楊 浩,張 揚(yáng),高建萍,康躋耀,孔英俊,張貴鋒,張萬忠

(1.沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院,沈陽 110142;2.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190)

牛骨中含有多種營養(yǎng)物質(zhì),其中,牛骨蛋白具有很高的營養(yǎng)價(jià)值[1]。牛骨中提取的蛋白具有抗高血壓、保護(hù)骨健康、抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等功效[2],如牛骨膠原肽通過消耗氧自由基,抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加[3-4],發(fā)揮抗氧化功效。從天然牛骨中提取的具有多種功效的蛋白已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè),需求逐年增加,因而牛骨蛋白提取工藝的研究日漸被重視。

目前,以骨為原料的蛋白提取方法主要包括酸法、堿法和酶法[5]。在3種方法的提取過程中,必須首先破壞骨的結(jié)構(gòu)才能提取蛋白。因?yàn)樵诠墙Y(jié)構(gòu)中,羥基磷灰石以及膠原通過鈣交聯(lián)形成纖維結(jié)構(gòu)[6],該結(jié)構(gòu)致密,需在膠原纖維部分被破壞造成鈣流失的條件下,蛋白才可以從骨組織中釋放[7]。酸法是采用一定濃度的酸浸泡控溫使鈣質(zhì)流失,破壞骨無機(jī)成分進(jìn)行提取,蛋白得率可達(dá)2.24%[8],但會(huì)對(duì)設(shè)備產(chǎn)生腐蝕并污染環(huán)境[9];堿法是用氫氧化鈣溶液控溫使膠原明膠化,破壞骨纖維進(jìn)行提取[10],但與肽鍵相連的α-氫原子會(huì)發(fā)生酸堿反應(yīng)使氨基酸消旋產(chǎn)生有害物質(zhì)[11],已被酸法和酶法取代。酸法和堿法都面臨預(yù)處理和提取過程中消耗大量酸或堿、高能耗、污染環(huán)境且前處理復(fù)雜等問題。酶法是應(yīng)用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等酶制劑通過酶切非螺旋區(qū)破壞骨纖維之間的交聯(lián)進(jìn)行提取,但由于酶切位點(diǎn)的特定性和膠原分子三螺旋結(jié)構(gòu)不易被酶解的特點(diǎn),提取的蛋白分子量不均勻,不利于吸收[12]。以上3種方法各具優(yōu)缺點(diǎn),但骨蛋白提取過程的環(huán)境污染問題是三者共性問題,需要進(jìn)一步改進(jìn)。

超高壓技術(shù)(Ultra high pressure,UHP)是利用超過100 MPa的液壓,使生物高分子的氫鍵作用紊亂、立體結(jié)構(gòu)喪失,從而在不影響一級(jí)結(jié)構(gòu)的條件下釋放活性物質(zhì)[13]。當(dāng)前超高壓技術(shù)在動(dòng)物源蛋白提取中主要起輔助作用,常用于豬皮、魚皮等結(jié)締軟組織[14-16],需要與其他如pH、酶等條件協(xié)同作用,但以骨為原料的超高壓提取方法并不多見。李紅霞等[17]通過超高壓前處理豬骨,木瓜蛋白酶提取,得到少量膠原蛋白及大量游離羥脯氨酸。針對(duì)骨組織,超高壓技術(shù)可以在靜力條件下促進(jìn)骨纖維表面剝落,破壞骨結(jié)構(gòu)從而釋放蛋白。同時(shí),超高壓提取全程無污染,極大降低了環(huán)境污染處理成本。因而,本文以牛骨蛋白提取率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),通過保壓時(shí)間、作用壓力及環(huán)境pH值[18-19]3個(gè)影響指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面分析選取最佳提取條件,研究牛骨蛋白的超高壓提取工藝,為新型牛骨蛋白提取工藝研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

牦牛骨粉購自青海雪牛生物工程有限公司;BCA試劑盒購自北京蘭博利德有限公司;其他試劑均為市售分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

超高壓設(shè)備UHP購自天津華泰森淼超高壓裝備工程技術(shù)有限公司;酶標(biāo)儀購自無錫華衛(wèi)德朗有限公司;凱氏定氮儀購自山東格林凱瑞有限公司;凍干機(jī)購自北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脫鈣方法

用0.72 mol/L的鹽酸按照1∶10浸酸料液比室溫?cái)嚢? h充分脫鈣[20];完成脫鈣后調(diào)節(jié)pH值至7.0,送入凍干機(jī)凍干2 d,得到脫鈣骨粉。

1.2.2 蛋白濃度測(cè)定

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:取20 mg蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BCA),加入1 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)稀釋液,充分溶解,并繼續(xù)稀釋至終濃度為500 μg/mL。

(2)加樣:分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。將500 μg/mL蛋白溶液按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加入96孔板標(biāo)準(zhǔn)孔中,用去離子水補(bǔ)充至20 μL;樣品孔中依次加入20 μL待測(cè)樣品,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3次重復(fù)。每孔加入200 μL BCA工作液,37 ℃條件下孵育30 min,酶標(biāo)板上覆膜,37 ℃溫浴1 h。

(3)測(cè)定:于562 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。

(4)計(jì)算:各孔吸光度值減去未加500 μg/mL蛋白溶液的吸光度,得到的差值為縱坐標(biāo),以蛋白濃度為橫坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品的蛋白濃度。

1.2.3 蛋白提取率計(jì)算

提取液中蛋白量占脫鈣牛骨粉蛋白量的百分比即為蛋白提取率。

式中,v1為提取液體積,mL;c1為提取液中蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL;m0為原料質(zhì)量,mg;c0為原料中蛋白量的百分比。

1.2.4 超高壓制備工藝

(1)單因素實(shí)驗(yàn)條件篩選。

保壓時(shí)間的影響:稱取1 g脫鈣骨粉置于密封袋中,分為4個(gè)樣本,每個(gè)樣本均加入10 mL去離子水;壓力150 MPa,各組樣品保壓時(shí)間分別為10、30、60、90 min。提取完成后,測(cè)定提取液蛋白濃度,計(jì)算提取率,分析保壓時(shí)間對(duì)提取率的影響趨勢(shì)。

作用壓力的影響:稱取1g脫鈣骨粉置于密封袋中,分為5個(gè)樣本,每個(gè)樣本均加入10 mL去離子水;保壓時(shí)間為60 min,各組樣品作用壓力分別為100、125、150、175、200 MPa。提取完成后,測(cè)定提取液蛋白濃度,計(jì)算提取率,分析作用壓力對(duì)提取率的影響趨勢(shì)。

環(huán)境pH的影響:稱取1g脫鈣骨粉置于密封袋中,分為4個(gè)樣本,每個(gè)樣本均保持保壓時(shí)間60 min,作用壓力150 MPa;各組樣品的環(huán)境pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0。提取完成后,測(cè)定提取液蛋白濃度,計(jì)算提取率,分析環(huán)境pH對(duì)提取率的影響趨勢(shì)。

(2)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)及參數(shù)選擇。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,將蛋白提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),應(yīng)用Design Expert 13軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確定超高壓輔助提取牛骨蛋白的最優(yōu)工藝條件。因素水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平編碼值

(3)多次提取實(shí)驗(yàn)。按照保壓時(shí)間60 min、作用壓力150 MPa、pH 7.0去離子水進(jìn)行第1次提取。提取后固體殘留烘干,按質(zhì)量均分為兩組a和b,分別依次加入5 mL去離子水和5 mL 0.5%(酶液比)中性蛋白酶水溶液,進(jìn)行第2次提取。第2次提取后固體殘留在同樣條件下進(jìn)行第3次提取。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓輔助骨粉提取蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 保壓時(shí)間對(duì)骨粉蛋白提取率的影響

作用壓力為150 MPa,提取液pH 7.0,保壓時(shí)間分別為10、30、60和90 min時(shí),各組提取液中蛋白質(zhì)總量依次為21.093、29.733、30.947和24.733 mg;圖1為各組的蛋白提取率,依次為26.4%、37.2%、38.7%和31.2%。由圖1可知隨著保壓時(shí)間的增加,蛋白提取率在10～60 min上升,在90 min下降,這與骨粉中骨素析出有關(guān)[21]。骨素是骨結(jié)構(gòu)中不可溶的蛋白鹽類衍生物[22]。隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng),骨素的析出隨之增加,逐漸堵塞骨結(jié)構(gòu)的孔通道,影響后續(xù)蛋白的釋放,因而蛋白提取率出現(xiàn)先增高后降低的現(xiàn)象。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,保壓時(shí)間選擇60 min。

圖1 保壓時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

2.1.2 作用壓力對(duì)骨粉蛋白提取率的影響

保壓時(shí)間為60 min,提取液pH 7.0,作用壓力分別為100、125、150、175和200 MPa時(shí),各組提取液中蛋白質(zhì)總量依次為25.613、26.934、30.947、30.013和29.48 mg;圖2為各組的蛋白提取率,依次為32%、33.7%、38.7%、37.5%和36.9%。由圖2可知蛋白提取率在100～150 MPa升高,在150～300 MPa降低。隨著壓力升高,骨結(jié)構(gòu)的通道孔徑也在擴(kuò)大,加速了蛋白自骨纖維網(wǎng)絡(luò)上的脫落;但同時(shí)也加速不可溶骨素的析出,一部分水溶性蛋白與溶劑分子之間的斥力會(huì)在壓力作用下增大,降低溶解性能[23]。當(dāng)壓力超過150 MPa后,出現(xiàn)蛋白提取率降低現(xiàn)象,故作用壓力選擇150 MPa。

圖2 作用壓力對(duì)蛋白提取率的影響

2.1.3 環(huán)境pH對(duì)蛋白提取率的影響

保壓時(shí)間為60 min,作用壓力為150 MPa,pH值分別為5.0、6.0、7.0和8.0時(shí),各組提取液中蛋白質(zhì)總量依次為28.16、30.8、30.947和29.76 mg;圖3為各組的蛋白提取率,依次為35.2%、37.6%、38.7%和37.2%。由圖3可知,提取率在pH 7.0時(shí)達(dá)到最高。這可能與牛骨中蛋白溶解性有關(guān)。在作用壓力150 MPa、保壓時(shí)間60 min,環(huán)境pH 7.0時(shí)酸溶性蛋白與堿溶性蛋白有部分被提取,所以該條件下蛋白提取率最高。在酸性環(huán)境下酸溶性蛋白提取率增加而堿溶性蛋白提取率隨之降低,在堿性條件下堿溶性蛋白提取率增加而酸溶性蛋白提取率降低,故環(huán)境pH值選擇7.0。

圖3 環(huán)境pH對(duì)蛋白提取率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定最佳超高壓輔助提取最佳工藝參數(shù)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,使用Design Expert 13軟件,根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究保壓時(shí)間(A)、作用壓力(B)和pH(C)共3個(gè)因素對(duì)牛骨粉蛋白提取率的影響,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果多元回歸分析,建立方程:

蛋白提取率=38.7+0.212 5A+0.95B-0.612 5C-0.3AB+0.125AC+0.2BC-3.51A2-4.59B2-5.26C2

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析如表3所示。由表3可知超高壓輔助提取蛋白回歸模型P<0.05,表明該響應(yīng)面模型顯著,可以明確表示牛骨蛋白在超高壓下提取與保壓時(shí)間、作用壓力以及pH之間的數(shù)量關(guān)系規(guī)律。模型中B2、C2的P值均小于0.01,差異達(dá)到極顯著,A2的P=0.012 3≈0.01<0.05,差異不顯著,誤差較小。經(jīng)查驗(yàn)R2=0.930 2,表明有93.02%的響應(yīng)值可以用該模型進(jìn)行解釋,模型適用于本實(shí)驗(yàn)理論解釋[24-26]。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析

圖4直觀顯示牛骨粉蛋白提取率與各個(gè)因素之間的相互關(guān)系。等高線的疏密程度用來反映不同因素對(duì)牛骨粉蛋白提取率的影響程度,等高線變化越密集,說明該因素對(duì)牛骨粉蛋白提取率影響越明顯。

(a)保壓時(shí)間(A)與作用壓力(B) ;(b)保壓時(shí)間(A)與pH(C);(c)作用壓力(B)與pH(C)。

由圖4(a)可得,當(dāng)pH(C)因素處于0水平位置,保壓時(shí)間在30～60 min時(shí),蛋白提取率與保壓時(shí)間正相關(guān),60 min后,隨保壓時(shí)間增加提取率降低;作用壓力在100～150 MPa范圍內(nèi),蛋白提取率與作用壓力正相關(guān),超過150 MPa,蛋白提取率與作用壓力成反比關(guān)系。保壓時(shí)間60 min、作用壓力為150 MPa時(shí)蛋白提取率最高。由圖4(b)可得,當(dāng)作用壓力(B)因素處于0水平位置,保壓時(shí)間在30～90 min時(shí),蛋白提取率先升高再降低;pH值在6～7范圍內(nèi),蛋白提取率與pH值正相關(guān),pH值超過7時(shí),蛋白提取率與pH值成反比關(guān)系。保壓時(shí)間60 min、環(huán)境pH值為7時(shí)蛋白提取率最高。由圖4(c)可得,當(dāng)保壓時(shí)間(A)因素處于0水平位置,作用壓力在100～150 MPa范圍內(nèi),蛋白提取率先升高再降低;環(huán)境pH值在6～8范圍內(nèi),蛋白提取率與pH值先呈正比再呈反比關(guān)系。保壓時(shí)間60 min、pH值為7時(shí)蛋白提取率最高。

2.2.3 工藝優(yōu)化與驗(yàn)證

分析二次回歸方程,可得到超高壓輔助牛骨粉蛋白提取率最優(yōu)條件:保壓時(shí)間為53.777 min,作用壓力為188.857 MPa,pH值為6.654,該條件下牛骨粉蛋白的理論提取值為36.058%。對(duì)最佳工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,根據(jù)現(xiàn)實(shí)工業(yè)生產(chǎn),將預(yù)測(cè)條件優(yōu)化為保壓時(shí)間54 min,作用壓力189 MPa,環(huán)境pH值6.7。結(jié)果得到在該優(yōu)化條件下,蛋白提取率35.62%,與理論模型預(yù)測(cè)值吻合度達(dá)98.8%,因此,該響應(yīng)面具有可參考性應(yīng)用價(jià)值。

2.3 多次提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

多次提取的蛋白提取率結(jié)果見表4。結(jié)果表明,通過增加提取次數(shù),可以有效地將牛骨中的蛋白進(jìn)一步釋放,提高蛋白提取率,3次提取后提取率可達(dá)54.2%。結(jié)合中性蛋白酶可以釋放一部分難溶蛋白,提高蛋白提取率,最高可達(dá)59.3%。

表4 多次提取蛋白提取率

3 結(jié)論

本研究以市售牛骨粉為原料,采用超高壓輔助pH提取法對(duì)骨粉內(nèi)的蛋白進(jìn)行提取。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選出對(duì)蛋白提取率有顯著影響的因素(保壓時(shí)間、作用壓力和pH值),進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),最終得到超高壓輔助pH提取法提取骨粉蛋白最適條件為保壓時(shí)間54 min,作用壓力189 MPa,pH 6.7,在此提取條件下,蛋白提取率可達(dá)35.62%。

通過響應(yīng)面優(yōu)化方法,建立利用超高壓提取牛骨蛋白的方法,篩選最佳牛骨蛋白超高壓提取條件,證實(shí)超高壓技術(shù)可以在溫和環(huán)境下有效提取牛骨蛋白,在pH 7時(shí)提取率可達(dá)38.7%,經(jīng)檢測(cè)牛骨蛋白含量為8.00%,本方法單次提取的得率可達(dá)3.10%,將提取次數(shù)增加至3次,得率可達(dá)4.34%,結(jié)合中性酶提取可將得率提升至4.74%。酸法提取牛骨蛋白的得率為2.20%～2.24%,酶法的得率為2.03%～3.32%[8,27-28],本方法的單次得率高于酸法,與酶法得率相當(dāng),增加提取次數(shù)或結(jié)合中性酶法提取可使得率高于現(xiàn)有方法,具有應(yīng)用推廣意義。

超高壓提取過程的能耗主要是升壓過程中的電力消耗,升壓過程不超過1 min,后續(xù)保壓過程能耗很低,按照廠家提供的處理200 kg的大型設(shè)備計(jì)算,1 h的提取過程用電不超過10 kW。超高壓提取方法的成本主要是設(shè)備投資,按設(shè)備折舊年限15年計(jì),1噸牛骨蛋白的設(shè)備成本為35 178.4元,加上生產(chǎn)消耗的水電等,成本不超過5萬元/t,目前牛骨蛋白市場(chǎng)價(jià)格為7萬元/t,方法具有經(jīng)濟(jì)可行性。隨著工藝優(yōu)化、設(shè)備改進(jìn)、生產(chǎn)規(guī)?；?超高壓提取方法的成本會(huì)逐漸降低,而且整個(gè)過程無需添加酸或堿,可有效降低污染處理成本,有利于提高經(jīng)濟(jì)效益,為牛骨蛋白的綠色提取提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。