趙韻琳 黃 詩(shī) 柯舒慧 林丹丹

武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北武漢 430060

液體活檢是指從體液中檢測(cè)各種指標(biāo)，主要是采集血液樣本，檢測(cè)指標(biāo)包括細(xì)胞游離DNA（cell free DNA，cfDNA）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、微RNA（microRNA，miRNA）等。血液樣本較組織樣本更易獲取、侵入性更小、監(jiān)測(cè)更便捷，且液體活檢為分子層面的檢測(cè)，較腫瘤標(biāo)志物更具特異性，能制訂個(gè)性化的檢測(cè)策略。

對(duì)于中低位局部晚期直腸癌（locally advanced rectal cancer，LARC），新輔助治療后達(dá)臨床完全緩解（clinical complete response，cCR）的患者甚至可行觀察和等待（watch and wait，W&W）方案，與行全直腸系膜切除術(shù)的患者生存預(yù)后基本無(wú)差異[1]。評(píng)估LARC 患者新輔助治療效果、監(jiān)測(cè)疾病的復(fù)發(fā)及預(yù)測(cè)生存預(yù)后對(duì)患者治療方案的選擇及其重要，常用的血液學(xué)指標(biāo)癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）特異性不高且結(jié)果較為單一[2]，因此，故探索創(chuàng)傷性更小、更簡(jiǎn)便且特異性更高的指標(biāo)尤為重要。

研究證實(shí)液體活檢在結(jié)直腸癌相關(guān)的多項(xiàng)研究中與疾病的早期發(fā)現(xiàn)、療效預(yù)測(cè)及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等多個(gè)節(jié)點(diǎn)相關(guān)[3]。

1 循環(huán)腫瘤DNA

1.1 ctDNA 在監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)中的應(yīng)用

腫瘤細(xì)胞向血液中分泌單鏈或雙鏈DNA 片段，此片段稱為ctDNA。ctDNA 的半衰期（約2 h）使其能夠用于動(dòng)態(tài)和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)癌癥進(jìn)展，且ctDNA 的檢測(cè)減少了腫瘤內(nèi)基因異質(zhì)性相關(guān)的偏倚，能從微觀層面特異性監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生與發(fā)展[4]。早在2015 年就有研究者對(duì)接受nCRT 的LARC 患者進(jìn)行ctDNA 的連續(xù)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)患者治療后ctDNA 下降，在CEA、影像學(xué)及病理監(jiān)測(cè)到疾病復(fù)發(fā)前ctDNA 進(jìn)行性升高[5]。對(duì)于目前LARC 中尚未大規(guī)模推行的W&W 策略，及時(shí)檢測(cè)到疾病復(fù)發(fā)并接受搶救性手術(shù)尤為重要，Boniface 等[6]長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)接受W&W 的LARC 患者，發(fā)現(xiàn)ctDNA 的升高早于臨床檢測(cè)的疾病復(fù)發(fā)，且其中1 例患者因局部復(fù)發(fā)行搶救性手術(shù)后ctDNA 下降。

這些研究顯示ctDNA 能用于LARC 的復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)，靈敏度比血液指標(biāo)CEA 更高[5-6]。因此可在監(jiān)測(cè)到患者ctDNA 升高時(shí)密切關(guān)注病情變化，有助于盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，進(jìn)一步改善患者預(yù)后。

1.2 ctDNA 在評(píng)估患者nCRT 后最小殘留病灶中的應(yīng)用

LARC 患者經(jīng)放化療或手術(shù)后ctDNA 的檢測(cè)率會(huì)有所下降，提示ctDNA 可能是由原發(fā)腫瘤釋放[7]。而Liu 等[8]通過(guò)收集LARC 患者基線、nCRT 治療過(guò)程中、nCRT 后及手術(shù)前的血樣預(yù)測(cè)最小殘留病灶（minimal residual diseases，MRD），發(fā)現(xiàn)ctDNA 狀態(tài)和病理完全緩解（pathologic complete response，pCR）之間并沒有關(guān)聯(lián)。盡管有研究在術(shù)前48 h 內(nèi)采集血樣，但也得到了相同的結(jié)論[7]。現(xiàn)有研究支持了ctDNA 分析無(wú)法區(qū)分LARC 患者新輔助治療后最小和無(wú)殘留局部病灶的觀點(diǎn)，目前不能用于選擇患者進(jìn)行非手術(shù)治療（W&W 策略）[9-11]。但可通過(guò)ctDNA 的變化預(yù)估LARC 患者nCRT 療效，有望與其他檢測(cè)技術(shù)共同判斷MRD 存在與否，為患者制訂個(gè)性化治療策略[12-13]。

1.3 ctDNA 與腫瘤分期及生存時(shí)間的關(guān)聯(lián)

在LARC 患者中治療前ctDNA 定量或者是否存在ctDNA 均與腫瘤TNM 分期無(wú)關(guān)，不同的檢測(cè)技術(shù)得到的結(jié)論是相同的，但較高的ctDNA 定量與較高的死亡風(fēng)險(xiǎn)和大概率的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[14-16]。術(shù)后可檢測(cè)到ctDNA 的LARC 患者無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間顯著短于術(shù)后不可檢測(cè)到ctDNA 的患者[9]。在LARC 患者新輔助治療后，NAR 評(píng)分通過(guò)治療前后T 和N 的分期計(jì)算，能間接反映接受新輔助治療的LARC 患者的最終生存結(jié)局，NAR 分值越低患者無(wú)病生存期越長(zhǎng)[17]。Mcduff 等[15]采用NAR 評(píng)分將LARC 患者分組，并分析入組的29 例患者監(jiān)測(cè)基線、nCRT 后及術(shù)后1～5 個(gè)月的ctDNA 變化，判斷ctDNA 變化與NAR 關(guān)系，發(fā)現(xiàn)nCRT 后未檢測(cè)到ctDNA 與檢測(cè)到ctDNA 的患者比較，具有更高比例的NAR 低分和NAR 中分，進(jìn)一步證實(shí)了ctDNA 能預(yù)估接受nCRT 治療的LARC 患者的生存預(yù)后。

2 其他液體活檢指標(biāo)

2.1 細(xì)胞游離DNA

cfDNA 是指循環(huán)血液中的核酸類物質(zhì)，在正常人血樣中也存在[18]。有項(xiàng)研究證實(shí)LARC 新輔助放化療（neoadjuvant radiochemotherapy，nCRT）前cfDNA 水平有利于鑒別高低?；颊撸€cfDNA 水平高于第75個(gè)四分位數(shù)的患者與低于第75 個(gè)的四分位數(shù)患者比較，局部或遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)更高，無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間更短[19]。由于cfDNA 本身特異性不高，在LARC 患者評(píng)估中發(fā)揮作用較小，單用cfDNA 總量無(wú)法準(zhǔn)確判斷患者生存預(yù)后，判斷nCRT 療效亦存在一定困難[20]。

2.2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞

CTC 為患者體液中的腫瘤細(xì)胞，部分研究采取測(cè)定mRNA 狀態(tài)判定CTC 的存在，而主要檢測(cè)方法仍是通過(guò)特異性靶點(diǎn)，著重于CTC 檢出與預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)一步分析CTC 上表達(dá)靶點(diǎn)對(duì)pCR 的預(yù)測(cè)作用[21]。

2.2.1 CTC 與患者生存預(yù)后 對(duì)腫瘤患者而言，CTC 檢出率越高往往提示疾病預(yù)后不佳[21]，與以往研究結(jié)果不同，Magni 等[22]通過(guò)CellSearch System 識(shí)別接受nCRT的LARC 患者血液中有細(xì)胞核且胞質(zhì)表達(dá)CD45 靶點(diǎn)的CTC，CTC 陽(yáng)性并沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的與預(yù)后相關(guān)。但該研究中CTC 的檢測(cè)效率較低，檢測(cè)效率是否影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法評(píng)估，所以CTC 能否預(yù)估LARC 患者nCRT 后的生存狀態(tài)仍存在爭(zhēng)議，未來(lái)需大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2.2 CTC 評(píng)估nCRT 后反應(yīng) 多項(xiàng)研究表明，CTC 檢出率及RAD23B/TYMS 是否缺失與腫瘤療效相關(guān)，在LARC 患者nCRT 中也得到了相同的結(jié)果，即CTC 檢出率越高、RAD23B/TYMS 缺失者療效更差[23-25]。為了進(jìn)一步評(píng)估CTC 能否輔助檢測(cè)LARC 患者的MRD，有研究將PET、高分辨率MRI、CT 灌注成像及CTC 綜合檢測(cè)MRD，表明當(dāng)與CT 灌注成像的全腫瘤通透性和平均通過(guò)時(shí)間測(cè)量相結(jié)合時(shí)，CTC 可能有助于提高治療反應(yīng)評(píng)估的準(zhǔn)確性[26]。由于CTC 的檢測(cè)技術(shù)不同，效率也不盡相同，進(jìn)一步提高CTC 檢測(cè)效率或是尋找更多的靶點(diǎn)能更好識(shí)別MRD，為nCRT 后達(dá)到cCR 的LARC 患者是否接受手術(shù)治療提供支持依據(jù)。

2.3 微RNA（microRNA，miRNA）

通過(guò)檢索發(fā)現(xiàn)miRNA 在新輔助治療LARC 中的應(yīng)用集中在對(duì)nCRT 反應(yīng)狀態(tài)的評(píng)估，miRNA檢測(cè)中多選用特異的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），研究發(fā)現(xiàn)miRNA 相關(guān)SNP-SMAD3-rs744910、SMAD3-rs745103 和TRBPrs6088619 與nCRT 后pCR 率增加相關(guān)，而DROSHA rs10719 和SMAD3-rs17228212 提示更差的治療反應(yīng)[27]。還有研究比較了LARC 患者中對(duì)nCRT 敏感及不敏感的組別中的miRNA，確定miRNA-345 為檢測(cè)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)基線血樣中miRNA-345 低表達(dá)與nCRT 高應(yīng)答顯著相關(guān)[28]。另有研究提取LARC 患者外泌體中的miR NA，發(fā)現(xiàn)對(duì)新輔助治療不敏感的患者中miR-29a-3p高表達(dá)和miR-301a-3p 低表達(dá)，此外，miR-141-3p、miR-375、miR-423-5p 和miR-431-3p 在LARC 肝轉(zhuǎn)移患者（4 例）中的表達(dá)均較高[29]。

不同的miRNA 及miRNA 突變位點(diǎn)能預(yù)測(cè)LARC 患者nCRT 療效，但現(xiàn)有研究缺乏miRNA 評(píng)估LARC 患者的長(zhǎng)期生存預(yù)后的數(shù)據(jù)，有待進(jìn)一步探索。

3 總結(jié)與展望

本文綜合闡述液體活檢在LARC 新輔助治療中的現(xiàn)狀及應(yīng)用前景，有關(guān)研究探索集中在ctDNA、cfDNA、CRC 和miRNA。目前與LARC 新輔助治療效果預(yù)測(cè)及長(zhǎng)期預(yù)后監(jiān)測(cè)密切相關(guān)的主要是ctDNA，術(shù)前ctDNA 聯(lián)合影像學(xué)可提升pCR 檢出率[30]，術(shù)后ctDNA 可預(yù)測(cè)手術(shù)殘存的MRD，較傳統(tǒng)MRI 及CEA檢測(cè)能更及時(shí)監(jiān)控并預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)，特別是在達(dá)到病理完全緩解從而等待觀察的LARC 患者中，能輔助患者盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤病灶，及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)救性手術(shù)。

由于液體活檢中基線和新輔助治療后ctDNA 的狀態(tài)無(wú)法預(yù)估pCR，限制了單獨(dú)使用ctDNA 選擇器官保留方法。ctDNA 的檢測(cè)還未標(biāo)準(zhǔn)化，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中時(shí)間節(jié)點(diǎn)、采集部位、檢測(cè)方法等方面存在差異。未來(lái)研究可以將液體活檢補(bǔ)充至預(yù)測(cè)LARC 新輔助治療反應(yīng)的傳統(tǒng)方法中，判斷結(jié)合傳統(tǒng)指標(biāo)能否更好地預(yù)測(cè)患者達(dá)到pCR，或在新輔助治療甚至全程治療中，監(jiān)測(cè)療效、評(píng)估預(yù)后及監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)，同時(shí)對(duì)于術(shù)后及等待觀察的患者，更好地尋找下一步干預(yù)節(jié)點(diǎn)及輔助治療手段，評(píng)估液體活檢的應(yīng)用是否能進(jìn)一步提高接受新輔助治療的LARC 患者生存時(shí)間和生存質(zhì)量。