陳凱欣,趙 溪,邱齊駿,吳 娣,2,彭 扣,2

(1.南昌大學 生命科學學院,南昌 330031; 2.江西省水產(chǎn)動物資源與利用重點實驗室,南昌 330031; 3.江西省撫州市農(nóng)業(yè)科學研究所,撫州 344000)

池蝶蚌(Hyriopsisschlegelii)隸屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、蚌科(Unionidae)、帆蚌屬(Hyriopsis),因其育珠性能佳、產(chǎn)珠品質優(yōu)、環(huán)境適應能力強等特點,是我國一種重要的淡水育珠蚌。水溫是影響貝類存活、生長發(fā)育、免疫功能和分布的主要環(huán)境因子之一,水溫超過一定范圍,機體會產(chǎn)生熱應激反應,導致其生理功能減弱、免疫功能降低,甚至死亡[1]。溫度脅迫是指生物對正常生存溫度之外溫度的反應,包括低溫脅迫和高溫脅迫[2-3]。就淡水育珠貝而言,20～35 ℃是其生活的適宜溫度。高于35 ℃會造成熱昏迷現(xiàn)象,影響珍珠的產(chǎn)量和質量,高于40 ℃會造成育珠貝死亡[4]。池蝶蚌作為重要的淡水育珠蚌之一,在育珠生產(chǎn)過程中,容易遭受病原微生物侵襲。近年來,病害影響給我國淡水育珠業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失[5]。因此,提高淡水育珠蚌抗高溫熱害和免疫防御能力對其養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

熱激蛋白(Heat shock protein,HSP)是生物體內與抗逆相關的一類十分重要的蛋白質,對機體免受應激因素損害和增強機體對脅迫環(huán)境的耐受性,維持細胞正常生理功能具有重要作用[6]。HSP70家族是HSP超家族的重要成員,分子質量為68～74 ku,是一類應激保護蛋白[6]。研究表明,HSP70家族成員在幫助機體應答高溫、缺氧、重金屬、病菌感染等環(huán)境脅迫方面起關鍵作用,具分子伴侶功能,能幫助蛋白進行重新正確折疊、裝配和轉運,清除錯誤折疊、受損或變性蛋白[6]。HSP70作為HSP超家族中最保守的蛋白,廣泛存在于各種生物體內,已從植物、動物和微生物體內成功克隆出HSP70基因[6]。

在無脊椎軟體動物中,已開展多種重要經(jīng)濟貝的HSP70序列測定及其表達研究,如長牡蠣(Crassostreagigas)[7]、美洲牡蠣(Crassostreavirginica)[8]、食用牡蠣(Ostreaedulis)[9]、紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)[10]、海灣扇貝(Argopectenirradians)[11]、文蛤(Meretrixmeretrix)[12]、合浦珠母貝(Pinctadamartensii)[13]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[14]、縊蟶(Sinonovaculaconstricta)[15]、褶紋冠蚌(Cristariaplicata)[16]和三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)[5]等,發(fā)現(xiàn)HSP70家族在貝類中參與各種環(huán)境脅迫應答,起重要保護作用。研究表明,縊蟶急性高溫脅迫4 h時HSP70在肝胰腺和鰓中表達量開始顯著升高[1]。皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)受熱刺激和鰻弧菌(Vibrioanguillarum)感染后肌肉和鰓組織中的HSP70的表達顯著提高[17]。熱休克和菌脅迫厚殼貽貝能顯著增強HSP70基因在鰓和肝胰腺中的表達水平[18]。但未見急性脅迫下池蝶蚌HSP70家族成員表達特征分析的報道。嗜水氣單胞菌是廣泛分布于水體中兼性厭氧型的致病菌,淡水育珠蚌細菌性瘟病可能與之相關[19],本研究報道了池蝶蚌HSP70家族成員HSP70B2-like cDNA全長序列,并研究了池碟蚌HSP70B2-like在不同組織和急性高溫及注射嗜水氣單胞菌脅迫后相關組織中的轉錄表達特征,旨在為池蝶蚌抗逆生理研究提供資料,為其抗逆品種培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

池蝶蚌采自撫州市南城縣洪門水庫池蝶蚌良種養(yǎng)殖基地,為三齡健康蚌,經(jīng)測量殼長為(120±4.5)mm、殼寬(69.21±1.6)mm、殼高(324±0.5)mm。池蝶蚌取回實驗室置水族箱(800 mm×400 mm×400 mm)中暫養(yǎng)一周。水溫控制在(25±1)℃,pH(7.5±0.1),連續(xù)充氣,每2天換水1/3,并投喂適量小球藻。暫養(yǎng)結束后,隨機選取3只蚌以Trizol法提取池蝶蚌的肝胰腺組織的總RNA用于RACE-PCR。組織表達檢測隨機選取3只室溫(25 ℃)培育蚌提取閉殼肌、性腺、縮足肌、肝胰腺、鰓、斧足、腎、外套膜和血細胞等9個組織的總RNA用于qPCR。高溫脅迫實驗具體操作簡述為從培養(yǎng)池中隨機選取15只蚌,處理方法:15只蚌均預先常溫(25 ℃)室內培養(yǎng)缸充氣養(yǎng)殖一周,待其適應環(huán)境穩(wěn)定后,隨機選3只蚌設為對照組,另12只放置在37 ℃的鼓風培養(yǎng)箱中高溫脅迫下培養(yǎng),分別在培養(yǎng)6、12、24和48 h后各時間點隨機選取3只快速提取鰓、肝胰腺、外套膜、腎、血細胞和閉殼肌組織總RNA,再反轉錄成cDNA。菌脅迫實驗時,隨機分5組,每組3只,給每只蚌閉殼肌注射50 μL嗜水氣單胞菌(2.5×109細胞/mL,PBS重懸),各組脅迫時間依次為6、12、24和48 h,0 h的對照組則注射相同劑量的PBS,分別每3只蚌混合取鰓、肝胰腺、血細胞和閉殼肌等4個組織。按照此方法重復3次,非生物和生物脅迫兩種不同刺激處理各組45只蚌,總需90只蚌。

1.2 方法

1.2.1 EST序列獲得

根據(jù)本實驗室池蝶蚌高通量轉錄組數(shù)據(jù)庫篩選HSP70家族的同源基因序列,從篩查HSP70家族中眾多成員的部分序列中,同源比對分析后,選定其中一條與GenBank已報道其他物種HSP70s同源性較高且其ORF序列相對較完整的HSP70B2-like的EST做進一步研究分析。

1.2.2 RNA提取和cDNA模板合成

材料中所述的池蝶蚌各組織解剖后置于預加液氮的研缽中研磨成粉末后,利用RNAiso Plus 試劑(Takara公司)提取組織總RNA,選用Clontech公司SMARTTM-RACE cDNA Amplification Kit試劑盒用于RACE cDNA合成。選用Takara公司反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)用于組織表達熒光定量PCR分析cDNA合成。

1.2.3 cDNA全長克隆和序列分析

根據(jù)轉錄組獲得的池蝶蚌HSP70EST序列設計5′RACE和 3′RACE 特異性引物,使用SMARTTMRACE Amplification Kit 和Advantage 2 PCR Kit以RACE cDNA為模板分別進行5′和3′ RACE 擴增。將表1中的引物HSP70-5GSP1和通用引物UPM配對,進行5′端第一輪PCR擴增;以稀釋20倍的第一輪PCR產(chǎn)物為模板,再用HSP70-5GSP2和NUP進行第二輪PCR擴增;進行3′端擴增,同上類似則是引物HSP70-3GSP1和HSP70-3GSP2分別同UPM和NUP進行配對。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用DNA膠回收試劑盒回收純化目的片段,純化產(chǎn)物連接pMD19-T 載體后轉化到E.coliTop10感受態(tài)細胞,經(jīng)菌落PCR鑒定的陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 研究用到的引物

利用DNAMAN軟件進行全長序列拼接。DNAStar軟件找到開放閱讀框,推導出其氨基酸序列,在NCBI上BLASTP進行序列同源性比對。用TMHMM軟件跨膜區(qū)分析;使用SignalP 5.0 進行信號肽預測。使用DNAMAN 軟件進行多序列比對。采用MEGA 6.0軟件,基于鄰位結合法(Neighbor-Joining,NJ)構建系統(tǒng)進化樹,Bootstrap設置重復1 000次計算各分支置信度,使用RAxML和MrBayes對構建進化樹進行相似度驗證。

1.2.4 qRT-PCR分析

采用qRT-PCR檢測池蝶蚌HSP70mRNA的組織表達及高溫脅迫和注射嗜水氣單胞菌后的表達特征。根據(jù)HSP70cDNA序列和池蝶蚌β-actin(EU047596),分別設計一對表達分析引物 (表1)。將材料中所述的用于qRT-PCR分析提取的相應各組織總RNA反轉錄成cDNA,根據(jù)TaKaRa的熒光定量試劑盒(嵌合檢測法) 進行qRT-PCR檢測。反應體系和程序參考SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說明書,采用20 μL反應體系,包括10 μL的2×SYBR Green Real-Time PCR Master Mix,1 μL模板,0.4 μL PCR Forward Primer(10 μmol/L),0.4 μL PCR Reverse Primer (10 μmol/L),0.4 μL ROX Reference DyeⅡ(50×),7.8 μL ddH2O,每個樣品設置3個重復,以蒸餾水代替模板作為陰性對照。熒光定量PCR反應程序:95 ℃預變性60 s;95 ℃變性20 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環(huán);72 ℃再延伸10 min。應用 2-ΔΔCT法分析相對表達值。使用SPSS 17.0軟件對結果進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 池蝶蚌HSP70 B2-like cDNA克隆與序列特征

池蝶蚌HSP70B2-like cDNA為2 209 bp,包括267 bp的5′UTR,25 bp的3′UTR和1 917 bp的ORF,該ORF編碼638個氨基酸(圖1)。預測蛋白分子質量為70.40 ku,等電點(pI)為5.70。池蝶蚌HSP70B2-like cDNA提交GenBank,登錄號為OP429215。SignalP分析其不含信號肽,TMHMM預測其無跨膜區(qū),該序列含有4個糖基化位點(N36,N362,N387,N489),具有HSP70家族保守的3個標簽序列(I10DLGTTYS17,V198FDLGGGTFDVSIL211和V336VLVGGSTRIPKVQK350)以及1個ATP酶結構域(A132EAYLGKK139)、雙向核定位序列(K248RKHKKDISKANRALRR264)、底物肽結合結構域(T383-E545)和C端結構域(R512-P615)(圖1)。

3個標簽序列用藍色方框標出,ATP酶結構域用陰影標示,雙向核定位信號位點用陰影并字母斜體標示,糖基化位點字母加粗并下劃線標示,C端保守區(qū)域用紅色方框標出。

2.2 池蝶蚌HSP70 B2-like序列同源性與系統(tǒng)發(fā)育樹

經(jīng)BLASTP同源比對分析發(fā)現(xiàn),池蝶蚌HSP70 B2-like與NCBI GenBank發(fā)布的其他物種的HSP70顯示出較高的親緣性,相似性最高的為褶紋冠蚌(C.plicata),達97.0%。應用DNAMAN軟件進一步對不同物種HSP70序列多重比對,如圖2所示,不同物種的HSP70在N端不是很保守,而C端的5～7個氨基酸保守性很強。HSP70家族所具有的標簽序列、核定位序列、糖基化位點和特征性結構域在池蝶蚌HSP70 B2-like序列中均可找到,較為保守。

3個標簽序列用藍色方框標出,ATP酶結構域用加粗上劃線標示,雙向核定位信號位點用雙箭頭標示,糖基化位點用箭頭標出,C端保守區(qū)域用紅色方框標示。各物種的HSP70序列登錄號:池蝶蚌(OP429215),褶紋冠蚌(ADM64336.1),三角帆蚌(AHN82525.1),長牡蠣 (XP_011435905.1),紫貽貝(CAH04106.1),斑馬魚 (NP_001093532.1),非洲爪蟾(NP_001121147.1),原雞(NP_001006686.1),人(NP_005336.3),果蠅(NP_731651.1)。

通過MEGA 6.0軟件鄰接法構建池蝶蚌HSP70 B2-like系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),池蝶蚌HSP70 B2-like與加州紅鮑(Haliotisrufescens)、福壽螺(Pomaceacanaliculata)、美洲簾蛤(Mercenariamercenaria)、蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)、美洲牡蠣(C.virginica)、長牡蠣(C.gigas)等軟體動物的HSP70家族中B2亞家族聚為同一分支簇(圖3)。池蝶蚌首先與褶紋冠蚌(C.plicata)聚為一小分支,且和紫貽貝(M.galloprovincialis)的HSP70均落在B2亞家族分支簇。報道的三角帆蚌(H.cumingii)HSP70未落在軟體動物分支簇上。果蠅(Drosophilamelanogaster)、美洲斑潛蠅(Liriomyzasativae)、煙草天蛾(Manducasexta)和埃及伊蚊(Aedesaegypti)等節(jié)肢動物的HSP70匯聚成另一分支簇。斑馬魚(Daniorerio)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、原雞(Gallusgallus)、小鼠(Musmusculus)、家犬(Canislupusfamiliaris)、馬(Equuscaballus)和人(Homosapiens)等脊椎動物的HSP70則匯聚成另一不同分支簇。應用RAxML和MrBayes構建發(fā)育樹均得到類似聚類結果。

各物種的HSP70序列登錄:池蝶蚌(OP429215),褶紋冠蚌(ADM64336.1),三角帆蚌(AHN82525.1),福壽螺(XP_025099490.1),長牡蠣 (XP_011435905.1),美洲牡蠣(XP_022315428.1),蝦夷扇貝(XP_021370483.1),美洲簾蛤(XP_045165411.1),紫貽貝(CAH04106.1),加州紅鮑(XP_046367549.1),斑馬魚(NP_001093532.1),非洲爪蟾 (NP_001121147.1),原雞(NP_001006686.1),小鼠(AAC84169.1),馬(NP_001243852.1),家犬(BAB78505.1),人(NP_005336.3),煙草天蛾(AAO65964.1),埃及伊蚊(XP_021693655.1),美洲潛斑蠅(AAW32099.2),果蠅(NP_731651.1)。

2.3 池蝶蚌HSP70 B2-like組織表達

使用qRT-PCR分析池蝶蚌HSP70B2-like在不同組織中的特異性轉錄表達特征,結果如圖4所示,室溫(25 ℃)條件下HSP70B2-like mRNA在被檢測的9種組織中均有表達,閉殼肌中的相對表達量最高,其次為性腺和縮足肌,而后是肝胰腺和鰓,而在血細胞、外套膜和腎中的表達量相對較低。

取平均值±標準誤;* 為差異顯著(P<0.05);** 為差異極顯著(P<0.01)。

2.4 熱刺激對池蝶蚌HSP70 B2-like組織表達影響

經(jīng)高溫(37 ℃)脅迫刺激處理,以室溫(25 ℃)為對照(0 h),如圖5所示,熱刺激6 h,HSP70B2-like在閉殼肌、肝胰腺、腎和外套膜中的轉錄表達明顯增強(P<0.01),在血細胞和鰓中的表達呈現(xiàn)短暫下調,但在12 h表現(xiàn)上調。熱刺激48 h,HSP70B2-like在血細胞、外套膜和腎中的轉錄表達量明顯增加,而在閉殼肌、鰓和肝胰腺中的表達量回落。

(a)閉殼肌;(b)鰓;(c)肝胰腺;(d)外套膜;(e)腎;(f)血細胞。取平均值±標準誤;* 為差異顯著(P<0.05);** 為差異極顯著(P<0.01)。

2.5 菌感染后池蝶蚌HSP70 B2-like 組織表達變化

嗜水氣單胞菌注射感染之后,6、12和24 h實驗組的HSP70B2-like在肝胰腺[圖6(b)]、血細胞[圖6(c)]和閉殼肌[圖6(d)]中的轉錄表達均表現(xiàn)顯著上調,6 h實驗組的HSP70B2-like在鰓[圖6(a)]的表達呈顯著下調,12 h呈現(xiàn)上調,24 h下調。48 h實驗組的HSP70B2-like在鰓、肝胰腺血細胞和閉殼肌中的表達均表現(xiàn)回落(圖6)。

(a)鰓;(b)肝胰腺;(c)血細胞;(d)閉殼肌。取平均值±標準誤;* 為差異顯著(P<0.05);** 為差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

HSP70是一種在代謝過程中促進細胞穩(wěn)態(tài)的重要蛋白,具有分子伴侶、抗氧化、抗細胞凋亡、免疫調節(jié)等重要功能[6,20]。本研究從池蝶蚌中克隆獲得序列具有其他物種HSP70家族典型特征序列,包括3個標簽序列(IDLGTTYS、VFDLGGGTFDVSIL和VVLVGGSTRIPKVQK)、N端ATP酶結構域(A131EAYLGTT138)和雙向核定位信號(K250KDPSESKRALRRL263)[7,20],與已報道的褶紋冠蚌HSP70氨基酸序列長度一致[16],但比三角帆蚌HSP70序列短[5]。BLASTP和多重序列比對顯示,該序列與褶紋冠蚌HSP70同源性最高,在構建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹中,該序列首先與褶紋冠蚌HSP70緊密聚為一支,并與其他8種軟體動物HSP70聚為一大簇,特別是和加州紅鮑、福壽螺、美洲簾蛤、蝦夷扇貝、美洲牡蠣和長牡蠣的HSP70 B2亞家族同落在一大分支上,而與三角帆蚌HSP70距離較遠,推測克隆序列為池蝶蚌HSP70家族的成員,且屬B2亞家族。雖然一些軟體動物中只報道了一個HSP70[6,20],但真核生物HSP70家族存在多個成員[6,20]。Tavaria等[21]發(fā)現(xiàn)人HSP70家族至少存在11個成員。牡蠣中發(fā)現(xiàn)HSP70基因發(fā)生了明顯擴張,數(shù)目高達88個[20,22]。櫛孔扇貝基因組中鑒定了HSP70家族65個成員[23]。在物種分類學上,池蝶蚌與三角帆蚌同屬不同種,相較于褶紋冠蚌與之親緣關系更近[19],推測本研究選用的三角帆蚌HSP70可能屬于HSP70家族中另一亞家族成員。

信號肽預測結果顯示,池蝶蚌HSP70 B2-like的N端無信號肽跨膜結構域,TMHMM預測其無跨膜區(qū),說明其不屬于分泌性蛋白,亦非膜蛋白,可能為胞質蛋白。HSP70家族蛋白至少包括4類蛋白質,第一類是結構型HSP70蛋白,又稱HSP70的同源蛋白(HSC70),熱刺激后只有少量增加;第二類是誘導性HSP70蛋白,在正常細胞中也有少量表達,細胞發(fā)生應激后,表達迅速增加;第三類是GRP78(Bip),定位于細胞內質網(wǎng);第四類是GRP75,位于線粒體[6]。軟體動物胞質型的HSP70其C端通常具有細胞質特異性調控基序GP(T/K)(V/I)EE(V/M)D[20],而定位于內質網(wǎng)、細胞核和線粒體的HSP70其C端通常分別具有特異性的KDEL、NUCDISC和MITDISC基序[20]。對池蝶蚌HSP70 B2-like序列分析發(fā)現(xiàn),其C端存在基序GPTVEEMD,說明池蝶蚌HSP70 B2-like在細胞質有分布,屬胞質型HSP70。但池蝶蚌HSP70 B2-like也存在雙向核定位信號序列,推測其除胞質發(fā)揮作用外,當受到熱休克或細菌感染等脅迫后,胞質內的HSP70 B2-like可能還可以遷移到核內發(fā)揮功能保護作用。

盡管HSP70廣泛存在于各類生物體內,但各物種的HSP70的表達具有組織特異性。三角帆蚌HSP70以肝胰腺中的表達最高,其次是性腺[5]。褶紋冠蚌HSP70在鰓中的表達較高,其次是肌肉[16]。香港牡蠣HSP70在肌肉中表達最高[24]。本研究發(fā)現(xiàn)池蝶蚌HSP70B2-like在不同組織中均有表達,以閉殼肌的表達量最高,其次是性腺,在血細胞、外套膜、腎、鰓、肝胰腺及斧足的表達量較低,表明其表達有組織特異性。

作為一種應激保護蛋白,HSP70幫助生物體迅速適應環(huán)境變化以抵御外界不良損害[1,5,20]。Nakano等[25]對潮間帶杜父魚研究表明,HSP70在體內貯存量與機體熱耐受能力呈正相關。長牡蠣37 ℃預處理2 h,轉置44 ℃致死溫度下,生存期延長了2周,與鰓中大量積累的HSP70有關[26]。說明輕度或非致死熱休克誘導HSP70基因表達上調有助于水生動物抵抗不良環(huán)境因子脅迫,進而產(chǎn)生非特異性的保護作用[27]。37 ℃刺激三角帆蚌,處理2 h鰓中的HSP70表達顯著上調[5]。熱休克和病原菌處理褶紋冠蚌,各組織中HSP70mRNA表達量有明顯提高[11]。本研究采用急性高溫(37 ℃)脅迫處理池蝶蚌后,檢測發(fā)現(xiàn)各組織中的HSP70B2-like轉錄表達均有顯著變化,其中,閉殼肌、肝胰腺、外套膜和腎在脅迫6 h其轉錄水平顯著增強,隨后逐漸下降,表現(xiàn)為明顯的時間依賴性。這可能與HSP70在轉錄水平的反饋調節(jié)方式有關[6],在無脅迫條件下,細胞質中HSP70蛋白與熱休克轉錄因子(HSF)結合為無活性復合物;熱脅迫后,大量HSP70與變性蛋白結合,導致HSF從 HSP70-HSF復合物中釋放,游離的HSF在蛋白激酶或其他絲氨酸/蘇氨酸激酶的作用下磷酸化,形成活性三聚體并轉入細胞核內與熱休克元件(HSE)序列結合,并進一步被激酶磷酸化,然后啟動HSP70的表達,導致機體中HSP70表達水平上升;當HSP70累積到一定程度時又與HSE結合,引起HSF與HSE分離,轉錄停止,從而實現(xiàn)反饋抑制HSP70的表達,HSP70表達水平逐漸下降至誘導前水平。在鰓和血細胞先降后升,推測可能是急性高溫脅迫的初始階段(0～6 h),通過關閉或降低鰓和血細胞HSP70B2-like參與的一些快速調節(jié)途徑以應對環(huán)境的變化,但隨后(12 h)啟動了由HSP70B2-like參與的調節(jié)以應對應激導致的不良反應。另一種可能是池蝶蚌鰓和血細胞具有更高的熱敏感度,其HSP70B2-like可能類似三角帆蚌在熱脅迫2 h誘導了其顯著增強表達,但脅迫時間過長到6 h可能出現(xiàn)負反饋調控抑制了其表達。外套膜、血細胞和腎組織中HSP70B-like基因在37 ℃脅迫后分別在6 h(或12 h)和48 h出現(xiàn)兩次表達峰,這與其他組織不同。這可能是急性高溫脅迫誘導HSP70 B2-like高表達后,可以修復熱休克導致的部分受損蛋白,同時誘導產(chǎn)生的HSP70 B2-like還可以作為一種“危險信號”使機體提高抗氧化防御功能,刺激機體某些相關細胞因子活化正反饋誘導HSP70B2-like再次增強表達。

HSP70還是一個參與抵抗病原菌感染的免疫防御相關基因。病原菌侵染文蛤可顯著增強其在肝胰腺和鰓中的表達[12]。近江牡蠣在感染溶藻弧菌后,外套膜、鰓、消化腺、心臟和血細胞等5種不同組織中HSP70mRNA均出現(xiàn)了顯著性高表達[28]。本研究注射嗜水氣單胞菌脅迫處理池蝶蚌,發(fā)現(xiàn)HSP70B2-like在池蝶蚌鰓、肝胰腺、血細胞和閉殼肌中的表達也均顯著增加,但其表達變化有組織差異性,肝胰腺、血細胞和閉殼肌中HSP70B2-like mRNA表達量在6 h已被顯著增強表達并持續(xù)至24 h,隨后便逐漸下降。池蝶蚌鰓組織中HSP70B2-like mRNA表達則是先降后升再回落,表達量變化規(guī)律同其受到急性高溫脅迫相似。表明池蝶蚌HSP70 B2-like不僅是熱脅迫時大量表達的蛋白,也是生物脅迫如病原菌侵染時誘導表達的蛋白。這可能是當池蝶蚌被細菌感染后,其為消除病原菌,機體自身的免疫細胞會釋放一些諸如活性氧分子、陽離子多肽、溶菌酶和細胞因子等分子,這些分子可誘導產(chǎn)生包括HSP70s在內的多種熱休克蛋白。釋放的活性氧分子在殺滅外來侵染的病原菌同時,也會對宿主自身正常細胞造成損傷,造成自身蛋白的變性,機體不同組織中的變性蛋白誘導差異水平的HSP70s產(chǎn)生,產(chǎn)生的HSP70s或者幫助變性蛋白復性,或者清除永久變性蛋白[28]。有研究表明,經(jīng)急性高溫誘導增加HSP70含量,增強了凡納濱對蝦對副溶血弧菌感染的抗性,并發(fā)現(xiàn)敲低HSP70表達的對蝦在副溶血弧菌和白斑綜合征病毒感染時死亡率升高[27],說明通過誘導水生動物產(chǎn)生內源 HSP70,能增強水生動物的抗逆/病性。這在水生動物抗逆和病害防控方面可能具有廣泛的潛在應用價值[27-28]。然而,在生產(chǎn)實踐中仍需謹慎進行,需進一步探究具體的操作方案[29]。正如厚殼貽貝在一定溫度變化范圍內可通過調節(jié)自身代謝水平應對溫度升高帶來的脅迫,但短時間內大幅升溫顯著影響厚殼貽貝的攝食、代謝和免疫反應[2]。

4 結論

研究克隆鑒定了一個池蝶蚌HSP70B2-like基因,并通過急性高溫脅迫和病原菌刺激實驗證明其是一個應激表達蛋白基因,且屬胞質誘導型HSP70,參與了機體應對高溫脅迫和抗病原菌入侵的應答過程,暗示其在機體的抗高溫熱害和免疫防御中發(fā)揮著重要作用。池蝶蚌HSP70B2-like基因的克隆為深入研究其介導的抗逆能力和免疫機理以及指導池蝶蚌抗逆育種和遺傳改良打下基礎。