馬孝秋，左韜，馬賢德，趙磊（. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院，遼寧沈陽 0000；.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧沈陽 0000；. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧沈陽 0000）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最嚴(yán)重的微血管病變之一，是造成糖尿病患者視功能損害和喪失的主要原因。2017 年我國一項(xiàng)橫跨6 省的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在參與研究的13 473 位糖尿病患者中，4 591 人確診糖尿病視網(wǎng)膜病變，患病率高達(dá)34.08%[1-2]。高血糖是影響糖尿病并發(fā)癥的重要因素之一，持續(xù)高血糖狀態(tài)促使視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞無序地增殖、遷移，導(dǎo)致正常血管失衡和病理性視網(wǎng)膜新生血管形成（retinal neovascularization，RNV），引起嚴(yán)重的視功能障礙[3-4]。因此，抑制高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能異常，有益于改善糖尿病視網(wǎng)膜病變。

化瘀明目方是遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院左韜教授在臨床診治眼病過程中探索積累所得，前期臨床研究[5]顯示化瘀明目方（Huayu Mingmu Recipe，HMR）能夠改善眼底狀態(tài)，減少視網(wǎng)膜出血斑、微血管瘤，具有較好臨床療效。本研究旨在實(shí)驗(yàn)探究化瘀明目方對高糖誘導(dǎo)下人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs）血管形成的抑制作用及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及動物HRMECs（生長代數(shù)：P4），購于通派（上海）生物科技有限公司，用ECM 完全培養(yǎng)基（10% FBS+1% ECGS+1% P/S）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，待細(xì)胞密度約80%時(shí)，加胰酶替代物消化傳代，ECM 完全培養(yǎng)基終止消化。傳代比例1∶2，取30代內(nèi)對數(shù)生長期細(xì)胞開展實(shí)驗(yàn)。

SPF 級健康6 周齡雄性Sprague Dawley 大鼠，40 只，體質(zhì)量180～220 g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物質(zhì)量合格證號：210726221101160082，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0001。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會同意，實(shí)驗(yàn)動物倫理審查編號：21000042022044。

1.2 藥物及試劑化瘀明目方組成：生地黃、黃芪、丹參、墨旱蓮、生蒲黃、茯苓、牡丹皮、莪術(shù)、虎杖、蟬蛻、山楂，配比為2∶2∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1，顆粒劑由江陰天江藥業(yè)有限公司提供并鑒定，批號分別為：2111075101、2301090101、2112061101、2112164101、21097274、21102061、 21091961、 210816221、 2204034101、21090191、2201266101。內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基（ECM），美國ScienCell 公司，批號：1001；胎牛血清（FBS），烏拉圭Lonsera 公司，批號：S711-001S；胰酶替代物（TrypleEMExpress），美國Gibco 公司，批號：12605-010；磷酸鹽緩沖液（PBS），美國HyClone公司，批號：SH30256.01；8.0 μm 孔徑聚碳酸酯膜Transwell 小室、Matrigel 基底膠，美國Corning 公司，批號分別為：3422、356234；Anti-FactorⅧ抗體、Anti-CD31 抗體、Anti-CD34 抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號分別為：bs-2974R、bs-0195R、bs-8996R；Anti-VEGFA 抗體、Anti-VEGF Receptor 2 抗體、山羊抗兔IgG/FITC，美國abcam 公司，批號分別為：ab51745、ab39638、ab6717；山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZB-2301；Anti-beta Actin 抗體、CCK-8試劑盒、DAPI 染色液、PIPA 裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、超敏ECL 發(fā)光試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為：AF5003、C0038、C1005、P0013B、ST506、P0012、P0012AC、P0018S；TritonX-100，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，批號：DH351-4；抗熒光衰減封片劑，北京索萊寶科技有限公司，批號：S2100；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑，日本TaKaRa 公司，批號分別為：9109、RR047A、RR820A。

1.3 主要儀器371型二氧化碳培養(yǎng)箱，德國Memmert公司；HFsafe-1200LC生物安全柜，上海力申科學(xué)儀器有限公司；HSA-2 冷凍水浴恒溫振蕩器，常州國宇儀器制造有限公司；MDF-U32V 超低溫冰箱，日本SANYO公司；L500-A離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器公司；CENTRIFUGE C 4-12 高速離心機(jī)，法國JOUAN SA 公司；DM2000 熒光倒置生物顯微鏡，德國Leica公司；Multiskan MK3 酶標(biāo)儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；EPS 200 電泳儀、HE-120 電泳轉(zhuǎn)移槽、4200SF 凝膠成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；ABI StepOne Real-time PCR系統(tǒng)，美國Thermo Fisher Scientific 公司；AL104 精密電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.4 含藥血清制備SD 大鼠40 只按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組，化瘀明目方低、中、高劑量組，每組10只。臨床上成人每日服藥劑量為2.92 g·kg-1，參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》折算方法，大鼠灌胃劑量為成人的6.36倍，得大鼠每日灌胃等效劑量為18.57 g·kg-1?；雒髂糠降汀⒅?、高劑量組分別按9.29、18.57、37.14 g·kg-1劑量灌胃化瘀明目方顆粒的蒸餾水沖液；空白對照組予等體積生理鹽水灌胃，每只2 mL，連續(xù)灌胃7 d，1日2次。末次灌胃1 h后，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，促凝管靜置2 h，配平后離心機(jī)離心（離心半徑14 cm，3 000 r·min-1、10 min），收集上清液，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾器除菌，-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 CCK-8 實(shí)驗(yàn)

1.5.1CCK-8法檢測化瘀明目方含藥血清毒性、篩選最佳體積分?jǐn)?shù) ①空白對照孔：ECM 完全培養(yǎng)基；②正常對照孔：ECM 完全培養(yǎng)基+HRMECs；③實(shí)驗(yàn)孔：取化瘀明目方低、中、高劑量含藥血清，分別制備含藥血清體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%的ECM 含藥血清培養(yǎng)基（含藥血清培養(yǎng)基=ECM 完全培養(yǎng)基+含藥血清）。ECM 完全培養(yǎng)基制備HRMECs 單細(xì)胞懸液，96 孔板接種細(xì)胞懸液1×104個(gè)/孔，每孔100 μL。待細(xì)胞貼壁完全，吸盡培養(yǎng)基，加ECM 不完全培養(yǎng)基饑餓24 h，更換含藥血清培養(yǎng)基干預(yù)細(xì)胞24 h；④24 h 時(shí)每孔加10 μL CCK-8 工作液，孵育2 h 后，酶標(biāo)儀測吸光度（A450 nm）值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.5.2CCK-8法檢測不同濃度葡萄糖對HRMECs 存活的影響 ①空白對照孔：ECM 完全培養(yǎng)基（自含5.5 mmol·L-1葡萄糖）；②正常對照孔：ECM 完全培養(yǎng)基+HRMECs；③實(shí)驗(yàn)孔：14.5、19.5、24.5、29.5 mmol·L-1的D-葡萄糖+ECM 完全培養(yǎng)基+HRMECs。HRMECs 按“1.5.1”項(xiàng)下種板后饑餓24 h，按分組條件干預(yù)細(xì)胞24、48、72 h后，CCK-8法檢測。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.6 正式實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)前兩次CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)分組，將HRMECs 分為：①正常對照組（ECM完全培養(yǎng)基+10%空白血清）；②甘露醇對照組（19.5 mmol·L-1甘露醇+ECM完全培養(yǎng)基+10%空白血清）；③模型組（19.5 mmol·L-1D-葡萄糖+ECM完全培養(yǎng)基+10%空白血清）；④化瘀明目方低劑量組（19.5 mmol·L-1D-葡萄糖+ECM完全培養(yǎng)基+10%低劑量含藥血清）；⑤化瘀明目方中劑量組（19.5 mmol·L-1D-葡萄糖+ECM 完全培養(yǎng)基+10%中劑量含藥血清）；⑥化瘀明目方高劑量組（19.5 mmol·L-1D-葡萄糖+ECM完全培養(yǎng)基+10%高劑量含藥血清）。

1.7 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期HRMECs制備單細(xì)胞懸液，以200 個(gè)/皿的細(xì)胞密度接種于60 mm 培養(yǎng)皿中，每皿5 mL，培養(yǎng)24 h 細(xì)胞貼壁后棄原培養(yǎng)基，按分組條件進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)5 d至肉眼可見細(xì)胞克隆時(shí)終止培養(yǎng)。PBS清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min。結(jié)晶紫染色20 min，細(xì)胞集落計(jì)數(shù)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.8 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)無血清ECM 培養(yǎng)基制備HRMECs單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105個(gè)/mL，向Transwell小室的上室加單細(xì)胞懸液200 μL/孔，按分組培養(yǎng)條件不同，向24 孔板內(nèi)加不同條件培養(yǎng)液700 μL/孔。將小室對應(yīng)安置到24孔板內(nèi)，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。吸盡小室內(nèi)培養(yǎng)液，用棉拭子將上室未遷移細(xì)胞輕輕擦除。PBS清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min。結(jié)晶紫染色20 min，倒置顯微鏡下觀察采集圖像，計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.9 管腔形成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)開始前于4 ℃冰箱內(nèi)融化Matrigel 基底膠，并且預(yù)冷96 孔板和100 μL 槍頭。96 孔板每孔加入100 μL 基底膠（操作要求于冰上進(jìn)行，動作應(yīng)緩慢以免產(chǎn)生氣泡），隨后移入37 ℃培養(yǎng)箱固化30 min，按照分組將HRMECs 與不同條件培養(yǎng)液一起接種到凝固的基底膠上，每孔50 μL（3×104個(gè)/孔）。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后于倒置顯微鏡下觀察采集圖像，使用ImageJ 軟件“血管生成分析”工具評估管腔結(jié)構(gòu)長度。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.10 免疫熒光法檢測Factor Ⅷ、CD31、CD34、VEGFA、VEGFR2 陽性表達(dá)取對數(shù)生長期HRMECs 接種細(xì)胞爬片，當(dāng)載玻片細(xì)胞生長至70%時(shí)，各組細(xì)胞按分組條件分別處理24 h，4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1% TritonX-100 室溫滲透20 min，37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)5% BSA 封閉1 h。放入濕盒內(nèi)并加Factor Ⅷ（1∶200）、CD31（1∶400）、CD34（1∶200）、VEGFA（1∶200）、VEGFR2（1∶200）抗體4 ℃冰箱過夜；次日PBS清洗6次，滴加熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG/FITC，37 ℃孵育1 h，PBS清洗6次；10 μg·mL-1DAPI避光染色細(xì)胞核20 min，PBS清洗3次；抗熒光衰減封片劑封片。暗室內(nèi)熒光顯微鏡觀察Factor Ⅷ、 CD31、 CD34、 VEGFA、VEGFR2在各組細(xì)胞中的表達(dá)和分布情況。

1.11 Western Blot 法檢測VEGFA、VEGFR2 蛋白表達(dá)收集各組培養(yǎng)液干預(yù)24 h后的HRMECs，冰浴中使用裂解緩沖液（蛋白酶抑制劑PMSF∶細(xì)胞裂解液RIPA=1∶100）充分裂解細(xì)胞60 min 提取細(xì)胞蛋白，離心機(jī)離心（離心半徑10 cm，12 000 r·min-1，10 min，4 ℃）提取上清；BCA 試劑盒蛋白定量，蛋白變性，SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離目標(biāo)蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜；5% BSA 搖床封閉1 h；分別加β-actin（1∶2 000）、VEGFA（1∶2 000）、VEGFR2（1∶1 000），放入4 ℃冰箱孵育過夜；次日TBST 緩沖液洗膜6 次，5 min/次；加山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST 緩沖液洗膜6 次，5 min/次；使用ECL 超敏發(fā)光液顯影蛋白條帶，采集圖像，ImageJ 軟件半定量分析條帶灰度，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算各組目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.12 RT-PCR 法檢測Factor Ⅷ、CD31、CD34、VEGFA、VEGFR2 mRNA 表達(dá)收集各組培養(yǎng)液干預(yù)24 h 后的HRMECs，依據(jù)Trizol 說明書提取細(xì)胞總RNA，計(jì)算RNA 濃度，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，PCR 儀37 ℃孵育15 min、85 ℃反應(yīng)5 s，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；建立PCR 反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃PCR 反應(yīng)5 s，60 ℃退火34 s，共循環(huán)40 次。最后熔解條件：95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，完成擴(kuò)增。以β-actin 為內(nèi)參，2-△△CT法計(jì)算mRNA 相對表達(dá)水平，引物序列見表1。引物由大連TaKaRa公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法數(shù)據(jù)分析使用SPSS 26.0 軟件，對樣本進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布者用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行描述。多組間差異比較，對樣本進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊采用單因素方差分析（單因素ANOVA 檢驗(yàn)），并用Bonferroni 法進(jìn)行事后檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1不同體積分?jǐn)?shù)化瘀明目方含藥血清對HRMECs毒性的影響 結(jié)果見表2。含藥血清體積分?jǐn)?shù)5%組與10%組的各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；15%組與20%組的抑制系數(shù)均明顯大于10%組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明對細(xì)胞生存活性有較大影響。故本實(shí)驗(yàn)選取含藥血清10%體積分?jǐn)?shù)為干預(yù)措施。

表2 不同體積分?jǐn)?shù)含藥血清對HRMECs 毒性的影響（n=3，±s）Table 2 Effects of different volume fractions of drug-containing serum on the toxicity of HRMECs（n=3，±s）

表2 不同體積分?jǐn)?shù)含藥血清對HRMECs 毒性的影響（n=3，±s）Table 2 Effects of different volume fractions of drug-containing serum on the toxicity of HRMECs（n=3，±s）

注：細(xì)胞抑制率=[（正常對照孔-實(shí)驗(yàn)孔）/（正常對照孔-空白對照孔）]×100%；抑制系數(shù)=抑制率/100%。與同劑量體積分?jǐn)?shù)10%組比，*P＜0.05

化瘀明目方含藥血清低劑量中劑量高劑量劑量/（g·kg-1）9.29 18.57 37.14抑制系數(shù)體積分?jǐn)?shù)20%0.377±0.006*0.411±0.014*0.444±0.012*體積分?jǐn)?shù)5%0.274±0.013 0.321±0.014 0.351±0.011體積分?jǐn)?shù)10%0.292±0.011 0.330±0.010 0.365±0.010體積分?jǐn)?shù)15%0.345±0.007*0.372±0.007*0.403±0.008*

2.1.2不同糖濃度對HRMECs 存活的影響 見表3。各時(shí)間段培養(yǎng)基內(nèi)總體糖濃度≤25 mmol·L-1時(shí)，HRMECs 呈促生長趨勢（P＜0.05）；隨著糖濃度的增加，HRMECs 出現(xiàn)生長抑制（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故本實(shí)驗(yàn)選取25 mmol·L-1總體糖濃度干預(yù)HRMECs，以復(fù)制高糖下HRMECs功能紊亂模型。

表3 不同糖濃度對HRMECs 存活的影響（n=3，±s）Table 3 Effects of different sugar concentrations on the survival of HRMECs（n=3，±s）

表3 不同糖濃度對HRMECs 存活的影響（n=3，±s）Table 3 Effects of different sugar concentrations on the survival of HRMECs（n=3，±s）

注：細(xì)胞增殖率=[（實(shí)驗(yàn)孔-正常對照孔）/（正常對照孔-空白對照孔）]×100%；增殖系數(shù)=增殖率/100%。與25 mmol·L-1組比，*P＜0.05

總體糖濃度/（mmol·L-1）20 25 30 35增殖系數(shù)72 h 1.224±0.012*1.259±0.015 0.884±0.009*0.726±0.009*24 h 1.112±0.007*1.148±0.010 1.026±0.011*0.911±0.012*48 h 1.178±0.012*1.225±0.014 0.933±0.013*0.803±0.006*

2.2 化瘀明目方含藥血清對HRMECs 克隆形成能力的影響結(jié)果見圖1、表4。甘露醇對照組與正常對照組細(xì)胞集落數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常對照組比較，模型組細(xì)胞集落數(shù)明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，化瘀明目方低、中、高劑量組細(xì)胞集落數(shù)明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 各組HRMECs 克隆形成情況Figure 1 Clonogenic experiment result of HRMECs of each group

表4 化瘀明目方含藥血清對HRMECs 克隆形成能力的影響（n=3，±s）Table 4 Effects of Huayu Mingmu Recipe（HMR）-containing serum on the colony formation ability of HRMECs（n=3，±s）

表4 化瘀明目方含藥血清對HRMECs 克隆形成能力的影響（n=3，±s）Table 4 Effects of Huayu Mingmu Recipe（HMR）-containing serum on the colony formation ability of HRMECs（n=3，±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

細(xì)胞集落數(shù)/個(gè)14.33±1.53 16.67±1.53 47.33±2.08**38.00±2.65#30.33±2.52##21.67±2.08##組別正常對照組甘露醇對照組模型組化瘀明目方低劑量組化瘀明目方中劑量組化瘀明目方高劑量組劑量/（g·kg-1）---9.29 18.57 37.14

2.3 化瘀明目方含藥血清對HRMECs 遷移能力的影響結(jié)果見圖2、表5。甘露醇對照組與正常對照組遷移細(xì)胞數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常對照組比較，模型組遷移細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.01）。與模型組比較，化瘀明目方低、中、高劑量組遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）

圖2 HRMECs 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果（×100）Figure 2 Results of HRMECs transwell experiment（×100）

表5 化瘀明目方含藥血清對HRMECs 遷移能力的影響（n=3，±s）Table 5 Effects of HMR-containing serum on the migration ability of HRMECs（n=3，±s）

表5 化瘀明目方含藥血清對HRMECs 遷移能力的影響（n=3，±s）Table 5 Effects of HMR-containing serum on the migration ability of HRMECs（n=3，±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

遷移細(xì)胞數(shù)/個(gè)174.00±8.89 161.33±9.45 514.33±15.57**312.33±14.84##267.67±11.72##216.00±7.00##組別正常對照組甘露醇對照組模型組化瘀明目方低劑量組化瘀明目方中劑量組化瘀明目方高劑量組劑量/（g·kg-1）---9.29 18.57 37.14

2.4 化瘀明目方含藥血清對HRMECs 管腔形成能力的影響結(jié)果見圖3、表6。甘露醇對照組與正常對照組血管分支節(jié)點(diǎn)、管腔總長度、血管形成數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常對照組比較，模型組血管分支節(jié)點(diǎn)、管腔總長度、血管形成數(shù)均明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，化瘀明目方低、中、高劑量組的血管分支數(shù)、管腔總長度、血管形成數(shù)均明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 HRMECs 管腔形成結(jié)果（×50）Figure 3 Results of HRMECs Angiogenesis（×50）

表6 化瘀明目方含藥血清對HRMECs 管腔形成能力的影響（n=3，±s）Table 6 Effects of HMR-containing serum on the tube formation ability of HRMECs（n=3，±s）

表6 化瘀明目方含藥血清對HRMECs 管腔形成能力的影響（n=3，±s）Table 6 Effects of HMR-containing serum on the tube formation ability of HRMECs（n=3，±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

血管形成數(shù)/個(gè)1.00±1.00 0.67±0.58 20.67±2.08**14.67±1.53#10.67±1.53##5.33±0.58##組別正常對照組甘露醇對照組模型組化瘀明目方低劑量組化瘀明目方中劑量組化瘀明目方高劑量組劑量/（g·kg-1）---9.29 18.57 37.14血管分支節(jié)點(diǎn)/個(gè)11.33±1.53 9.67±1.53 67.00±4.00**54.33±3.06#38.67±4.04##26.33±3.51##管腔總長度/mm 3.29±0.12 3.20±0.17 8.51±0.06**7.84±0.15#7.01±0.21##4.43±0.23##

2.5 化瘀明目方含藥血清對FactorⅧ、CD31、CD34、VEGFA、VEGFR2 陽性細(xì)胞數(shù)的影響結(jié)果見圖4、表7。甘露醇對照組與正常對照組FactorⅧ、CD31、CD34、VEGFA 及VEGFR2 陽性細(xì)胞數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常對照組比較，模型組FactorⅧ、CD31、CD34、VEGFA 及VEGFR2 的陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，化瘀明目方低、中、高劑量組的Factor Ⅷ、CD31、CD34、VEGFA 及VEGFR2 陽性細(xì)胞數(shù)均明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 HRMECs 免疫熒光染色結(jié)果（×100）Figure 4 Results of immunofluorescence staining of HRMECs（×100）

表7 化瘀明目方含藥血清對血管生成相關(guān)因子及VEGFA、VEGFR2 陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)的影響（n=6，±s）Table 7 Effects of HMR-containing serum on the expressions of the angiogenesis related factors，VEGFA and VEGFR2 positive cells（n=6，±s）

表7 化瘀明目方含藥血清對血管生成相關(guān)因子及VEGFA、VEGFR2 陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)的影響（n=6，±s）Table 7 Effects of HMR-containing serum on the expressions of the angiogenesis related factors，VEGFA and VEGFR2 positive cells（n=6，±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

VEGFR2 135.83±12.35 139.50±10.65 250.33±9.67**229.00±12.57#202.67±13.34##162.17±9.56##組別正常對照組甘露醇對照組模型組化瘀明目方低劑量組化瘀明目方中劑量組化瘀明目方高劑量組劑量/（g·kg-1）---9.29 18.57 37.14 FactorⅧ150.83±7.36 153.83±6.18 268.67±9.58**235.33±7.79##210.17±13.44##179.50±9.61##CD31 136.33±7.34 130.67±10.01 243.50±7.04**220.33±18.42#195.17±10.28##165.17±8.95##CD34 132.67±7.74 145.67±8.09 264.17±9.24**247.67±6.28#222.33±9.83##189.5±10.37##VEGFA 148.00±6.93 134.67±8.82 257.33±8.59**236.83±10.76#207.83±10.07##174.00±7.82##

2.6 化瘀明目方含藥血清對VEGFA、VEGFR2 蛋白表達(dá)水平的影響結(jié)果見圖5、表8。甘露醇對照組與正常對照組細(xì)胞VEGFA、VEGFR2 蛋白相對表達(dá)量的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常對照組比較，模型組VEGFA、VEGFR2 蛋白相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，化瘀明目方低、中、高劑量組VEGFA、VEGFR2 蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（P＜0.01）。

圖5 HRMECs 免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 5 Results of Western Blot of HRMECs

表8 化瘀明目方含藥血清對VEGFA、VEGFR2 蛋白相對表達(dá)水平的影響（n=6，±s）Table 8 Effects of HMR containing serum on the relative protein expression of VEGFA and VEGFR2（n=6，±s）

表8 化瘀明目方含藥血清對VEGFA、VEGFR2 蛋白相對表達(dá)水平的影響（n=6，±s）Table 8 Effects of HMR containing serum on the relative protein expression of VEGFA and VEGFR2（n=6，±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

劑量/（g·kg-1）VEGFR2 0.19±0.02 0.19±0.03 0.68±0.03**0.59±0.03##0.47±0.03##0.29±0.02##組別正常對照組甘露醇對照組模型組化瘀明目方低劑量組化瘀明目方中劑量組化瘀明目方高劑量組---9.29 18.57 37.14 VEGFA 0.21±0.03 0.20±0.03 0.79±0.04**0.64±0.03##0.54±0.03##0.44±0.02##

2.7 化瘀明目方含藥血清對FactorⅧ、CD31、CD34、VEGFA、VEGFR2 mRNA 表達(dá)水平的影響結(jié)果見圖6、表9。甘露醇對照組與正常對照組FactorⅧ、CD31、CD34、VEGFA及VEGFR2 mRNA表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常對照組比較，模型組Factor Ⅷ、CD31、CD34、VEGFA 及VEGFR2 mRNA 表達(dá)水平均明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，化瘀明目方低、中、高劑量組FactorⅧ、CD31、CD34、VEGFA及VEGFR2 mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 各基因溶解曲線及擴(kuò)增曲線Figure 6 Dissolution and amplification curves of each gene

表9 化瘀明目方含藥血清對血管生成相關(guān)因子及VEGFA、VEGFR2 mRNA 表達(dá)水平的影響（n=6，±s）Table 9 Effects of HMR-containing serum on the mRNA expressions of angiogenesis related factors，VEGFA and VEGFR2（n=6，±s）

表9 化瘀明目方含藥血清對血管生成相關(guān)因子及VEGFA、VEGFR2 mRNA 表達(dá)水平的影響（n=6，±s）Table 9 Effects of HMR-containing serum on the mRNA expressions of angiogenesis related factors，VEGFA and VEGFR2（n=6，±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

VEGFR2 1.00±0.06 1.01±0.11 3.20±0.30**2.58±0.38#2.07±0.27##1.51±0.15##組別正常對照組甘露醇對照組模型組化瘀明目方低劑量組化瘀明目方中劑量組化瘀明目方高劑量組劑量/（g·kg-1）---9.29 18.57 37.14 FactorⅧ1.00±0.07 1.00±0.16 3.13±0.32**2.63±0.21#1.98±0.26##1.46±0.20##CD31 1.00±0.05 1.00±0.20 3.33±0.22**2.79±0.34#2.05±0.20##1.56±0.32##CD34 1.00±0.07 1.03±0.21 3.36±0.32**2.82±0.26#1.99±0.16##1.48±0.16##VEGFA 1.00±0.08 1.02±0.16 3.47±0.32**2.92±0.32#2.11±0.22##1.52±0.22##

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是由糖尿病導(dǎo)致的機(jī)體代謝紊亂從而引發(fā)的視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)的損傷，是導(dǎo)致成年工作人口可預(yù)防性失明的主要原因。一個(gè)納入了59 項(xiàng)大樣本人群調(diào)查研究的薈萃分析顯示全球糖尿病患者中糖尿病視網(wǎng)膜病變患病率22.27% ，截止到2045 年，全球成人的糖尿病視網(wǎng)膜病變患病人數(shù)將由2020 年的1.031 2 億上升至1.605 億，隨著全球糖尿病發(fā)病率的逐年攀升，糖尿病視網(wǎng)膜病變現(xiàn)已成為世界范圍的公共衛(wèi)生問題[6-7]。根據(jù)糖尿病視網(wǎng)膜病變程度，分為非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（（nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR）和增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）兩大類，新生血管是PDR 的標(biāo)志性病理改變。視網(wǎng)膜毛細(xì)血管主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞組成，二者與包繞在外的Müller 細(xì)胞共同構(gòu)成了血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障（inner blood-retinal barrier，iBRB），糖尿病視網(wǎng)膜病變病理過程中，持續(xù)高血糖引起周細(xì)胞選擇性丟失，iBRB 受損，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增生，基底膜增厚，進(jìn)而引發(fā)管腔狹窄和血流動力學(xué)改變，最終促使視網(wǎng)膜缺血、缺氧和新生血管形成等糖尿病視網(wǎng)膜病變后期特征改變[8-9]。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病視網(wǎng)膜病變屬于“暴盲”“視瞻昏渺”等疾病范疇，主要病機(jī)為氣陰兩虛夾瘀?；雒髂糠绞潜狙芯拷M左韜教授在臨床診治眼病過程中探索積累所得，方中生地黃、黃芪為君；丹參、墨旱蓮、蒲黃、丹皮、茯苓為臣；莪術(shù)、虎杖、蟬蛻為佐；山楂為使；全方共奏益氣養(yǎng)陰、化瘀明目之效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明生地黃活性成分多糖能夠改善胰島β 細(xì)胞功能、調(diào)節(jié)糖代謝紊亂[10]；黃芪甲苷能夠保護(hù)糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞改善糖尿病視網(wǎng)膜病變，抑制高糖條件下Müller細(xì)胞的VEGF生成[11-13]；丹參能改善糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、降低血管阻塞風(fēng)險(xiǎn)，可用作治療糖尿病血管病的潛在輔助藥物[14]；丹參酮ⅡA作為丹參脂溶性活性成分代表可以抗血管生成，改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的形態(tài)學(xué)性能，抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變[15]；墨旱蓮石油醚提取物可以降低糖尿病大鼠血糖、血脂含量[16]；蒲黃提取物能夠改善糖尿病視網(wǎng)膜組織病變，下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、VEGFR2、Ang-1 和b-FGF 表達(dá)，改善糖尿病視網(wǎng)膜病變[17-18]；丹皮的主要活性成分丹皮酚及其他活性成分均具有降糖作用，丹皮酚可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，對糖尿病并發(fā)癥也有所改善[19]；茯苓胞外多糖能促進(jìn)肝糖原合成，加快葡萄糖消耗，還可明顯抑制α-葡萄糖苷酶活性，與其它藥配伍可明顯降低空腹血糖，是一種潛在的天然降糖藥[20-22]。

FactorⅧ、CD31、CD34 是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物，可用以衡量血管新生，其中FactorⅧ因子是血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定的金指標(biāo)[23-24]，CD34 是主導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管形成的重要因子。研究[25-27]表明FactorⅧ與CD34聯(lián)合可區(qū)分新生血管的活躍度，CD31具有調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞遷移、參與構(gòu)建新生血管等功能，是微血管形成的良好標(biāo)記物。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[28]表明糖尿病小鼠視網(wǎng)膜CD31陽性微血管數(shù)較正常小鼠增多。本研究結(jié)果顯示25.0 mmol·L-1高糖能夠刺激HRMECs的FactorⅧ、CD31、CD34 蛋白及mRNA 表達(dá)水平升高，化瘀明目方含藥血清對高糖刺激下血管生成相關(guān)細(xì)胞因子的異常表達(dá)具有抑制作用，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。

VEGF 具有誘導(dǎo)特性和強(qiáng)滲透性，能夠特異性刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，增加血管通透性，促進(jìn)血管新生，其家族成員VEGFA 被認(rèn)為是PDR診斷及治療的新靶點(diǎn)[29-30]。VEGFR2 是VEGF 在改善血管通透性、促血管生成過程中的主要介質(zhì)，VEGFA 與VEGFR2 特異性結(jié)合能夠啟動VEGFA/VEGFR2 信號通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，加快糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)程[31]。本研究于體外成功復(fù)制了高糖下HRMECs 功能紊亂模型模擬糖尿病視網(wǎng)膜病變病理環(huán)境，這與文哲瑤、李宏麗、石穎等[32-34]的研究結(jié)果相一致。本研究結(jié)果顯示25.0 mmol·L-1高糖能夠促進(jìn)HRMECs 細(xì)胞VEGFA、VEGFR2 蛋白及mRNA表達(dá)水平升高，促進(jìn)HRMECs 增殖、遷移及管腔形成，化瘀明目方含藥血清對此具有抑制作用，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。本研究使用與高糖同等濃度的甘露醇作為對照，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空白對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，排除了高濃度葡萄糖的滲透壓因素。

綜上，本研究顯示，化瘀明目方含藥血清能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HRMECs 的增殖、遷移和管腔形成，最終預(yù)防或減少視網(wǎng)膜新生血管的形成，延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變病程進(jìn)展，其機(jī)制可能與VEGFA/VEGFR2信號通路有關(guān)。今后將繼續(xù)深入探索下游信號通路及相關(guān)靶點(diǎn)，完善化瘀明目方在防治糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用機(jī)制，以期為臨床治療提供理論依據(jù)。