足時才會實現(xiàn)高效殺菌［圖5（B）和（C）］.此外，上文提到在高電壓-高頻率下磁場輔助放電對于PAW 溶液性質(zhì)的提升效果更明顯，與殺菌效應(yīng)的提升效果也最顯著相對應(yīng).

Fig.5 E. coli survival varying with pH value(A),H2O2 concentration(B) and peroxynitrous acid concentration(C) of PAM

磁場輔助SDBD放電制備的PAW能實現(xiàn)大腸桿菌高效殺滅，殺菌率能達到99.9999%以上（此時大腸桿菌存活數(shù)量低至檢出限102CFU/mL）.通過圖3～圖5的結(jié)果可知，實現(xiàn)高效殺菌（大腸桿菌存活數(shù)量基本低至檢出限）所需的最低pH 值為4.2，H2O2與ONOOH 濃度分別為93.31 和8.26 μmol/L.上述PAW的pH值與人體皮膚pH值（4.5～6.5）較接近、H2O2濃度遠低于醫(yī)用消毒領(lǐng)域所用3%H2O2濃度（摩爾濃度為0.89 mol/L）、ONOOH 易分解無殘留.可以預見，利用磁場輔助SDBD 制備的PAW 在醫(yī)療衛(wèi)生滅菌領(lǐng)域應(yīng)用時符合生物安全性.

3 結(jié)論

利用永磁鐵產(chǎn)生的均勻磁場輔助大氣壓SDBD 處理去離子水制備PAW，研究了施加交流電壓5.5～6.5 kV、頻率6.5～9.0 kHz 范圍內(nèi)有無磁場時放電制備的PAW 溶液的pH 值、電導率以及H2O2與ONOOH濃度等性質(zhì)的差異，并結(jié)合空氣SDBD與液體相互作用時氣液兩相的相關(guān)化學反應(yīng)體系網(wǎng)絡(luò)，分析了磁場影響放電制備PAW的物理化學機理.結(jié)果表明，在不同的交流電壓和頻率放電條件下，磁場的加入能影響放電空間的電子碰撞反應(yīng)，進而影響后續(xù)的鏈式化學反應(yīng)和液相次級反應(yīng)進程，從而提高SDBD制備的PAW的化學活性，增強對大腸桿菌的殺滅效果.此時，對于獲得相同的殺菌效果，磁場的引入顯著降低了所需的放電電壓和頻率，降低了能耗.隨著放電頻率/電壓的升高，PAW的化學活性增強，此時磁場輔助放電制備的PAW使大腸桿菌存活數(shù)量低至檢出限（殺滅率在99.9999%以上）所需的放電電壓/頻率會降低.磁場輔助高電壓-高頻率的SDBD對于PAW化學活性的提升效果更顯著，此時H+，H2O2和ONOOH 等活性物種之間的協(xié)同效應(yīng)加強，殺菌效果的提升也最明顯.研究結(jié)果為大氣壓放電制備PAW 提供了新見解，尤其是提出的磁場輔助SDBD 放電制備PAW 的方法能夠有效提高PAW的滅活能力并降低PAW的制備成本，有利于推動PAW在醫(yī)療衛(wèi)生滅菌等領(lǐng)域的發(fā)展.