李慧耀,楊求華,葛 輝,何麗斌,吳麗云,吳建紹*

(1.福建省水產(chǎn)研究所,福建 廈門 361013; 2.福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室,福建 廈門 361013)

斜帶髭鯛(Hapalogenysnitens)是一種重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類,隸屬于鱸形目(Perciformes) ,石鱸科(Haemulidae) ,髭鯛屬(Hapalogenys),主要分布在西北太平洋地區(qū),是東亞特有海洋魚類[1]。斜帶髭鯛在我國東海、南海均有野生資源分布,主要生活在近海中下層水體,攝食底棲的魚類或者貝類[2]。斜帶髭鯛具有長速快、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)良養(yǎng)殖性狀,1995年成功進行人工育苗,隨著養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴大,已發(fā)展成為我國沿海重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類之一[3]。然而,近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的發(fā)展和養(yǎng)殖密度擴大,斜帶髭鯛患內(nèi)臟白點病發(fā)病越來越頻繁,制約了該養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

內(nèi)臟白點病是魚類中常見的一種細(xì)菌性疾病,主要臨床表現(xiàn)為病魚活力下降、食欲減退,體表無明顯癥狀,但解剖后可觀察到脾臟、肝臟、腎臟等內(nèi)臟有許多白色結(jié)節(jié)小點,可能伴有嚴(yán)重的腹水、脹氣等癥狀,發(fā)病初期不易察覺,后期死亡率極高,易造成較大的經(jīng)濟損失[4]。魚類內(nèi)臟白點病的病原呈現(xiàn)多樣化特點,有鰤魚諾卡氏菌(Nocardiaseriolea)[5]、變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)[6]、巴氏桿菌(Pasteurellapiscicida)[7]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[8]、美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)[9]和立克次氏體[10]等。由于不同病原菌感染魚類所引起的內(nèi)臟白點病外觀癥狀相似,因此有必要對發(fā)生內(nèi)臟白點病的病原進行分離鑒定。

目前,關(guān)于斜帶髭鯛內(nèi)臟白點病的研究未見報道。本研究從患內(nèi)臟白點病的斜帶髭鯛的內(nèi)臟中分離得到一株優(yōu)勢菌株,結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征和分子生物學(xué)技術(shù)對其進行種類鑒定,并對分離得到的菌株進行了藥物敏感性試驗,本研究可為斜帶髭鯛內(nèi)臟白點病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

患病和健康的斜帶髭鯛均采集自福建省漳州市龍海區(qū)斗美海域魚排網(wǎng)箱,重量為(395±23) g,采集樣本時海區(qū)水溫為15 ℃,鹽度為25,溶解氧濃度為8.13 mg/L。病魚臨床表現(xiàn)為腹部脹大、食欲不振、游泳無力。使用無菌采樣袋將病魚轉(zhuǎn)移至實驗室進行解剖觀察,無菌操作條件下,從病魚的脾臟和頭腎等器官病灶處取樣,使用2216E液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)對病原菌進行分離培養(yǎng),在28 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)過夜。然后用無菌接種環(huán)挑取單菌落在2216E瓊脂平板上劃線純化,重復(fù)3次。純化后的菌種用體積分?jǐn)?shù)為20%甘油生理鹽水保存于-80℃超低溫冰箱中備用。使用透射電子顯微鏡(日立HT7800,日本)觀察分離菌的顯微形態(tài)。

1.2 回歸感染

將分離的菌株接種于5 mL的液體培養(yǎng)基,在220 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)細(xì)菌至對數(shù)生長期。用無菌生理鹽水(北京索萊寶科技有限公司)稀釋菌液至濃度約為106 CFU/mL,采用腹腔注射法進行回歸感染,每尾魚注射菌懸液100 μL,對照組注射等量無菌生理鹽水,每組設(shè)置3個平行,每個平行10尾魚,回歸感染用魚規(guī)格為(73±8) g,感染后取癥狀明顯的個體進行病原菌的分離。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)提取細(xì)菌基因組DNA,具體步驟按照說明書進行。使用引物擴增細(xì)菌的16S rRNA、dnaJ、gyrB基因[11],引物序列如表1所示。PCR反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,45～57 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,72 ℃延伸10 min,4 ℃保存,反應(yīng)循環(huán)數(shù)為35次,反應(yīng)體系為50 μL。反應(yīng)產(chǎn)物交由廈門鉑尚生物技術(shù)有限公司進行測序。測序所得到的序列與NCBI(National Center for Biotechnology Information)下載的序列通過軟件MEGA 7.0基于Neighbour-joining方法構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 PCR擴增所用引物序列Tab. 1 Primer sequences for PCR amplification

1.4 生理生化鑒定

參照Guo等[14]的方法,采用Biolog Gene III 半自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定細(xì)菌的生理生化表型。使用濁度計將含有10 mL IF-A的空白試管(Biolog目錄72401,濁度計的透射率調(diào)節(jié)到100%),從過夜培養(yǎng)的瓊脂平板上挑取單菌落添加到試管中,使懸浮液的透射率保持在95%～98%之間,然后將懸浮液添加到96孔板中(100 μL/孔,Gene III),并在28 ℃下培養(yǎng)18～24 h。使用MicroStationTMand OmniLog?軟件對細(xì)菌的生理生化表型進行鑒定。

1.5 組織病理學(xué)

從“1.1”中同時切取厚度小于5 mm的具有典型癥狀的患病斜帶髭鯛肝臟、脾臟、腎臟、鰓和心臟等組織器官,取健康斜帶髭鯛對應(yīng)樣品作為對照組,使用Servicebio 通用型組織固定液在室溫下固定24 h。制備組織切片并用石蠟包埋。切片用蘇木精-伊紅(H&E)染色后在顯微鏡下觀察并拍照[15]。

1.6 毒力基因檢測

通過PCR法檢測分離菌的常見毒力基因攜帶情況,包括毒力調(diào)控基因toxR、群體效應(yīng)調(diào)節(jié)基因luxR、金屬蛋白酶基因vhpA和vhpB、鋅金屬蛋白酶基因pap6、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)溶血素基因vhh、霍亂弧菌(Vibriocholerae)溶血素基因hlyA、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)溶血素基因vvh、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)耐熱直接溶血素基因tdh和耐熱直接相關(guān)溶血素基因trh,其所需的引物序列見表1[12-13]。PCR 擴增體系及程序參照“1.3”。

1.7 抗微生物藥物敏感性試驗

使用藥敏紙片擴散法測定分離菌株對氨芐西林、阿米卡星、呋喃妥因和諾氟沙星等29種抗生素的敏感性。具體步驟為將過夜培養(yǎng)的分離菌菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的2216E液體培養(yǎng)基中,在28 ℃、200 r/min條件下,培養(yǎng)至OD600為0.3～0.4,取100 μL菌液均勻涂布在MH平板上,并在超凈臺上晾干30 min,待平板上的水分被充分吸收后,將藥敏試紙(杭州濱和微生物試劑有限公司)平整的貼在涂有菌液的平板上。在28 ℃下倒置培養(yǎng)16～24 h,每種藥物設(shè)置3個重復(fù)試驗,使用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小,根據(jù)CLSI M100標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌對藥物的敏感程度。使用動物用藥敏檢測分析試劑盒(南京菲恩醫(yī)療科技有限公司)測定《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙 2022年 1、2 號》中批準(zhǔn)使用8種常用漁藥對分離菌株的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration, MIC),包括恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶,具體步驟按說明書要求進行。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及回歸感染結(jié)果

斜帶髭鯛發(fā)病時在網(wǎng)箱邊緩游或浮在水面,瀕死病魚體表外觀無潰瘍、缺損,但腹部鼓脹,鰓絲有白點且輕度潰爛[圖1(a)],鏡檢無其它寄生蟲附著,卵巢腫大、肝臟呈黃白色,肝臟、脾臟、頭腎和心臟上有明顯的白點結(jié)節(jié)癥狀,其中脾臟白點癥狀最嚴(yán)重[圖1(b)]。從脾臟、肝臟和頭腎病灶處均可分離到外觀單一的細(xì)菌菌落hn-1,菌株在2216E瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形,邊緣整齊,菌落直徑約1～2 mm,在TCBS培養(yǎng)基上呈黃色圓形菌落。透射電鏡觀察結(jié)果顯示,分離菌株呈桿狀,具極生單鞭毛,長度約4.6 μm[圖1(c)]。經(jīng)16S rRNA測序鑒定為哈維氏弧菌?；貧w感染實驗結(jié)果顯示,第5天肝臟、脾臟已經(jīng)出現(xiàn)白點癥狀[圖1(d)],被感染的斜帶髭鯛在第5天開始出現(xiàn)大量死亡,第12天死亡率達到91.4%(圖2),從回歸感染后出現(xiàn)白點病癥狀魚體中分離得到的菌株經(jīng)鑒定與感染菌株一致。

圖1 斜帶髭鯛白點病臨床癥狀及分離菌株透射電鏡圖Fig. 1 Clinical symptom of white spot disease in Hapalogenys nitens and the transmission electron microscopy of isolated strains(a)自然感染病魚鰓部白點,(b)自然感染病魚脾臟白點,(c)hn-1菌株透射電鏡圖,(d)回歸感染病魚。

圖2 哈維氏弧菌對健康斜帶髭鯛回歸感染試驗結(jié)果Fig. 2 Results of the artificial infection test of Vibrio harveyi on healthy Hapalogenys nitens

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)測序獲得分離菌株的16S rRNA序列,通過與NCBI數(shù)據(jù)庫比對顯示分離菌均為哈維氏弧菌。分離菌株的16S rRNA、dnaJ、gyrB基因序列與NCBI下載的基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果顯示分離菌株與哈維氏弧菌聚為一類(圖3～5)。由此可進一步表明,分離得到的hn-1菌株為哈維氏弧菌。

圖3 哈維氏弧菌16S rRNA核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 3 Phylogenetic relationship between the nucleotide sequences of 16S rRNA of Vibrio harveyi

圖4 哈維氏弧菌dnaJ核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 4 Phylogenetic relationship between the nucleotide sequences of dnaJ of Vibrio harveyi

圖5 哈維氏弧菌gyrB核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 5 Phylogenetic relationship between the nucleotide sequences of gyrB of Vibrio harveyi

2.3 生理生化鑒定

通過Biolog Gene III鑒定分離菌株,鑒定結(jié)果顯示為哈維氏弧菌,菌株可分解多種糖和氨基酸,對葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、絲氨酸、精氨酸和谷氨酸呈陽性,對肌醇呈弱陽性;耐受醋竹桃霉素、萬古霉素、利福霉素等抗生素(表2)。與Biolog Gene III數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)菌株相比,分離株不可降解糊精和L-半乳糖醛酸內(nèi)脂,對氨曲南敏感。

表2 分離菌株的生理生化特征Tab. 2 Physiological and biochemical characteristics of isolated strain

2.4 組織病理學(xué)變化

經(jīng)組織切片觀察,患內(nèi)臟白點病的斜帶髭鯛的肝臟、脾臟、鰓、頭腎、心臟均可觀察到明顯炎性肉芽腫病灶部位,呈深紫色,近圓形(圖6)。健康斜帶髭鯛肝組織細(xì)胞形狀較規(guī)則,肝細(xì)胞索清晰[圖6(a)],患病魚部分肝細(xì)胞嚴(yán)重壞死、萎縮成團,肝細(xì)胞界限模糊不清[圖6(b)];健康魚脾臟細(xì)胞密集相間,可見明顯的髓狀結(jié)構(gòu)[圖6(c)],患病魚脾臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松,病灶處形成致密細(xì)胞團,無髓狀結(jié)構(gòu)[圖6(d)];健康魚鰓絲結(jié)構(gòu)清晰、排列規(guī)則[圖6(e)],患病魚鰓絲萎縮、潰爛卷曲,鰓絲末端形成細(xì)胞團[圖6(f)];健康魚頭腎組織無結(jié)節(jié),可見血管組織,血管中含紅細(xì)胞[圖6(g)],患病魚頭腎組織病灶處形成致密細(xì)胞團,無血管結(jié)構(gòu)[圖6(h)];健康魚心臟組織結(jié)構(gòu)清晰,分布規(guī)則[圖6(i)],患病魚病灶處心肌組織橫紋消失,細(xì)胞壞死形成了結(jié)節(jié)[圖6(j)]。

圖6 斜帶髭鯛組織器官病理切片圖Fig. 6 Histopathological examination of Hapalogenys nitens(a)、(c)、(e)、(g)和(i)分別為健康魚的肝、脾、鰓、頭腎和心臟組織切片圖,(b)、(d)、(f)、(h)和(j)分別為病魚的肝、脾、鰓、頭腎和心臟組織病理切片圖。

2.5 分離菌株毒力基因攜帶情況

毒力基因檢測結(jié)果如圖7所示,hn-1菌株攜帶哈維氏弧菌典型毒力調(diào)控基因toxR、群體效應(yīng)調(diào)節(jié)基因luxR和溶血素基因vhh,以及創(chuàng)傷弧菌溶血素基因vvh和副溶血弧菌耐熱直接相關(guān)溶血素基因trh;不含金屬蛋白酶基因vhpA和vhpB、鋅金屬蛋白酶基因pap6、霍亂弧菌溶血素基因hlyA和副溶血弧菌耐熱直接溶血素基因tdh。

2.6 抗微生物藥物敏感性試驗結(jié)果

藥敏紙片法測定抗生素藥敏實驗結(jié)果如表3所示,分離菌株對氨芐西林、青霉素、萬古霉素、阿莫西林和多粘菌素B耐藥,對紅霉素中介,對四環(huán)素類(四環(huán)素、米諾環(huán)素、多西環(huán)素)、喹諾酮類(如諾氟沙星、恩諾沙星、左氧氟沙星等)、氨基糖苷類(如鏈霉素、新霉素等)等23種藥物敏感。常用漁藥MIC試驗結(jié)果顯示,鹽酸多西環(huán)素對分離菌株的MIC值最低,為0.06 μg/mL,其次是氟甲喹,MIC值為0.125 μg/mL(表4)。

表3 紙片擴散法測定抗生素藥敏結(jié)果Tab. 3 Results of antibiotic susceptibility determination by K-B method

表4 常用漁藥最小抑菌濃度測定結(jié)果Tab. 4 Determination results of MIC of common fishery drugs

3 討論

哈維氏弧菌是一種常見的條件致病菌,廣泛分布于養(yǎng)殖水體中,適鹽范圍較廣,在淡水和海水中均可生存并感染宿主[16-17]。哈維氏弧菌的宿主范圍廣,可感染貝類[18]、甲殼類[17]和魚類[19]等,在海水養(yǎng)殖的魚類中,哈維氏弧菌感染可導(dǎo)致斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)和軍曹魚(Rachycentroncanadum)等魚類患病,其主要癥狀為肛門紅腫、腹部鼓脹和腹腔積液[14]。也可感染引起雙斑東方鲀(Takifugubimaculatus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)、線紋海馬(Hippocampuserectus)、淺色黃姑魚(Nibeacoibor)、豹紋鰓棘鱸(Plectropomusleopardus)等魚類患病,其主要癥狀為皮膚潰爛[20-25]。哈維氏弧菌還可引起網(wǎng)箱養(yǎng)殖的鱸魚發(fā)生內(nèi)臟白點病,且病魚的肝、脾和腎等多器官組織出現(xiàn)明顯的白色結(jié)節(jié)癥狀[19]?？筛腥觉|魚(Miichthysmiiuy)引起出血性潰瘍病和內(nèi)臟白點病[26]。本研究報道了哈維氏弧菌可導(dǎo)致斜帶髭鯛患內(nèi)臟白點病,擴大了哈維氏弧菌的天然宿主范圍。

內(nèi)臟白點病典型癥狀為解剖可見大量肉芽腫聚集形成的白色結(jié)節(jié),在顯微鏡下可觀察到病灶處有大量壞死細(xì)胞,肝、腎、脾為主要的病變組織[27]。魚類白點病病灶組織分布廣泛,本研究中患病的斜帶髭鯛的肝、脾、鰓、頭腎、心臟表面均有發(fā)現(xiàn)典型白色結(jié)節(jié)病灶,與鰤魚諾卡氏菌(Nocardiaseriolae)感染卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)引起的白點病患病部位相同[28]。經(jīng)組織切片觀察,病魚內(nèi)臟病灶部位組織壞死崩解,壞死細(xì)胞聚集成團形成白色結(jié)節(jié),鰓絲潰爛卷曲、鰓小片細(xì)胞脫落,末端與鄰近的鰓小片融合在一起呈棒狀,與大黃魚(Larimichthyscrocea)[29]、美國鰣魚(Alosasapidissima)[27]、卵形鯧鲹[28]等魚類白點病組織病理變化相似,是魚類內(nèi)臟白點病典型病理特征。由于不同病原菌導(dǎo)致發(fā)生內(nèi)臟白點病病魚發(fā)病癥狀和組織病理變化相似,需要進一步加強內(nèi)臟白點病病原鑒定和監(jiān)測。

細(xì)菌的毒力基因與其致病性密切相關(guān),毒力基因可在不同菌株之間轉(zhuǎn)移導(dǎo)致菌株毒力存在差異[30]。本研究中哈維氏弧菌hn-1菌株檢測到3種典型毒力基因,分別為毒力調(diào)控基因toxR、群體效應(yīng)調(diào)節(jié)基因luxR和溶血素基因vhh。toxR為表達調(diào)控類毒力因子,能調(diào)控多種毒力基因的表達[12];luxR是群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因,可調(diào)節(jié)細(xì)菌的毒力因子表達、運動性和生物膜形成能力等毒力因子[31];溶血素基因可產(chǎn)生多種引起溶血作用的酶,是細(xì)菌的重要毒力因子之一[32]。吳立婷等對54株大黃魚源哈維氏弧菌的毒力基因攜帶情況進行檢測,結(jié)果顯示,toxR、luxR和vhh的攜帶率分別達到75.9%、74.4%和64.8%[12];泥蚶(Tegillarcagranosa)源哈維氏弧菌J14和J19菌株也均攜帶上述3種毒力基因[30]。除了攜帶哈維氏弧菌溶血素基因vhh,hn-1菌株同時攜帶創(chuàng)傷弧菌溶血素基因vvh和副溶血弧菌耐熱直接相關(guān)溶血素基因trh。hn-1菌株含有多種典型和外來毒力基因,其致病性可能由多種基因共同調(diào)控,毒力基因具體表達情況和調(diào)控機制有待進一步研究。

抗生素耐藥性是細(xì)菌的一種自我保護機制,在抗生素的環(huán)境選擇壓力下,細(xì)菌可通過突變或基因水平轉(zhuǎn)移等方式獲得新的耐藥性?？股氐拇罅渴褂靡呀?jīng)在全世界范圍加劇了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生,積極開展細(xì)菌耐藥性試驗,有利于養(yǎng)殖過程中抗生素的合理使用,防止細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和發(fā)展[33]。本研究中分離的哈維氏弧菌菌株主要對青霉素類藥物耐藥,如氨芐西林、青霉素和阿莫西林;對糖肽類的萬古霉素和多肽類的多粘菌素B也有耐藥性;對喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類等藥物具有較強的敏感性。分離菌株的耐藥性與從許氏平鲉(Sebastesschlegelii)中分離的哈維氏弧菌P5W菌株[34]和泥蚶中分離的J14菌株[30]較為一致,但與P5W菌株對比,分離株hn-1仍保持對氨基糖苷類藥物較高的敏感性。根據(jù)《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙 2022 年 1、2 號》中批準(zhǔn)使用的8種水產(chǎn)常用抗生素的MIC值檢測結(jié)果,鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹和恩諾沙星的MIC值較低,生產(chǎn)上可采用這3種抗生素用于該病的防治。

4 結(jié)論

本研究通過對分離自患內(nèi)臟白點病的斜帶髭鯛的病原進行鑒定和分析,獲得了如下結(jié)論:

(1)確認(rèn)了哈維氏弧菌可引起斜帶髭鯛內(nèi)臟白點病,擴大了哈維氏弧菌的天然宿主范圍。

(2)哈維氏弧菌hn-1菌株攜帶toxR、luxR、vhh、vvh和trh毒力基因,對喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類等藥物具有較強的敏感性,該結(jié)果可為養(yǎng)殖斜帶髭鯛內(nèi)臟白點病的病害防治提供新的參考依據(jù)。