趙付榮, 王 蔚,張艷閣,鄭 秦,陳建明*

(1.閩江學(xué)院地理與海洋學(xué)院、福建省海洋生物多樣性保護(hù)與永續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350108;2.福州海洋研究院,福建 福州 350108)

甲殼動(dòng)物屬于無脊椎動(dòng)物,是重要的經(jīng)濟(jì)類養(yǎng)殖動(dòng)物,目前在水產(chǎn)品中的比重逐漸加大。作為代表性養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物的蝦類和蟹類,其需求量隨著人們生活水平的不斷提高而持續(xù)增加,蝦蟹類養(yǎng)殖業(yè)也得到了快速發(fā)展。但是飼養(yǎng)技術(shù)的不足與相關(guān)疾病的發(fā)生仍是蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)的重大威脅,目前已知能感染蝦蟹的病原有病毒、細(xì)菌、真菌、立克次氏體和寄生蟲等,如白斑綜合征(WSD)、急性肝胰腺壞死綜合征(AHPND)等是影響?zhàn)B蝦業(yè)的最具侵略性的疾病[1]。在充滿病原微生物的復(fù)雜環(huán)境里,脊椎動(dòng)物依靠先天性免疫和獲得性免疫兩種形式抵御病原微生物的侵害,而甲殼動(dòng)物僅具有先天性免疫,主要存在細(xì)胞免疫與體液免疫兩種形式,其中體液免疫中的免疫信號(hào)通路發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[2]。在無脊椎動(dòng)物中,主要存在著3條免疫功能調(diào)控的信號(hào)通路:Toll、IMD和JAK/STAT。Toll和IMD信號(hào)通路主要參與抗細(xì)菌和真菌的免疫反應(yīng),少部分具有抗病毒免疫效應(yīng)[3-4],而JAK/STAT信號(hào)通路主要參與抗細(xì)菌和抗病毒免疫反應(yīng),但相關(guān)的分子機(jī)制尚未完全清楚[5]。

JAK/STAT 信號(hào)通路,即Janus激酶(JAK)-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activators of transcription,STAT),這一信號(hào)通路于1994年,被Darnell等在研究干擾素誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)[6]。JAK/STAT信號(hào)通路是一種多種細(xì)胞因子共用的主要信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制,參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等,已在多種模式生物中被廣泛研究。隨著研究的深入,現(xiàn)已確定與蝦蟹同為無脊椎動(dòng)物的果蠅(Drosophilamelanogaster)的JAK/STAT信號(hào)通路的核心成分,分別是配體(UPD)、酪氨酸激酶(JAK)、膜受體(Dome)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)[7-8]。細(xì)胞因子與相應(yīng)的受體結(jié)合后引起受體分子的二聚化,這使得與受體偶聯(lián)的JAK激酶相互接近并通過交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受體上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾。受體磷酸化為細(xì)胞質(zhì)STAT創(chuàng)建對(duì)接位點(diǎn),STAT通過酪氨酸磷酸結(jié)合SH2結(jié)構(gòu)域被招募到受體復(fù)合物中,并自身磷酸化?；罨牧姿峄疭TAT(pSTAT)通過分子間SH2-磷酸酪氨酸相互作用形成同源或異源二聚化,易位到細(xì)胞核,結(jié)合DNA調(diào)控元件,改變?nèi)旧|(zhì)可及性,誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄[9]。該信號(hào)通路為細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的重要途徑,在進(jìn)化上相對(duì)保守,廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)、血管生成、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及腫瘤生成等重要的生物學(xué)過程[9-10]。目前JAK/STAT信號(hào)通路的研究在信號(hào)識(shí)別、信號(hào)調(diào)控以及基因的調(diào)控表達(dá)方面成果非常豐富。但在甲殼動(dòng)物中,關(guān)于JAK/STAT信號(hào)通路的關(guān)鍵元件及功能的報(bào)道有限,至今還沒有形成一個(gè)完整的體系[11]。

在先天免疫系統(tǒng)的研究中,果蠅等經(jīng)典的無脊椎動(dòng)物模式生物[12],為蝦蟹等甲殼動(dòng)物的JAK/STAT信號(hào)通路的研究提供了有效參考。研究人員發(fā)現(xiàn)蝦免疫系統(tǒng)的基本框架與昆蟲高度相似[11, 13],在蝦中發(fā)現(xiàn)了JAK/STAT信號(hào)通路的相關(guān)元件,并通過系統(tǒng)發(fā)育分析證明對(duì)蝦STAT與昆蟲STAT具有較高的同源性。本文從Dome、JAK、STAT、信號(hào)調(diào)節(jié)因子這4個(gè)方面來討論養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物JAK/STAT信號(hào)通路的研究進(jìn)展。該信號(hào)通路上各組分的作用見表1。

表1 甲殼動(dòng)物各元件在JAK/STAT通路中的作用Tab. 1 Role of each element in the JAK/STAT pathway in crustaceans

1 細(xì)胞因子受體(Dome)的結(jié)構(gòu)及其在蝦蟹中的表達(dá)和作用

果蠅細(xì)胞因子受體Dome(DoDome)是首次在無脊椎動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子受體,有研究表明Dome蛋白的缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡。目前已在多種甲殼動(dòng)物中鑒定到類似Dome的存在,包括中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[14]、紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)[15]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)[16]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[17]和日本囊對(duì)蝦(Marspenaeusjaponicus)[18]。

Dome屬于跨膜蛋白,含有胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3個(gè)部分。胞外區(qū)含有與細(xì)胞因子專一性結(jié)合的位點(diǎn),與特異性配體結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)變化較小,具有與酪氨酸激酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,與酪氨酸激酶結(jié)合后從而具備信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,介導(dǎo)JAK/STAT通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),參與上游JAK/STAT反應(yīng)。細(xì)胞因子受體因胞外區(qū)與配體結(jié)合的特異性位點(diǎn)的不同,被分為不同的類型。不同種類生物的Dome在結(jié)構(gòu)上也有所差異,但是功能基本相似。

MjDome(Dome inMarspenaeusjaponicus)是首個(gè)在甲殼動(dòng)物 JAK/STAT 通路中被報(bào)道的細(xì)胞因子受體,被發(fā)現(xiàn)于日本囊對(duì)蝦。MjDome與脊椎動(dòng)物Ⅰ型細(xì)胞因子受體家族中白細(xì)胞介素6(IL-6)受體的胞外區(qū)具有相似的結(jié)構(gòu):細(xì)胞因子結(jié)合(cytokine binding modules,CBM)結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞外Ⅲ型纖連蛋白(fibronectin-type-Ⅲ,FNⅢ)結(jié)構(gòu)域。研究表明,CBM結(jié)構(gòu)域參與Dome受體的激活而使下游信號(hào)順利傳導(dǎo)[38]。IL-6受體的CBM結(jié)構(gòu)域由CBMⅠ和CBMⅡ2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,CBMⅠ包含4個(gè)保守的半胱氨酸殘基,CBMⅡ包含1個(gè)五氨基酸WSXWS(Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser)基序,該保守基序廣泛存在于脊椎動(dòng)物 I 型細(xì)胞因子受體中,它作為一個(gè)分子開關(guān)控制受體的激活[39]。

研究者通過序列分析發(fā)現(xiàn)MjDome的結(jié)構(gòu)含有1個(gè)信號(hào)肽,1個(gè)CBM結(jié)構(gòu)域,5個(gè)FNⅢ結(jié)構(gòu)域和1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[19]。Yan等通過分析LvDome(Dome inLitopenaeusvannamei)的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)其具有1個(gè)信號(hào)肽、2個(gè)CBM結(jié)構(gòu)域、3個(gè)FNⅢ結(jié)構(gòu)域和1個(gè)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域[17]。有研究報(bào)道了中華絨螯蟹的Dome包含1個(gè)信號(hào)肽、5個(gè)FNⅢ結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)低復(fù)雜性區(qū)。通過多序列比對(duì),EsDome(Dome inEriocheirsinensis)的氨基酸序列與IL-6受體和昆蟲的Dome具有較大差異,但系統(tǒng)發(fā)育分析顯示EsDome屬于甲殼動(dòng)物類[14]。研究人員在紅螯螯蝦的CqDome(Dome inCheraxquadricarinatus)鑒定出1個(gè)N端信號(hào)肽、2個(gè)CBM結(jié)構(gòu)域、3個(gè)FNⅢ結(jié)構(gòu)域和1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。CqDome的CBM結(jié)構(gòu)域中,CBMⅠ包含4個(gè)保守半胱氨酸殘基,但CBMⅡ有一個(gè)不完整的WSXWS基序[15]。Laohawutthichai等發(fā)現(xiàn)斑節(jié)對(duì)蝦的Dome(PmDome)包含1個(gè)信號(hào)肽、1個(gè)CBM結(jié)構(gòu)域、4個(gè)FNⅢ結(jié)構(gòu)域和1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[16]。以上甲殼類動(dòng)物Dome經(jīng)氨基酸序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析后,均被歸為同一組,它們的結(jié)構(gòu)與IL-6受體相比,均沒有完整的WSXWS基序,并且FNⅢ結(jié)構(gòu)域的數(shù)量也有差異,但共同包含4個(gè)保守的半胱氨酸殘基及FNⅢ結(jié)構(gòu)域,所以推測(cè)甲殼動(dòng)物與哺乳動(dòng)物的Dome具有相似的功能。值得注意的是,不同生物的Dome中FNⅢ的數(shù)量可能不一致,FNⅢ結(jié)構(gòu)域廣泛存在于細(xì)胞因子受體中,參與蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定與功能調(diào)控[40],但FNⅢ的數(shù)量對(duì)Dome功能的影響還暫未報(bào)道,需進(jìn)一步研究。

在甲殼動(dòng)物中,Dome廣泛分布于血細(xì)胞、心臟、肝胰腺、鰓、腸等通常與機(jī)體的免疫功能相關(guān)的組織或器官中,但不同物種的Dome在不同器官或組織內(nèi)的表達(dá)量具有差異。研究人員對(duì)Dome在蝦蟹不同組織中進(jìn)行表達(dá)研究發(fā)現(xiàn),Dome在日本囊對(duì)蝦的心臟中表達(dá)水平較高,在血細(xì)胞和肝胰腺中表達(dá)水平較低[18]。相反的是,紅螯螯蝦的CqDome在血細(xì)胞中表達(dá)水平最高[15],血細(xì)胞在甲殼動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,Dome在血細(xì)胞中的高表達(dá)量可能有利于紅螯螯蝦對(duì)抗病原的免疫反應(yīng)。凡納濱對(duì)蝦Dome在血細(xì)胞、心臟、肝胰腺、鰓、腸中均有表達(dá)外,在肌肉和眼柄中表達(dá)水平較高[17],據(jù)報(bào)道,IL-6受體也在人類的肌肉中廣泛表達(dá)。中華絨螯蟹的Dome在鰓、血細(xì)胞、肌肉、心臟、腸、肝胰腺和胃中均有表達(dá),且表達(dá)量依次降低[14]。在斑節(jié)對(duì)蝦中,研究人員發(fā)現(xiàn)PmDome在淋巴組織中表達(dá)量最高,在肝胰腺中表達(dá)量最低,淋巴組織是病原入侵對(duì)蝦后免疫功能發(fā)揮作用的主要組織。了解甲殼動(dòng)物體內(nèi)Dome的分布有助于我們更好的了解其在先天免疫中的作用,這些組織或器官都與甲殼動(dòng)物的免疫功能相關(guān),并且Dome分布廣泛,可能在病原入侵時(shí)能更快地將細(xì)胞外信號(hào)傳入細(xì)胞核。

Dome已被證實(shí)參與JAK/STAT信號(hào)通路的激活,并且與病毒的復(fù)制有關(guān),但是抗菌機(jī)制還有待研究。研究者發(fā)現(xiàn)LvDome可以作為一種受體激活JAK/STAT通路,WSSV可能誘導(dǎo)LvDome的表達(dá),增強(qiáng)對(duì)蝦 JAK/STAT 通路的激活。LvDome過表達(dá)會(huì)顯著增強(qiáng)WSSV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄,而敲降LvDome后WSSV在蝦中的增殖得到了抑制,降低了蝦的累積死亡率,表明LvDome可能被WSSV影響以利于病毒復(fù)制[17]。前人研究也發(fā)現(xiàn)紅鰲鰲蝦的CqDome基因沉默顯著抑制了WSSV的復(fù)制,這意味著WSSV可以利用CqDome進(jìn)行復(fù)制,并且CqDome參與了紅螯鰲蝦JAK/STAT通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15],這一研究結(jié)果與凡納濱對(duì)蝦的LvDome研究結(jié)果一致。在斑節(jié)對(duì)蝦的血細(xì)胞中,WSSV感染使PmDome表達(dá)上調(diào),沉默PmDome會(huì)對(duì)對(duì)蝦體內(nèi)免疫相關(guān)基因的表達(dá)有顯著影響,而且降低了WSSV的拷貝數(shù),延緩了由WSSV引起的累積死亡率。在對(duì)日本囊對(duì)蝦的研究中發(fā)現(xiàn)MjDome可以與C型凝集素(MjCC-CL)卷曲結(jié)構(gòu)域結(jié)合,直接激活日本囊對(duì)蝦JAK/STAT信號(hào)通路從而對(duì)細(xì)菌入侵做出免疫應(yīng)答[18]。研究還發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌入侵時(shí),敲低中華絨螯蟹血細(xì)胞中EsDome后會(huì)影響部分抗菌肽的表達(dá),它提示EsDome激活了JAK/STAT信號(hào)通路以及參與了調(diào)控抗菌肽的表達(dá)。但是細(xì)菌是以直接方式還是間接方式激活EsDome還不清楚[14]。

雖然蝦蟹的種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止這些,但是上述研究結(jié)果為Dome介導(dǎo)并激活JAK/STAT通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活提供了強(qiáng)有力的證據(jù),也為其他甲殼動(dòng)物中Dome的研究提供了參考。

2 JAK酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)及其在蝦蟹中的表達(dá)和作用

JAK是一種細(xì)胞內(nèi)的非受體酪氨酸激酶,是細(xì)胞因子受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)銜接的信號(hào)分子家族。JAK家族是不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵組成部分,在細(xì)胞的生存、增殖、分化、發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和抵抗病原方面起著重要作用[41]。目前在哺乳動(dòng)物中報(bào)道JAK有4個(gè)亞型,分別是JAK1、JAK2、JAK3和TYK2(tyrosine kinase 2)。此外JAK有7個(gè)同源結(jié)構(gòu)域,分別是JH1—JH7[42]。據(jù)報(bào)道在果蠅中也發(fā)現(xiàn)了一種類似JAK功能的酪氨酸激酶Hopscotch(Hop),與哺乳動(dòng)物的JAK2亞型同源性最高[43]。

在甲殼動(dòng)物中,已在鹵蟲(Artemiafranciscan)、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)、凡納濱對(duì)蝦和中華絨螯蟹中鑒定到JAK激酶,但是不同甲殼動(dòng)物的JAK都是獨(dú)特的。JAK激酶通常含有一個(gè)FERM結(jié)構(gòu)域、一個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域、一個(gè)假激酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)TyrKc結(jié)構(gòu)域[44]。其中FERM結(jié)構(gòu)域與SH2結(jié)構(gòu)域參與JAK與細(xì)胞因子受體的結(jié)合[45];假激酶結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為對(duì)調(diào)節(jié)TyrKc結(jié)構(gòu)域的活性至關(guān)重要[46];TyrKc結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)細(xì)胞因子受體和下游分子上酪氨酸殘基的磷酸化[14]。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析表明,鹵蟲的AfJAK (JAK inArtemiafranciscan)、擬穴青蟹的SpJAK(JAK inScyllaparamamosain)與凡納濱對(duì)蝦的LvJAK(JAK inLitopenaeusvannamei)結(jié)構(gòu)相似,從N端到C端都包含一個(gè)FERM結(jié)構(gòu)域、一個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)TyrKc結(jié)構(gòu)域。SpJAK、LvJAK和果蠅JAK具有較高的相似性,提示JAK蛋白在進(jìn)化過程中較為保守,可能具有動(dòng)物間相似的功能[19-20]。而中華絨螯蟹的EsJAK(JAK inEriocheirsinensis)除了包含一個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)TyrKc結(jié)構(gòu)域外,還包含了一個(gè)Band 4.1同源結(jié)構(gòu),已知這些特異性酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)并起到重要作用[14, 47]。

不同甲殼類JAK在不同的組織中表達(dá),并廣泛分布于免疫器官或組織中。其中,SpJAK在腦、神經(jīng)和腸道中均呈現(xiàn)高表達(dá),在鰓、胃、眼柄、肝胰腺、心臟和血細(xì)胞等大部分檢測(cè)組織中中度表達(dá);在肌肉中的表達(dá)水平最低[19]。EsJAK在多種組織中均有表達(dá),包括在鰓、腸、肝胰腺和心臟中表達(dá)。其中在肝胰腺中表達(dá)水平最高,在血細(xì)胞中表達(dá)最低[14]。LvJAK在鰓、血細(xì)胞、肝胰腺和腸中也均有表達(dá)。這些組織均為免疫組織,推測(cè)可能與免疫有聯(lián)系[29]。

甲殼動(dòng)物的JAK激酶參與了JAK/STAT信號(hào)通路的抗菌和抗病毒反應(yīng)。AfJAK能夠以劑量依賴的方式激活昆蟲Sf細(xì)胞中D-raf原癌基因的啟動(dòng)子活性,這與果蠅 STAT 在免疫應(yīng)答過程中激活D-Raf 原癌基因的結(jié)論一致,推測(cè)AfJAK可能參與MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控[21]。SpJAK可以通過促進(jìn)STAT作用于其 DNA結(jié)合基序,增強(qiáng)WSSV wsv069基因啟動(dòng)子的活性。這些結(jié)果表明SpJAK可以激活JAK/STAT通路。此外,在體內(nèi)沉默SpJAK可導(dǎo)致呼腸孤病毒(MCRV)感染的擬穴青蟹死亡率增高,并且使其病毒載量增高,推測(cè)SpJAK可能在MCRV防御中發(fā)揮重要作用[19]。LvJAK是JAK/STAT通路的靶基因,可作為正調(diào)控因子形成正反饋回路。此外,沉默LvJAK可導(dǎo)致更高的死亡率和病毒載量,提示LvJAK可能在WSSV的防御中發(fā)揮重要作用。其結(jié)果為JAK蛋白介導(dǎo)的正反饋回路在無脊椎動(dòng)物中存在提供了證據(jù)[20]。

3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)及其在蝦蟹中的表達(dá)和作用

STAT家族是JAK/STAT信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分,具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活的雙重功能,當(dāng)細(xì)胞外受到刺激時(shí)會(huì)被激活從而控制基因的表達(dá)[41]。在無脊椎動(dòng)物中,STAT參與多種生物過程中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控,可能涉及廣泛的發(fā)育階段以及組織分布[22,32]。目前在哺乳動(dòng)物中已確定STAT家族有STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A/5B和STAT6七個(gè)主要成員[48]。但在甲殼動(dòng)物中STAT僅僅發(fā)現(xiàn)一種,與哺乳動(dòng)物的STAT5具有較高的同源性。已有研究表明在節(jié)肢動(dòng)物和昆蟲中JAK/STAT途徑在機(jī)體抗病毒免疫中具有一定的作用[49]。

STAT蛋白通常由STAT相互作用結(jié)構(gòu)域、STAT all-alpha/beta結(jié)構(gòu)域、STAT DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和SH2結(jié)構(gòu)域組成[14]。其中STAT相互作用結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為促進(jìn)了STAT-STAT二聚體的形成;STAT all-alpha/beta結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為有助于STAT-STAT二聚體進(jìn)入細(xì)胞核;STAT DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有類似于p53腫瘤抑制蛋白的免疫球蛋白樣折疊功能;SH2結(jié)構(gòu)域作為磷酸化依賴的開關(guān)從而控制受體識(shí)別和DNA結(jié)合[50-51]。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)EsSTAT包含一個(gè)STAT相互作用結(jié)構(gòu)域、一個(gè)STAT all-alpha結(jié)構(gòu)域、一個(gè)STAT DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域[14]。斑節(jié)對(duì)蝦的PmSTAT具有DNA結(jié)合域、SH2域和C末端反式激活域[23]。

凡納濱對(duì)蝦的LvSTAT(STAT inLitopenaeusvannamei)基因含有N-末端結(jié)構(gòu)域、螺旋結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域和SH2結(jié)構(gòu)域[24]。中國明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)的FcSTAT(STAT inFenneropenaeuschinensis),包含蛋白質(zhì)相互作用域、全α螺旋結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域、SH2結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域[22]?？耸显r(Procambarusclarkii)中克隆了3個(gè)STAT亞型cDNA,結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析表明PcSTATs的三個(gè)亞型都包含了一個(gè)STAT相互作用域、一個(gè)STAT全α域、一個(gè)DNA結(jié)合域和一個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域[25]。日本囊對(duì)蝦的蛋白包含STAT相互作用域、STAT all-alpha結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域和SH2結(jié)構(gòu)域[26]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,擬穴青蟹的SpSTAT(STAT inScyllaparamamosain)、中華絨螯蟹的EsSTAT(STAT inEriocheirsinensis)、凡納濱對(duì)蝦的LvSTAT、中國明對(duì)蝦的FcSTAT蛋白聚在一支,并且與人的STAT5較為密切[14]。上述幾種甲殼類動(dòng)物STAT有類似的結(jié)構(gòu),并且系統(tǒng)進(jìn)化樹分析同源性較高,表明STAT蛋白在進(jìn)化過程中具有保守性,可能具有相似的功能。LvSTAT 在血細(xì)胞、肝胰腺中高表達(dá)[24]。EsSTAT在鰓、肝胰腺和血細(xì)胞等組織中均高表達(dá)[14];MjSTAT(STAT inMarspenaeusjaponicus)在肌肉、胃、腦和鰓組織中表達(dá)[26]。可見STAT在不同動(dòng)物不同組織的表達(dá)水平并不一致。

有研究表明WSV181可以通過控制STAT92E表達(dá)來抑制JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo),對(duì)感染了果蠅C病毒的轉(zhuǎn)基因果蠅以及注射重組WSV181和WSSV的凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行了感染實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示病毒載量增加且JAK/STAT途經(jīng)的組分轉(zhuǎn)錄水平降低,表明WSV181可通過抑制JAK/STAT途徑促進(jìn)病毒增殖[52]。前人研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)凡納濱對(duì)蝦被WSSV感染時(shí),WSSV并不破壞JAK/STAT通路,相反可以激活STAT使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中從而促進(jìn)WSSVIe1基因的表達(dá)[23]。凡納濱對(duì)蝦在WSSV刺激下STAT能夠發(fā)生磷酸化,并且STAT 磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞,調(diào)控效應(yīng)分子的表達(dá)[53]。在WSSV感染晚期STAT蛋白會(huì)由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核,為了合成更多的STAT蛋白,STAT轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)以此來補(bǔ)充細(xì)胞質(zhì)中減少的STAT蛋白量[54]。EsSTAT蛋白的抑制僅影響JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo),因?yàn)镋sSTAT處于JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)下游即末端的位置,JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)的激活可以導(dǎo)致EsSTAT磷酸化,進(jìn)而使磷酸化后的EsSTAT從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核[14]。在對(duì)中國明對(duì)蝦的研究發(fā)現(xiàn),STAT被WSSV誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[22]。MjSTAT的磷酸化過程能夠被SOCS2抑制。當(dāng)SOCS2被干擾后,對(duì)蝦對(duì)細(xì)菌的清除能力增強(qiáng),對(duì)蝦的死亡率減少[8]。STAT在JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)的下游發(fā)揮作用,多位研究者已經(jīng)證實(shí)STAT在WSSV感染時(shí)可以發(fā)生磷酸化并且形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)。這些研究都為進(jìn)一步了解甲殼動(dòng)物的天然免疫應(yīng)答提供了基礎(chǔ),有助于對(duì)甲殼動(dòng)物的JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)全面而具體的認(rèn)識(shí)。

4 負(fù)調(diào)控因子的結(jié)構(gòu)及其在蝦蟹中的表達(dá)和作用

先天免疫是抵御病原體入侵的第一道防線。細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞間的交流,在適當(dāng)程度下調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)是非常重要作用的。然而,先天免疫的激活必須嚴(yán)格控制,以避免過度的免疫反應(yīng)而造成不良影響。因此細(xì)胞因子受體信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)控就顯得尤為重要[55]。JAK/STAT正調(diào)控元件和負(fù)調(diào)控元件共同參與信號(hào)通路的調(diào)控已被證實(shí)[8]。介導(dǎo)JAK/STAT 信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子分別是:細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子(SOCS)蛋白家族,蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)和活化STAT蛋白抑制因子(PIAS)。除了這些調(diào)控蛋白之外,多功能支架蛋白β-arrestin1與細(xì)胞因子TC45也參JAK/STAT途徑的調(diào)控。

4.1 細(xì)胞因子信號(hào)通路抑制因子(SOCS)

細(xì)胞因子信號(hào)通路抑制因子(SOCS)是反式調(diào)控元件的一種,受JAK/STAT信號(hào)通路調(diào)控表達(dá),且能抑制該信號(hào)通路,具有負(fù)調(diào)控作用,但已有部分研究證明了SOCS分子在細(xì)胞因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的正向調(diào)控作用[56]。SOCS包含8個(gè)家族成員,分為2個(gè)亞家族,分別被命名為Ⅰ型 (SOCS4—SOCS7) 和Ⅱ型 (CIS和SOCS1—SOCS3)[57],有研究表明在魚類中已鑒定到SOCS家族的新成員[58]。SOCS主要通過兩種方式調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路,一是通過SH2結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合JAK激酶上磷酸化的酪氨酸殘基來抑制激酶活性[59],二是通過募集泛素連接酶形成復(fù)合體,并通過泛素化途徑降解標(biāo)記的靶基因[60]。

SOCS家族通常具有相似的結(jié)構(gòu),氨基端的N區(qū),中間的SH2結(jié)構(gòu)域和羧基端的SOCS-box。氨基端的N區(qū)為一段長(zhǎng)度和核苷酸序列高度可變的可變區(qū);SH2結(jié)構(gòu)域能識(shí)別JAK激酶上磷酸化的酪氨酸殘基,參與信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo);羧基端的SOCS-box具有較高的保守性,作為底物蛋白識(shí)別模塊,參與蛋白酶對(duì)底物蛋白的泛素化和后續(xù)的降解[61-62]。

目前已在中華絨螯蟹、日本囊對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦和克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[27]體內(nèi)鑒定出SOCS,屬于SOCS2或SOCS6家族,不同物種SOCS中SH2結(jié)構(gòu)域與SOCS-box的氨基酸序列是保守的。在中華絨螯蟹的EsSOCS2(SOCS2 inEriocheirsinensis)中預(yù)測(cè)了ESS結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域和SOCS-box。氨基端延伸的N-ESS結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是SOCS的特異性元件,它在SOCS2和CIS中作為結(jié)構(gòu)子域連接著SH2結(jié)構(gòu)域和SOCS-box[63],SH2結(jié)構(gòu)域中包含一個(gè)酪氨酸磷酸化(Tyrosine phosphorylation, pY)位點(diǎn)(Arg230, Asp231和Ser232)。日本囊對(duì)蝦的MjSOCS(SOCS inMarspenaeusjaponicus)、凡納濱對(duì)蝦的LvSOCS2(SOCS2 inLitopenaeusvannamei)和克氏原螯蝦的PcSOCS2(SOCS2 inProcambarusclarkii)蛋白結(jié)構(gòu)中均具有SH2結(jié)構(gòu)域和SOCS-box這兩個(gè)典型結(jié)構(gòu)域,并且MjSOCS與EsSOCS2、LvSOCS2、PcSOCS2分別具有56.2%、90.0%和57.0%的同源性,均屬于SOCS2家族。在中華絨螯蟹的EsSOCS6(SOCS6 inEriocheirsinensis)也包含SH2結(jié)構(gòu)域和 SOCS-box結(jié)構(gòu)域,并在其氨基端結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)長(zhǎng)的可變區(qū),經(jīng)鑒定后屬于SOCS6家族[28]。

SOCS在不同甲殼動(dòng)物的組織分布情況和各組織中的表達(dá)量差異印證了SOCS具有多種功能。EsSOCS2在肝胰腺、鰓、肌肉、心臟和性腺中表達(dá)量較高,在血細(xì)胞中表達(dá)量較低[29];EsSOCS6在肝胰腺和鰓中高表達(dá),在造血組織中表達(dá)量相對(duì)較低;MjSOCS在心臟、鰓、腸道和淋巴器官中高表達(dá),在血細(xì)胞、胃和肝胰腺中表達(dá)量很低;Wang等發(fā)現(xiàn)LvSOCS2在凡納濱對(duì)蝦的鰓、腸和上皮組織中高表達(dá),在心臟和神經(jīng)的表達(dá)量為中等,在肝胰腺、幽門盲腸和血細(xì)胞中表達(dá)量較低。但另一研究結(jié)果表明,LvSOCS2在對(duì)蝦的血細(xì)胞、腸道和肝胰腺中高表達(dá),在鰓中表達(dá)量極低,心臟中幾乎不表達(dá)。LvSOCS2在神經(jīng)組織中的表達(dá)表明了它可能參與了神經(jīng)元組織的分化[30]。PcSOCS2在心臟和肌肉中表達(dá)水平最高,在肝胰腺中呈低表達(dá)水平。

SOCS家族在協(xié)調(diào)細(xì)胞對(duì)多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,通過針對(duì)受體復(fù)合物調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)以防止過度信號(hào)傳遞并恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)[64-66]。但目前關(guān)于SOCS參與甲殼動(dòng)物免疫防御反應(yīng)的報(bào)道較少。研究發(fā)現(xiàn)鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)和藤黃微球菌(Micrococcusluteus)刺激中華絨螯蟹后,血淋巴細(xì)胞內(nèi)的EsSOCS2表達(dá)量升高,表明EsSOCS2可能在抗細(xì)菌感染中起重要作用[29]。此外,EsSOCS2被報(bào)道中在中華絨螯蟹中具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的功能[67]。研究人員還發(fā)現(xiàn)EsSOCS6可能通過調(diào)節(jié) NF-κB 信號(hào)通路在對(duì)病毒和細(xì)菌的免疫應(yīng)答中發(fā)揮綜合作用。在日本囊對(duì)蝦中發(fā)現(xiàn)了MjSOCS2,其表達(dá)量可受脂多糖、肽聚糖和聚肌胞苷酸影響,表明MjSOCS與對(duì)蝦的先天免疫有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn),MjSOCS2能夠抑制磷酸化的MjSTAT[31]。在凡納濱對(duì)蝦中,LvSOCS2能夠呈濃度依賴性抑制由LvJAK誘導(dǎo)的DmVir-1啟動(dòng)子表達(dá)量上調(diào),這些結(jié)果提示LvSOCS2是 JAK/STAT 通路的負(fù)調(diào)控因子。此外,敲除LvSOCS后,WSSV感染凡納濱對(duì)蝦的死亡率降低,說明敲除LvSOCS2能增強(qiáng)凡納濱蝦對(duì)WSSV的抗性[30]。研究人員發(fā)現(xiàn)在克氏原螯蝦中可能存在20-hydroxyecdysone/SOCS2/ERK通路,而PcSOCS2是該信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子[27]。

4.2 活化STAT蛋白抑制劑(PIAS)

活化STAT蛋白抑制劑(PIAS)蛋白家族通常作為負(fù)調(diào)控因子參與JAK/STAT信號(hào)通路的調(diào)控,是該信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑和轉(zhuǎn)錄激活劑[68-69]。哺乳動(dòng)物的PIAS蛋白家族有4個(gè)成員PIAS1、PIAS3、PIASx(PIAS2)和PIASy(PIAS4)。PIAS家族具有廣泛的功能,參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答等重要生物學(xué)過程[70-71]。在JAK/STAT信號(hào)通路中,PIAS與二聚化的STAT結(jié)合阻止STAT核易位,阻斷活化的STAT的DNA結(jié)合活性來抑制STAT誘導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄的能力[72-73]。

PIAS蛋白家族高度保守,具有共同的結(jié)構(gòu)特征: 氨基端的SAP結(jié)構(gòu)域、PINIT結(jié)構(gòu)域、RLD結(jié)構(gòu)域,以及羧基端的一個(gè)富含酸性氨基酸的結(jié)構(gòu)域(AD)和富含絲氨酸跟蘇氨酸的結(jié)構(gòu)域(S/T-rich結(jié)構(gòu)域)。SAP結(jié)構(gòu)域參與序列特異性DNA或結(jié)構(gòu)特異性 DNA結(jié)合[74];PINIT結(jié)構(gòu)域參與了PIAS的核定位[75];RLD結(jié)構(gòu)域參與PIAS蛋白的 SUMO-E3連接酶的激活,并且可能參與PIAS與其他蛋白的相互作用[76];在 AD中存在一個(gè)推測(cè)的 SUMO1相互作用基序(SIM)[77]。C末端的S/T-rich結(jié)構(gòu)域最不保守,其功能還有待研究。

目前在甲殼動(dòng)物中僅有一種PIAS被發(fā)現(xiàn),已在擬穴青蟹、日本囊對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦中被報(bào)道[32-34]。SpPIAS(PIAS inScyllaparamamosain)、MjPIAS(PIAS inMarspenaeusjaponicus)和LvPIAS(PIAS inLitopenaeusvannamei)均有相似的結(jié)構(gòu)域特征,均包含SAP結(jié)構(gòu)域,PINIT結(jié)構(gòu)域,RLD結(jié)構(gòu)域和S/T-rich結(jié)構(gòu)域。

日本囊對(duì)蝦的MjPIAS在血細(xì)胞和肝胰腺高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),MjPIAS通過抑制STAT的磷酸化與核易位來負(fù)向調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路對(duì)抗菌肽基因的表達(dá)來抑制日本囊對(duì)蝦的抗菌能力[34]。凡納濱對(duì)蝦的PIAS(LvPIAS)在肌肉中表達(dá)量最豐富,其表達(dá)水平受細(xì)菌和病毒刺激后均有不同程度的顯著變化應(yīng)答。LvSTAT與LvPIAS之間存在負(fù)反饋環(huán),LvSTAT誘導(dǎo)LvPIAS,LvPIAS抑制LvSTAT對(duì)LvPIAS啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性[33]。

4.3 多功能支架蛋白(βarrs)

βarrs(β-arrestins)是多功能支架蛋白,參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞表面受體的脫敏和內(nèi)吞作用[78-79]。哺乳動(dòng)物中,有研究表明在IFN-γ治療后,核βarr1直接與細(xì)胞核中的STAT1相互作用,招募TC45加速STAT1去磷酸化[80];另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)GdX(位于Xq28 G6PD簇中的X連鎖基因,也稱為Ubl4A,泛素樣蛋白4A)能夠介導(dǎo)TC45和STAT3之間相互作用,促進(jìn)STAT3去磷酸化[81]。在對(duì)蝦中,有兩個(gè)βarr(βarr 1和2)[35]和1個(gè)TC45。

在細(xì)菌感染后,STAT磷酸化增加,隨后其易位到細(xì)胞核中以誘導(dǎo)蝦血細(xì)胞中AMP的表達(dá)。βarrs和TC45加速了鰻弧菌(Vibrioanguillarum)攻擊對(duì)蝦STAT的去磷酸化,這些結(jié)果表明βarr1作為支架蛋白在TC45和STAT之間起橋梁作用,它加速了STAT在細(xì)胞核中的去磷酸化抑制了鰻弧菌感染對(duì)蝦中AMP的表達(dá)[36]。

4.4 蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)

蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase,PTPs)是JAK/STAT信號(hào)通路中的STAT負(fù)調(diào)控因子,目前已知有超過130種PTPs被發(fā)現(xiàn),PTPs能使細(xì)胞質(zhì)中JAK激酶上磷酸化的酪氨酸殘基去磷酸化或使細(xì)胞核中的STAT去磷酸化來調(diào)控STAT的活性[81]。目前在甲殼動(dòng)物中,PTPs的研究較少,僅發(fā)現(xiàn)了日本囊對(duì)蝦的TC45 (45-kDa form of TC-PTP)和凡納濱對(duì)蝦的LvPTPN6。日本囊對(duì)蝦的TC45包含一個(gè)活化區(qū)和一個(gè)位于C-端非活化區(qū)的核定位信號(hào)[36];凡納濱對(duì)蝦的LvPTPN6包含兩個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域和蛋白酪氨酸磷酸酶催化(PTPc)結(jié)構(gòu)域[37]。

PTPs在甲殼動(dòng)物體內(nèi)呈組織性分布。TC45在凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞、心臟、肝胰、鰓、胃和腸中均有表達(dá)[36];LvPTPN6在神經(jīng)、肌肉和腸道中表達(dá)量最高,在心臟、肝胰腺中表達(dá)量偏低[37]。

研究者干擾日本囊對(duì)蝦的TC45基因后,使用細(xì)菌刺激日本囊對(duì)蝦,發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦體內(nèi)STAT磷酸化水平升高,說明TC45通過對(duì)STAT去磷酸化負(fù)調(diào)控了JAK/STAT信號(hào)通路的抗細(xì)菌免疫[36]。在凡納濱對(duì)蝦中,LvPTPN6的表達(dá)受到干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)的調(diào)控,IRF可以直接與LvPTPN6的啟動(dòng)子結(jié)合。值得注意的是,與典型的PTPs功能相反,LvPTPN6可以促進(jìn) STAT 的二聚化及核定位,這進(jìn)一步提高了 STAT 靶向的免疫效應(yīng)基因的表達(dá),并增強(qiáng)了蝦的抗病毒免疫[37]。

5 總結(jié)與展望

甲殼動(dòng)物JAK/STAT信號(hào)通路與先天免疫系統(tǒng)相關(guān),并在應(yīng)對(duì)病原感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用。各種細(xì)胞因子通過JAK/STAT信號(hào)通路參與介導(dǎo)機(jī)體各種生理病理反應(yīng)。在正常情況下,各種細(xì)胞因子能通過JAK/STAT信號(hào)通路介導(dǎo)的抵抗病原感染。反之,則會(huì)導(dǎo)致病原,特別是病毒可以利用該通路感染宿主。

病毒性疾病是水產(chǎn)殖業(yè)發(fā)展的主要威脅,應(yīng)用抗生素的傳統(tǒng)治療方法可以緩解疾病的發(fā)展,但抗生素的過度使用會(huì)導(dǎo)致機(jī)體耐藥和新疾病的發(fā)生。因此,蝦蟹養(yǎng)殖疾病防控策略的提出、先天免疫方面的研究顯得尤為重要。這里提出幾個(gè)未來研究的方向以供參考:

(1)目前關(guān)于JAK/STAT信號(hào)通路的研究大都集中在組成元件的鑒定、組成元件參與白斑綜合征病毒感染的機(jī)制研究方面。對(duì)各組成元件具體的監(jiān)管機(jī)制以及各元件之間的相互作用仍需要進(jìn)一步探索。

(2)通路上主要元件的報(bào)道主要集中在STAT上,而關(guān)于JAK和Dome的相關(guān)報(bào)道則有限;關(guān)于通路與病毒感染機(jī)制的研究主要集中在白斑綜合征病毒方面,關(guān)于其他病毒感染、病原菌侵染的研究鮮有報(bào)道。而對(duì)于養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物危害比較大的疾病比如十足虹彩病毒病, 傳染性皮下和造血組織壞死病、急性肝胰腺壞死病等,這幾種疾病尚無有效的治療方法,死亡率非常高。因此對(duì)這些疾病的感染機(jī)制的研究,尤其是對(duì)其在JAK/STAT通路上的各元件對(duì)通路的影響機(jī)制的研究顯得十分迫切。以期做好疾病的防控工作,把生產(chǎn)實(shí)際的損失降至最低。

總而言之,JAK/STAT通路之間的分子機(jī)制尚未被完全闡明,在通路特征及功能的研究方面還需更進(jìn)一步深入研究。深入研究JAK/STAT通路上已經(jīng)鑒定出來的對(duì)病原感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)的相關(guān)基因和蛋白的功能,為蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)提供必要的疾病防控理論依據(jù)的同時(shí),也為蝦蟹疾病防控提出有效的解決方法。