董文雪 ，馬 靜,2 ，何 環(huán) ，朱燕峰 ，尤云楠 ，陳 浮2,

（1.中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院, 江蘇 徐州 221000；2.河海大學(xué) 公共管理學(xué)院, 江蘇 南京 211000；3.中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 礦山生態(tài)修復(fù)教育部工程研究中心, 江蘇 徐州 221116）

0 引 言

經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展離不開能源的支撐，但化石能源開采破壞當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境[1]，嚴(yán)重制約區(qū)域經(jīng)濟(jì)－社會(huì)－生態(tài)和諧和永續(xù)發(fā)展，尤其是黃淮平原礦區(qū)[2]。該區(qū)地下潛水位高、地質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、糧煤高度疊合[3]，煤炭開采后地表快速沉陷，形成深1.0～4.0 m 不等的洼地[4]，雨季積水成湖，改變區(qū)域水系和水循環(huán)，導(dǎo)致礦業(yè)和農(nóng)田下泄水直排，極易造成水體富營(yíng)養(yǎng)化，威脅區(qū)域生態(tài)和糧食安全[5]。東部地區(qū)土地資源稀缺、價(jià)值量高，一般采用重構(gòu)土壤、改善排水、綠肥培土[2]等方式修復(fù)受損耕地，期望重建礦區(qū)生態(tài)、恢復(fù)土壤生產(chǎn)力[6]。然而，受地下高潛水季節(jié)變動(dòng)和矸石充填的影響，復(fù)墾土壤團(tuán)聚結(jié)構(gòu)差、pH 值高、肥力低[7]，導(dǎo)致生產(chǎn)效益不高，企業(yè)、政府和當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶均缺乏復(fù)墾積極性。因此，提升復(fù)墾土地生產(chǎn)力，對(duì)保護(hù)黃淮平原耕地資源至關(guān)重要。

黃淮平原礦區(qū)缺少土源，一般復(fù)墾只能采用“挖深填淺＋矸石充填”相結(jié)合方式[8]。但受土體構(gòu)型、潛水淋洗和有害污染的影響，復(fù)墾土壤微生物區(qū)系發(fā)育受限[1]，農(nóng)田生態(tài)恢復(fù)缺少激發(fā)效應(yīng)和恢復(fù)力，導(dǎo)致養(yǎng)分循環(huán)不暢、恢復(fù)緩慢。微生物是土壤物質(zhì)循環(huán)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的重要催化劑，在腐植酸形成、有機(jī)質(zhì)分解以及維持土壤生產(chǎn)力、抵抗非生物脅迫等過程中發(fā)揮著不可替代的作用[9]。土壤微生物作為土壤最活躍的組分，對(duì)外界環(huán)境變化十分敏感，并能迅速改變自身結(jié)構(gòu)與組成，適應(yīng)外界環(huán)境的變化[10]。因此，礦區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能變化可作為判斷礦山復(fù)墾土壤質(zhì)量的指示性指標(biāo)[4]。先前礦區(qū)復(fù)墾多關(guān)注土壤重構(gòu)、農(nóng)田平整、水利配套等工程技術(shù)[8,11]，對(duì)土壤生態(tài)功能和微生物資源作用缺乏關(guān)注[12-13]。盡管有研究發(fā)現(xiàn)復(fù)墾能顯著增加微生物多樣性且與復(fù)墾時(shí)長(zhǎng)呈正相關(guān)關(guān)系[14-15]，但對(duì)復(fù)墾土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能缺少長(zhǎng)序列監(jiān)測(cè)和評(píng)估，導(dǎo)致復(fù)墾土壤微生物區(qū)系發(fā)育不清、功能及其演替的環(huán)境驅(qū)動(dòng)機(jī)制不明，亟待開展深入研究。

為此，采用高通量測(cè)序技術(shù)及PICRUSt2 和FUNGuild 分析工具探測(cè)山東省鄒城市東灘礦區(qū)不同復(fù)墾年限下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與組成的變化，揭示土壤微生物區(qū)系演替規(guī)律及環(huán)境控制因子，為黃淮平原礦區(qū)廢棄土地資源科學(xué)再利用提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 研究區(qū)概況與研究方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于山東省鄒城市東灘礦采煤沉陷復(fù)墾區(qū)（35°25′52″N、116°52′39″E），屬暖溫帶季風(fēng)氣候，年均氣溫14.1 ℃，年均降水777.1 mm。該區(qū)為典型平原地貌，海拔為（45.2±1.0） m，沉陷前為耕地，土壤類型為棕色潮土，砂粒、粉粒和黏粒質(zhì)量百分含量分別為223.3 g/kg、658.7 g/kg 和118.0 g/kg，土壤密度1.48 g/cm。2001 年后采用矸石充填（200～400 cm）＋表土回填（60～80 cm）復(fù)墾工藝＋二次機(jī)械壓實(shí)作業(yè)方式間隔實(shí)施4 次，分別為復(fù)墾9 a（編號(hào)R9）、復(fù)墾12 a（編號(hào)R12）、復(fù)墾15 a（編號(hào)R15）、復(fù)墾18 a（編號(hào)R18），每次復(fù)墾采用工藝和客土來源相同，且復(fù)墾為耕地，每個(gè)復(fù)墾地塊面積約2.0 hm2，復(fù)墾后耕地由礦業(yè)集團(tuán)發(fā)包給農(nóng)業(yè)種植公司統(tǒng)一輪作耕作，種植小麥和大豆，一年兩熟。小麥單季施常規(guī)復(fù)合肥600.0 kg/hm2作底肥，撥節(jié)時(shí)施氮肥150.0 kg/hm2，機(jī)械化收割時(shí)留茬高20～25 cm。大豆單季施量常規(guī)復(fù)合肥450.0 kg/hm2作底肥，機(jī)械化收割時(shí)自動(dòng)粉碎還田。并選取附近未受采礦破壞，由農(nóng)業(yè)種植公司統(tǒng)一經(jīng)營(yíng)的農(nóng)田作為對(duì)照（CK），整個(gè)研究區(qū)除復(fù)墾時(shí)間不同外，成土母質(zhì)、地形條件、氣候水文、種植模式和施肥管理均基本一致。

1.2 樣品采集、處理與測(cè)試

2020 年8 月22－23 日，采用梅花五點(diǎn)混合采樣法收集5 個(gè)處理組0～10 cm 表土樣約1 000 g，每個(gè)處理設(shè)13 個(gè)重復(fù)，總共采集65 個(gè)土樣。表土作為土壤養(yǎng)分和物質(zhì)代謝最活躍的部分，是監(jiān)測(cè)重構(gòu)土壤質(zhì)量變化的關(guān)鍵。樣品采集后剔除石礫、動(dòng)植物殘?bào)w等雜質(zhì)，充分混合后分成2 份。所有樣品采用無菌聚乙烯袋密封包裝，置于-20 ℃車載冰箱保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后迅速進(jìn)行后續(xù)處理。一份室內(nèi)風(fēng)干，磨碎過2 mm 篩，測(cè)定土壤基本理化性質(zhì)和部分土壤酶活性；另一份新鮮土樣直接提取微生物總DNA，測(cè)定相關(guān)微生物信息。其中：pH 采用電位法（水土質(zhì)量比為2.5∶1）（DDS-307A，上海雷磁），銨態(tài)氮（AN）采用氯化鉀浸提-紫外分光光度法，硝態(tài)氮（NN）采用氯化鈣浸提-比色法，有效磷（AP）采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法，土壤有機(jī)碳（SOC）采用重鉻酸鉀-比色法[16]。亮氨酸氨基肽酶（LAP）、磷酸酶（PO）、β-葡萄糖苷酶（BG）及蛋白酶（PRO）采用活性試劑盒（索萊寶生物科技，北京）可見分光光度計(jì)測(cè)定[17]。

1.3 DNA 提取、純化、PCR 擴(kuò)增和高通量測(cè)序

65 個(gè)樣品總DNA 提取遵循Fast DNA SPIN kit（MP Biomedicals，美國(guó)）試劑盒說明書使用，將提取的總DNA 使用微量紫外分光光度計(jì)NanoDrop one 測(cè)定濃度和純度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。用引物515F（5′-GTGCCAGCCGGTAA-3′）和907R（ CCGTCAATTCMTTRAGTT） 對(duì)細(xì)菌 16S rRNA 的V4 和V5 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；引物ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS1（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對(duì)真菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增程序如下：① 94 ℃預(yù)變性5 min；② 94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，持續(xù)30 個(gè)循環(huán)；③ 72 ℃最終延伸10 min，降溫至4 ℃，實(shí)施擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit（Omega，美國(guó)）凝膠回收試劑盒對(duì)PCR 混合產(chǎn)物進(jìn)行回收，TE 緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA 片段。利用Illumina 公司（Illumina，美國(guó)）開發(fā)的NEBNext? UltraTM II DNA Library Prep Kit 制備測(cè)序文庫。構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit 和Q-PCR 定量確認(rèn)文庫合格后使用Illumina Nova 6000 平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增子文庫進(jìn)行PE250測(cè)序（美格基因，深圳）。

1.4 功能預(yù)測(cè)分析

使用PICRUSt2 比對(duì)16S rRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)獲取的物種信息，推測(cè)組成。參考KEGG（https://www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫，得到KO（KEGG Orthology）功能豐度預(yù)測(cè)表及KEGG 代謝途徑豐度表。采用FUNGuild數(shù)據(jù)庫解析真菌的基因序列信息和生態(tài)功能之間關(guān)系，借助生態(tài)功能群從分類學(xué)上劃分生態(tài)營(yíng)養(yǎng)型。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

利用美格基因云平臺(tái)計(jì)算處理α 多樣性指數(shù)、β 多樣性分析（NMDS）和菌群功能預(yù)測(cè)等微生物信息分析[18-19]。土壤理化性質(zhì)和酶活數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件（IBM，美國(guó)）進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）?；赗-project（MathSoft，美國(guó)），利用ggplot2 包繪制箱線圖，利用vegan 包分析和ggplot2 包繪制NMDS、RDA 圖，利用pheatmap 包和ggplot 包完成功能預(yù)測(cè)分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組土壤理化性質(zhì)和酶活性特征變化

不同處理組土壤理化性質(zhì)和酶活性存在顯著性差異（圖1）。復(fù)墾土壤pH 與CK 呈顯著差異（P<0.05），呈先升后降趨勢(shì)且均高于CK，均表現(xiàn)為弱堿性。除R15 外，R9、R12 和R18 等3 個(gè)處理間差異不顯著。AN 隨復(fù)墾年限增加呈上升趨勢(shì)，除R9 外，其他3 個(gè)處理已高于CK，但并無顯著差異。NN、AP 和SOC 隨復(fù)墾年限增加呈下降趨勢(shì)，復(fù)墾處理顯著低于CK，R18 分別為CK 的68.5%、26.0%、51.0%。LAP 活性變化趨勢(shì)與pH 值幾乎一致，R15含量最高，約為CK 一倍。PO 活性隨復(fù)墾年限增加逐漸升高，但仍低于CK 且差異顯著（P<0.05）。BG和PRO 活性隨復(fù)墾年限增加呈下降趨勢(shì)，R15 時(shí)最低，分別下降了19.43%和53.18%。

圖1 不同處理組土壤理化性質(zhì)和酶活性變化Fig.1 Changes of soil physico-chemical properties and enzyme activities under different treats

2.2 不同處理組土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成特征變化

2.2.1 不同處理組土壤微生物群落多樣性變化

從65 個(gè)樣品中共檢測(cè)到7 335 604 條有效序列，在97%相似度水平上聚類為316 607 個(gè)OTUs，不同處理組的有效序列和OTU 數(shù)量之間無顯著性差異。從表1 可以看出：隨復(fù)墾年限增加，不同處理組細(xì)菌Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)表現(xiàn)為相似趨勢(shì)，先增加后減少，R12 時(shí)最高。Pielou 均勻度指數(shù)和Simpson指數(shù)表現(xiàn)為相反的變化趨勢(shì)，R12 時(shí)Pielou 均勻度指數(shù)最高，Simpson 指數(shù)則最低，且與CK 呈顯著差異（P<0.05）。真菌群落R9 和R12 處理Chao1 指數(shù)低于CK，Simpson 指數(shù)高于CK，但R15 和R18 處理Chao1 指數(shù)已高于CK，Simpson 指數(shù)低于CK。所有復(fù)墾處理的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均高于CK。所有復(fù)墾處理的Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于CK，表明復(fù)墾顯著地促進(jìn)真菌物種相對(duì)豐度的變化，R12 時(shí)真菌物種豐富度和多樣性最高。

表1 不同處理組土壤微生物群落Alpha 多樣性Table 1 Alpha diversity of soil microbial community under different treats

從圖2 可知：不同處理細(xì)菌Beta 多樣性組間分離、組內(nèi)緊密，形成明顯的聚類（圖2a）。其中，橫坐標(biāo)（NMDS1）和縱坐標(biāo)（NMDS2）為樣本間差異解釋度最大的兩個(gè)坐標(biāo)。利用脅強(qiáng)系數(shù)（stress 值）衡量NMDS 分析結(jié)果，檢驗(yàn)結(jié)果是否能反映數(shù)據(jù)排序的真實(shí)分布。圖2 中stress 值均小于0.2，由此表明分析結(jié)果具有一定的解釋意義。所有復(fù)墾處理沿x軸與CK 分離，表明復(fù)墾與CK 之間群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。R9 和R12 沿y軸與R15 和R18 之間呈分離趨勢(shì)，R9 與R18 不重疊，R15 與R18 差異不明顯。但R18 聚類優(yōu)于其他組，充分表明復(fù)墾組間差異和相似度。不同處理真菌群落NMDS 分析顯示復(fù)墾處理沿x軸與CK 之間存在距離（圖2b），表明復(fù)墾與CK 之間群落存在明顯的分異。R9 和R12 與R15和R18 之間在y軸上產(chǎn)生距離，但兩兩之間系統(tǒng)發(fā)育更接近，表明不同復(fù)墾年限及CK 之間群落Beta多樣性差異顯著。

圖2 不同處理組土壤細(xì)菌、真菌Beta 多樣性Fig.2 Beta diversity analysis of soil bacteria and fungi under different treats

2.2.2 不同處理組土壤微生物群落組成變化

所有處理土壤細(xì)菌群落主要菌門保持一致（圖3a），變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bcateroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）為優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度占比大于80.0%。其中，變形菌門最豐富，相對(duì)豐度為32.5%±3.3%，表明它在維持礦區(qū)復(fù)墾土壤復(fù)雜生態(tài)環(huán)境中起著重要作用。盡管群落中主要菌門相似，但相對(duì)豐度變化明顯。復(fù)墾處理組變形菌門的相對(duì)豐度顯著低于CK（P<0.05），但酸桿菌門則相反。隨復(fù)墾年限增加，變形菌門和放線菌門的相對(duì)豐度逐漸上升，酸桿菌門和擬桿菌門則逐漸下降，并均呈向CK 靠近的趨勢(shì)。所有處理組中子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）及擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為真菌群落主導(dǎo)菌門（圖3b），相對(duì)豐度分別為28.9%±2.5%、16.5%±6.7%和9.7%±6.8%，占比超過一半。子囊菌門隨復(fù)墾年限增加呈上升趨勢(shì)，與CK 相比，R15 和R18 中子囊菌門分別上升了115.0%和127.02%?？傮w來看，隨復(fù)墾年限增加，細(xì)菌菌門類型變化更為復(fù)雜，真菌菌門豐度變化更加顯著。

圖3 不同處理組土壤細(xì)菌、真菌主導(dǎo)菌門相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of soil bacteria and fungi under different treats at phylum level

2.3 微生物群落與環(huán)境因子間的相互作用

利用R 軟件vegan 包計(jì)算OTUs 水平除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析的lengths of gradient（LG），細(xì)菌和真菌OTUs 水平LG 值分別為1.218 7 和3.861 2，均小于4.0，可采用冗余度分析（RDA）。通過RDA1 和RDA2 表示環(huán)境因子與排序軸之間的相關(guān)性。圖4 顯示環(huán)境因子分別解釋了細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)77.3%和56.5%的總變異（細(xì)菌RDA1 和RDA2 的解釋率分別為58.92%和18.35%，真菌RDA1 和RDA2 的解釋率分別為29.08%和27.43%），RDA 前兩軸已較好地解釋了土壤微生物與環(huán)境因子之間的關(guān)系。RDA分析結(jié)果顯示，不同處理間差異明顯，復(fù)墾組與CK分別形成明顯的聚類，表明復(fù)墾對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)作用顯著，且受不同復(fù)墾年限土壤理化性質(zhì)變化影響。pH、AN 和PO 為土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主導(dǎo)因子，復(fù)墾處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與pH、AN 和LAP 表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，與PRO、SOC 和AP表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖4 OTUs 水平土壤細(xì)菌、真菌和環(huán)境因子間RDA 分析Fig.4 RDA analysis of soil bacteria and fungi and environmental factors at OTU levels

2.4 不同處理組土壤微生物群落功能預(yù)測(cè)分析

為預(yù)測(cè)不同處理組土壤細(xì)菌功能變化，基于KEGG 數(shù)據(jù)庫，采用PICRUSt2 進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示：不同處理組細(xì)菌群落表現(xiàn)為相似的基因功能，包含3 個(gè)一級(jí)、15 個(gè)二級(jí)及50 個(gè)三級(jí)功能層（圖5a）。三級(jí)功能層主要包含代謝、復(fù)制和修復(fù)、翻譯及細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡等功能。復(fù)墾處理在丙酮酸代謝、糖酵解/糖異生、丙酸代謝、丁酸代謝等18 種功能上與CK 存在差異，它們隨復(fù)墾年限增加不斷增強(qiáng)。但葉酸一碳庫、葉酸生物合成、生物素代謝等10 種功能則隨復(fù)墾年限增加有所減弱。

圖5 不同處理組微生物功能基因預(yù)測(cè)相對(duì)豐度Fig.5 Map of relative abundance of microbial predicted functional genes under different treats

采用FUNGuild 對(duì)土壤真菌進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析（圖5b），結(jié)果顯示：復(fù)墾土壤真菌群落中包含2 個(gè)單營(yíng)養(yǎng)型（腐生營(yíng)養(yǎng)型、共生營(yíng)養(yǎng)型）和3 個(gè)混合營(yíng)養(yǎng)型（病理營(yíng)養(yǎng)型-腐生營(yíng)養(yǎng)型-共生營(yíng)養(yǎng)型、病理營(yíng)養(yǎng)型-腐生營(yíng)養(yǎng)型、腐生營(yíng)養(yǎng)型-共生營(yíng)養(yǎng)型）。此外，包括4 個(gè)單一功能群和14 個(gè)混合功能群。不同處理組真菌群落以未定義的腐生真菌為主，其次是內(nèi)生菌-垃圾腐植生物-土壤腐植生物-未定義的腐植生物和糞便腐生生物，不同處理組功能差異顯著。

3 討 論

3.1 復(fù)墾年限對(duì)土壤理化性質(zhì)和酶活性的影響

pH 是土壤微生物多樣性和豐富度最主要的控制因素，影響?zhàn)B分有效性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)隨復(fù)墾年限增加，pH 先升后降。這可能與季節(jié)性潛水變動(dòng)有關(guān)，初期下層充填煤矸石中部分重金屬和鹽離子溢出，發(fā)生毛細(xì)現(xiàn)象被帶至表土層，這與先前研究的結(jié)果一致[3]。但隨復(fù)墾年限延長(zhǎng)，土壤中一部分養(yǎng)分受到淋溶作用向下遷移，并與重金屬和鹽離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致后期土壤pH 下降。土壤中重金屬累積對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、組成乃至功能產(chǎn)生了重要影響，導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)與pH 間呈顯著相關(guān)[21]。土壤SOC 降低與作物吸收、土壤動(dòng)物和微生物分解消耗相關(guān)[11]，隨復(fù)墾年限增加，微生物介導(dǎo)的土壤呼吸作用不斷增加，不利于SOC 的積累[22]。這與CHAUDHURI 等[23]的研究結(jié)果不同，但與張宇婕等[11]的研究成果相一致，主要可能與氣候、植被、成土母質(zhì)的差異有關(guān)。土壤有效磷是可被植物吸收的磷組分，有研究發(fā)現(xiàn)AP 隨復(fù)墾年限增加逐漸降低[24]，這與本研究結(jié)果完全一致，可能主要?dú)w結(jié)于復(fù)墾年限增加，土壤質(zhì)量得以改進(jìn)，作物生產(chǎn)力得以提升，需要吸收更多磷素，以滿足其生長(zhǎng)需要。且高潛水位地區(qū)降雨量變化致使的土壤中離子和礦物含量變化，亦是能夠影響土壤磷元素的化學(xué)形態(tài)。AN 隨復(fù)墾年限呈上升趨勢(shì)，主要原因?yàn)殡S復(fù)墾年限增加，作物根系和凋落物等進(jìn)入土壤越多，酶活性提高，加速養(yǎng)分釋放[13]，這也是SOC 持續(xù)下降的原因之一。與此同時(shí)，有機(jī)肥和化肥輸入也越多，外源氮素逐漸累積。此外，隨復(fù)墾年限增加，有機(jī)氮礦化作用增強(qiáng)，硝化作用減弱，導(dǎo)致AN 上升，NN 下降[22]。微生物利用分泌胞外酶將復(fù)雜化合物降解為水溶性分子供自身或作物利用[25]，因此酶活性變化反映了復(fù)墾對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境的影響。如LAP 參與土壤氮循環(huán)[26]，本研究顯示LAP 先升后降，與豆科植物早期的固氮作用有關(guān)，增加氮可利用性，酶活性增強(qiáng)。后期AN 不斷積累又抑制LAP 活性，這與先前發(fā)現(xiàn)LAP 與AN 之間存在負(fù)反饋調(diào)控相一致[27]。PO 活性逐漸升高可能與復(fù)墾增加酶作用的底物從而間接提高酶活性，也可能與AP 含量下降有關(guān)，呈一定的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[28]。BG 參與多糖分解，PRO 參與有機(jī)含氮化合物水解，兩者酶活性下降與復(fù)墾土壤耕作擾動(dòng)和SOC 下降有關(guān)，反映土壤微觀環(huán)境質(zhì)量狀況[29]。

3.2 不同處理對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)與組成的影響

本研究顯示：隨復(fù)墾年限增加，微生物群落豐富度和均勻度也上升（圖2）。主要由于復(fù)墾消除了采礦對(duì)土壤環(huán)境的脅迫，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和施肥又為微生物提供充足養(yǎng)分和碳源，激發(fā)特定功能菌類群發(fā)育，這與馬靜等[21]的研究結(jié)論相一致。有研究發(fā)現(xiàn)，隨復(fù)墾年限增加，根系和凋落物源源不斷輸入，提高了土壤肥力，改善了理化性質(zhì)[30]，為微生物群落創(chuàng)造了適宜的生存條件，促進(jìn)微生物恢復(fù)至原始或更高水平[31]。本研究NMDS 分析結(jié)果顯示，CK 在y軸上與R18 處理組樣點(diǎn)更接近，說明隨復(fù)墾時(shí)間增加，微生物群落組成差異逐漸消失[9]。與此同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落多樣性遠(yuǎn)高于真菌，這與李智蘭[1]、周雪巖[32]等的研究結(jié)論一致。變形菌門和放線菌門相對(duì)豐度隨復(fù)墾年限增加而增加（圖3a），主要原因是黃淮平原礦區(qū)復(fù)墾土壤為弱堿性，它們對(duì)堿性土壤親和力高。擬桿菌門和酸桿菌門相對(duì)豐度隨復(fù)墾年限增加而下降（圖3a），說明復(fù)墾對(duì)其生存帶來了挑戰(zhàn)，改變了環(huán)境營(yíng)養(yǎng)狀況和碳源利用潛力，尤其是屬寡營(yíng)養(yǎng)型的酸桿菌門[33]。子囊菌門和被孢霉門為復(fù)墾土壤真菌的主導(dǎo)菌門（圖3b），子囊菌門相對(duì)豐度隨復(fù)墾年限明顯增加，說明復(fù)墾改善了環(huán)境脅迫，為偏愛高營(yíng)養(yǎng)底物的腐生菌提供更適宜的生存環(huán)境[34]。

3.3 土壤微生物群落與環(huán)境因子的互作機(jī)制

復(fù)墾改變了地上植物群落和地下土壤環(huán)境，不可避免地引發(fā)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的變化[35]。因此，微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)之間存在一定的相關(guān)關(guān)系[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)墾處理組pH、AN和LAP 與細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為顯著正相關(guān)關(guān)系，PRO、SOC 和AP 與細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。LAP 促進(jìn)有害物降解，PRO 增強(qiáng)微生物適應(yīng)能力，SOC 分解提供更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，有效地提升了土壤微生物群落與環(huán)境因子間互饋機(jī)制。隨復(fù)墾年限增加，微生物區(qū)系不斷發(fā)育，功能逐漸完善。復(fù)墾土壤細(xì)菌形成了3 個(gè)一級(jí)功能層、15 個(gè)二級(jí)功能層和50 個(gè)三級(jí)功能層（圖5a）。代謝通徑為核心功能，對(duì)土壤-植被的碳氮磷循環(huán)至關(guān)重要[37-38]，與復(fù)墾土壤特定環(huán)境脅迫防御、固氮、溶磷等互作密切相關(guān)。二級(jí)功能主要包含氨基酸代謝、碳水化合物代謝及輔助因子和維生素代謝等，為存活與繁衍服務(wù)[39]。復(fù)墾土壤中放線菌門擁有較多的促進(jìn)動(dòng)植物遺骸腐爛的好氧性腐生菌，變形菌門中存在許多代謝功能類群，為植物生長(zhǎng)和自身發(fā)育提供物質(zhì)和能量[40]。真菌生活史更為復(fù)雜，F(xiàn)UNGuild分析結(jié)果顯示腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌在復(fù)墾土壤中最具優(yōu)勢(shì)（圖5b）。它們可以腐生、寄生和共生等多種營(yíng)養(yǎng)方式生存，既可分解動(dòng)植物殘?bào)w，又可腐生植物根莖葉等不同部位[41]。腐生菌多屬子囊菌門，因此子囊菌門成為復(fù)墾土壤真菌最優(yōu)勢(shì)菌門。R9 中未定義的腐生真菌相對(duì)豐度值最高，說明復(fù)墾初期養(yǎng)分脅迫嚴(yán)重，腐生真菌分解有機(jī)物對(duì)植被生長(zhǎng)和滿足自身利用至關(guān)重要。土壤真菌的分解能力明顯增加，有利于作物吸收土壤中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植被的生長(zhǎng)發(fā)育。綜上，土地復(fù)墾能有效提高黃淮平原礦區(qū)土壤微生物活性，促進(jìn)養(yǎng)分吸收和物質(zhì)代謝循環(huán)（圖6）。今后黃淮平原采煤沉陷區(qū)復(fù)墾應(yīng)加強(qiáng)工藝控制，一是防止過分壓實(shí)，減少毛細(xì)現(xiàn)象發(fā)生；二是適當(dāng)增大降漬深度，防止充填煤矸石等重金屬和鹽離子上升，產(chǎn)生生物毒性；三是可適當(dāng)添加功能微生物，加速微生物群落重建，快速改良重構(gòu)土壤質(zhì)量。

圖6 微生物在高潛水位礦區(qū)復(fù)墾土壤中的作用過程和機(jī)制Fig.6 The microbial effecting process and mechanism in the reclaimed soil of high underground water mining areas

4 結(jié) 論

1）黃淮平原礦區(qū)復(fù)墾顯著地改善土壤理化性質(zhì)和酶活性。隨復(fù)墾年限增加，AN 逐漸上升，NN、AP、SOC、BG 和PRO 活性下降，pH 和LAP 活性呈先升后降趨勢(shì)。

2）復(fù)墾對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與組成有顯著影響。隨復(fù)墾年限增加，細(xì)菌Chao1 指數(shù)和Shannon指數(shù)先增加后減少，Pielou 均勻度指數(shù)和Simpson 指數(shù)則相反。真菌群落Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)高于CK，但R9 和R12 處理Chao1 指數(shù)低于CK，Simpson 指數(shù)高于CK。所有處理土壤細(xì)菌和真菌群落的主要菌門保持一致，但相對(duì)豐度變化顯著。

3）土壤微生物群落與環(huán)境因子之間存在特定的相關(guān)關(guān)系。土壤pH、AN 和PO 為微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主導(dǎo)因子，復(fù)墾土壤pH、AN、LAP 及PRO、SOC、AP 與微生物群落結(jié)構(gòu)分別成正相關(guān)與負(fù)相關(guān)關(guān)系。

4）PICRUSt2 功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示不同處理組細(xì)菌群落基因功能相似，包含3 個(gè)一級(jí)、15 個(gè)二級(jí)及50 個(gè)三級(jí)功能層，其中代謝功能活躍且與復(fù)墾年限呈正相關(guān)關(guān)系。FUNGuild 功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示不同處理組真菌群落包含2 個(gè)單營(yíng)養(yǎng)型和3 種混合營(yíng)養(yǎng)型及4 個(gè)單一功能群和14 個(gè)混合功能群，腐生營(yíng)養(yǎng)型最具有優(yōu)勢(shì)。