鄧成杰，馬洪星，張華茜，胡月周，黃靜，孫世芹，辛萍（. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院，黑龍江大慶 69；. 江蘇省南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 00；. 江蘇省南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院科教科，江蘇南京 00）

炎癥反應(yīng)是對(duì)組織損傷和病原體入侵和感染的快速防御反應(yīng)。巨噬細(xì)胞及其它吞噬細(xì)胞是宿主抵御微生物入侵的首要防線，可以吞噬炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的有害物質(zhì)并維持體內(nèi)平衡，也是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵免疫細(xì)胞[1]。巨噬細(xì)胞的持續(xù)活化會(huì)分泌腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6和IL-1β等大量的炎癥介質(zhì)，這些介質(zhì)不受控制的產(chǎn)生或過量分泌與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2-4]。巨噬細(xì)胞表面的TLR-4 受體的激活會(huì)啟動(dòng)胞內(nèi)下游炎癥信號(hào)通路，包括JAK-STAT、MAPK 和PI3K-AKT 等[5-7]。目前，臨床上JAK-STAT 抑制劑在治療包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等炎癥相關(guān)疾病方面顯示出很大的優(yōu)勢(shì)，持續(xù)激活的JAK-STAT信號(hào)通路在某些病理?xiàng)l件下，經(jīng)常引起慢性炎癥和炎癥介導(dǎo)的癌癥[8]。在炎癥狀態(tài)下，細(xì)胞膜表面的細(xì)胞因子與受體和配體相結(jié)合產(chǎn)生二聚化從而激活下游信號(hào)通路JAK2-STAT3[9]。已有研究[10]表明，抑制JAK2-STAT3蛋白激酶的磷酸化能夠減少促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌和表達(dá)，進(jìn)而有效抑制炎癥反應(yīng)。

蘇木酮A（Sappanone A，SA）屬于高異黃酮類化合物，是從豆科云實(shí)屬植物蘇木（CaesalpiniasappanL.）的心材中分離出來的單體[11]。蘇木主要分布于東南亞，具有活血祛瘀、消腫止痛的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[12-14]表明，蘇木酮A具有多種生物活性，如抗神經(jīng)炎、抗腫瘤、抗氧化和免疫抑制等活性。然而，蘇木酮A的抗炎活性及其潛在的分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，以評(píng)價(jià)蘇木酮A的抗炎活性并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)小鼠單核巨噬RAW264.7 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫，培養(yǎng)在含有10%FBS 的高糖DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞密度約達(dá)到80%，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑蘇木酮A（純度≥98%），赫利森生物科技有限公司，批號(hào)：HS030-10-04；AG490（JAK2 特異性抑制劑），美國(guó)Selleck&bimake 公司，批號(hào)：S114303；脂多糖（LPS），北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：462H031；胎牛血清（FBS）浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)：19070704；DMEM高糖培養(yǎng)基，美國(guó)GE 公司，批號(hào)：AD20616263；MTT，北京伊塔生物科技有限公司，批號(hào)：EZ2811B347；小鼠IL-6 ELISA 試劑盒，北京欣博盛生物科技有限公司，批號(hào)：M180327-004a；總RNA提取試劑盒，上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司，批號(hào)：0000278076；SYBR@Green Realtime PCR Master Mix 試劑盒，上海東洋紡生物科技有限公司，批號(hào)：841500；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：052319190910；JAK2（批號(hào)：H08233592）、p-JAK2（批號(hào)：G04152997）、STAT3（批號(hào)： G07143207）、 p- STAT3（批號(hào)：G04153001）一抗，均購(gòu)自萬類生物科技有限公司；β-actin 一抗（批號(hào)：191050722）、兔二抗（批號(hào)：139931），均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器Airstream?Gen 3 ESCO 超凈工作臺(tái)，深圳市賽亞泰科儀器設(shè)備公司；BioTekSynergyHT 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek 公司；AE2000 倒置顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠；Centrifuge 5430R 超低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；LightCycler 480 PCR儀，瑞士Roche 公司；AI600 超靈敏多功能成像儀，美國(guó)GE公司。

1.4 MTT 法測(cè)定細(xì)胞存活率將RAW264.7 細(xì)胞以1.5×104個(gè)·孔-1接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，每組平行設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h；棄掉培養(yǎng)液，用不同濃度梯度SA、LPS、AG490 分別處理20 h 后；然后每孔加入200 μL 的0.5 mg·mL-1MTT 溶液，在5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 h；吸去上清液，每孔加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），用酶標(biāo)儀在492 nm處檢測(cè)各孔吸光度（OD）值。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)孔OD值/空白孔OD值×100%。

1.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞IL-6分泌水平將2×105個(gè)·mL-1RAW264.7 細(xì)胞懸液接種于24 孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL。培養(yǎng)20 h 后，除空白組外，其余各孔均加入100 ng·mL-1LPS 刺激。設(shè)置LPS 模型組，蘇木酮A低、中、高劑量組（1.25，2.5、5 μg·mL-1），蘇木酮A中劑量聯(lián)合抑制劑組（2.5 μg·mL-1蘇木酮A+10 μg·mL-1AG490）、蘇木酮A 高劑量聯(lián)合抑制劑組（5 μg·mL-1蘇木酮A+10 μg·mL-1AG490），處理細(xì)胞20 h。收集上清液，按ELISA試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)IL-6分泌水平。

1.6 RT-qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞IL-6、JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)水平將4×105個(gè)·mL-1RAW264.7 細(xì)胞懸液接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL。培養(yǎng)20 h后，除空白組外，其余各孔均加入100 ng·mL-1LPS刺激。設(shè)置LPS模型組、高劑量（5 μg·mL-1）蘇木酮A組、蘇木酮A高劑量聯(lián)合抑制劑組（5 μg·mL-1蘇木酮A+10 μg·mL-1AG490），處理細(xì)胞20 h。使用EastepSuper 總RNA 提取試劑盒提取RAW264.7 細(xì)胞總RNA，進(jìn)行定量，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green PCR master mix 試劑盒對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，階段1：95 ℃、30 s；階段2：95 ℃、5 s；55 ℃、10 s；72 ℃、15 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作內(nèi)參，運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算各組間mRNA 表達(dá)水平差異并歸一化處理。所使用的引物序列如表1所示，引物由賽默飛科技（中國(guó)）有限公司合成。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences of Real-Time qPCR

1.7 Western Blot 法檢測(cè)細(xì)胞JAK2、STAT3 蛋白水平的表達(dá)將4×105個(gè)·mL-1RAW264.7細(xì)胞懸液接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，細(xì)胞培養(yǎng)、分組及給藥同“1.6”項(xiàng)下。向6 孔板中加入含有1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度；上樣量30 μg蛋白，經(jīng)8%～15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜；5%的脫脂牛奶封閉1 h后，用0.1%的Tween 20（T-TBS）洗滌。孵育一抗，于4 ℃過夜；第2 天，取出用TTBS 洗滌，在室溫下孵育二抗1 h 后，用T-TBS 洗滌，ECL熒光劑將蛋白可視化，在超靈敏多功能成像儀AI600 進(jìn)行顯影。使用ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘇木酮A、LPS 和AG490 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響采用MTT 法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2～表4。以5、10、 20、40和80 μg·mL-1蘇木酮A處理RAW264.7細(xì)胞，結(jié)果顯示與空白組比較，5 μg·mL-1蘇木酮A 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率無影響（P＞0.05），故選取1.25、2.5、5 μg·mL-1蘇木酮A 作為炎性細(xì)胞因子IL-6 的處理濃度。與空白組比較，50、100、500 ng·mL-1LPS 處理的RAW264.7 細(xì)胞對(duì)細(xì)胞存活能力無影響（P＞0.05），1 000 ng·mL-1LPS 可明顯降低RAW264.7 細(xì)胞的存活率（P＜0.05），故選取100 ng·mL-1LPS來建立RAW264.7細(xì)胞炎性模型。以濃度為5、10、15、20、25 μg·mL-1的AG490 處理RAW264.7 細(xì)胞，結(jié)果顯示與空白組比較，5 和10 μg·mL-1AG490對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活無影響（P＞0.05），故選取濃度為10 μg·mL-1的AG490 進(jìn)行后續(xù)分子水平研究。

表2 蘇木酮A（SA）對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響（±s，n=5）Table 2 Effect of sappanone A（SA）on the survival rate of RAW264.7 cells（±s，n=5）

表2 蘇木酮A（SA）對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響（±s，n=5）Table 2 Effect of sappanone A（SA）on the survival rate of RAW264.7 cells（±s，n=5）

注：與空白組比較，**P＜0.01

細(xì)胞存活率/%100.00±13.13 96.36±19.09 47.77±9.44**40.99±4.27**15.54±3.37**5.29±1.30**組別空白組蘇木酮A組濃度/（μg·mL-1）-5 10 20 40 80 OD值2.187±0.287 2.087±0.414 1.045±0.206 0.896±0.093 0.340±0.074 0.116±0.028

表3 脂多糖（LPS）對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響（±s，n=5）Table 3 Effect of lipopolysaccharide（LPS）on the survival rate of RAW264.7 cells（±s，n=5）

表3 脂多糖（LPS）對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響（±s，n=5）Table 3 Effect of lipopolysaccharide（LPS）on the survival rate of RAW264.7 cells（±s，n=5）

注：與空白組比較，*P＜0.05

細(xì)胞存活率/%100.00±1.46 97.69±2.94 95.36±5.51 98.89±11.16 88.27±10.10*組別空白組LPS組濃度/（ng·mL-1）-50 100 500 1 000 OD值1.873±0.027 1.830±0.055 1.786±0.103 1.852±0.209 1.594±0.064

表4 AG490 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響（±s，n=5）Table 4 Effect of AG490 on the survival rate of RAW264.7 cells（±s，n=5）

表4 AG490 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響（±s，n=5）Table 4 Effect of AG490 on the survival rate of RAW264.7 cells（±s，n=5）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

細(xì)胞存活率/%100.00±4.25 94.36±13.81 98.37±15.25 91.29±10.00*79.51±5.15**68.34±3.04**組別空白組AG490組濃度/（μg·mL-1）-5 10 15 20 25 OD值1.933±0.082 1.791±0.206 1.902±0.295 1.765±0.193 1.537±0.100 1.321±0.059

2.2 蘇木酮A 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞IL-6水平的影響結(jié)果見圖1。與空白組比，LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生IL-6 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比，蘇木酮A 低劑量組IL-6 水平與模型組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中、高劑量組RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6 明顯降低（P＜0.01）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證蘇木酮A 的抗炎效果，我們使用JAK2的特異性抑制劑AG490 與蘇木酮A 聯(lián)合處理，蘇木酮A中劑量聯(lián)合抑制劑組、蘇木酮A高劑量聯(lián)合抑制劑組的RAW264.7 細(xì)胞IL-6 分泌水平均明顯降低（P＜0.01）。

圖1 蘇木酮A（SA）對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞IL-6 水平的影響（±s，n=6）Figure 1 Effects of sappanone A（SA）on the level of IL-6 in LPS-induced RAW264.7 cells（±s，n=6）

2.3 蘇木酮A 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞IL-6、JAK2 及STAT3 mRNA 的表達(dá)的影響結(jié)果見圖2。與空白組比，模型組IL-6、JAK2 及STAT3 mRNA 表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比，蘇木酮A 高劑量組及蘇木酮A 高劑量聯(lián)合抑制劑組的IL-6、JAK2 和STAT3 mRNA 表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），且二者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 蘇木酮A（SA）對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞IL-6、JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=6）Figure 2 Effects of sappanone A（SA）on the mRNA expressions of IL-6，JAK2 and STAT3 in LPS-induced RAW264.7 cells（±s，n=6）

2.4 SA 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖3。與空白組比，LPS 模型組的p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；蘇木酮A 高劑量組、蘇木酮A 高劑量聯(lián)合抑制劑組均明顯下調(diào)p-JAK2、p-STAT3 蛋白的表達(dá)（P＜0.01），且二者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

炎癥與大多數(shù)疾病的病理生理過程的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在炎癥過程中會(huì)分泌大量的炎癥細(xì)胞因子，可作用于多種細(xì)胞并引發(fā)“炎癥因子風(fēng)暴”，這種過度的不可控的炎癥反應(yīng)加劇了對(duì)細(xì)胞的損傷，最終導(dǎo)致多種炎癥疾病破壞機(jī)體健康或死亡[15-16]。RAW264.7細(xì)胞作為機(jī)體內(nèi)非常重要的免疫細(xì)胞和炎癥效應(yīng)細(xì)胞，在自身免疫性疾病、炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[17]。當(dāng)外界因素刺激RAW264.7 細(xì)胞時(shí)，會(huì)導(dǎo)致促炎因子大量生成并釋放，如TNF-α、IL-1β 和IL-6 等。因此，抑制RAW264.7細(xì)胞中促炎性因子的表達(dá)和釋放被認(rèn)為是預(yù)防和治療炎癥性疾病的潛在策略。Najjar 等[18]研究LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中山茱萸多酚提取物的抗炎效果，蛋白水平結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β和IL-6均明顯下調(diào)。Lampiasi 等[19]利用LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)阿魏酸能夠抑制IL-6 mRNA 表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，蘇木酮A 或蘇木酮A 聯(lián)合AG490 均可抑制RAW264.7細(xì)胞中炎性因子IL-6的釋放，這說明蘇木酮A或蘇木酮A聯(lián)合AG490均能通過降低炎性因子的表達(dá)來改善LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥，并且蘇木酮A的處理濃度越高，抑制IL-6釋放越明顯，抗炎作用越好。

JAK2-STAT3信號(hào)通路的持續(xù)激活與許多炎癥性和免疫疾病密切相關(guān)，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、敗血癥以及腫瘤性疾病等[2-4]。在炎癥過程中，JAK2-STAT3 是受細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的主要信號(hào)通路，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制相對(duì)簡(jiǎn)單。當(dāng)細(xì)胞受到外源性LPS刺激后，會(huì)分泌炎癥細(xì)胞因子并與細(xì)胞表面的膜受體相結(jié)合，首先激活細(xì)胞質(zhì)中JAK2激酶發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活下游STAT3 蛋白磷酸化并活化形成二聚體。最后，細(xì)胞質(zhì)中的二聚化STAT3 被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，進(jìn)一步促使細(xì)胞分泌一些炎癥細(xì)胞因子[20]。先前的研究[21]表明，JAK2-STAT3 信號(hào)通路可在LPS刺激的RAW264.7 細(xì)胞中激活并釋放炎性細(xì)胞因子，例如TNF-α、IL-1β和IL-6等。本研究中，我們研究了蘇木酮A 在LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞中對(duì)JAK2-STAT3磷酸化蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘇木酮A高劑量組和蘇木酮A 高劑量聯(lián)合抑制劑AG490 處理組均明顯下調(diào)p-JAK2、p-STAT3 蛋白的表達(dá)（P＜0.01），且二者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明蘇木酮A可能是潛在的JAK2-STAT3抑制劑，但仍需進(jìn)一步深入研究。以上結(jié)果表明，蘇木酮A可以通過抑制LPS刺激的JAK2磷酸化，進(jìn)而抑制STAT3的磷酸化，從而發(fā)揮抑制炎癥作用。

使用LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞是構(gòu)建體外炎癥的經(jīng)典模型，故本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上探討了蘇木酮A的抗炎活性及作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，蘇木酮A能夠下調(diào)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中p-JAK2 和p-STAT3 基因與蛋白表達(dá)，減少促炎因子IL-6 的分泌，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用，可為蘇木酮A在治療炎癥性疾病的藥物研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但在本研究中尚未涉及其他網(wǎng)絡(luò)調(diào)控信號(hào)的探索，我們擬在后續(xù)的研究中探討蘇木酮A是否通過其他網(wǎng)絡(luò)調(diào)控信號(hào)或靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎作用，并完善其分子作用機(jī)制。