孫欣然,田思成,馬艷龍,馮飛,張榮

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海市重大傳染病與生物安全研究院,上海 200032

甲病毒屬于披膜病毒科,其基因組為單股正鏈RNA,主要通過節(jié)肢動(dòng)物傳播,可以感染多種包括人類在內(nèi)的脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物。甲病毒可分為舊世界甲病毒和新世界甲病毒兩類。舊世界甲病毒包括基孔肯亞病毒 (Chikungunya virus, CHIKV)、馬雅羅病毒(Mayaro virus, MAYV)、阿良良病毒(O’nyong-nyong virus, ONNV)、羅斯河病毒(Ross river virus, RRV)、辛德畢斯病毒(Sindbis virus, SINV) 和塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus, SFV)等,主要導(dǎo)致流行性急性和慢性關(guān)節(jié)炎;新世界甲病毒包括東方馬腦炎病毒(eastern equine encephalitis virus, EEEV)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV)和西方馬腦炎病毒(western equine encephalitis virus, WEEV),通過地方性周期性傳播,可感染大腦中的神經(jīng)元細(xì)胞,導(dǎo)致腦炎甚至死亡[1]。甲病毒基因組全長約12 kb,具有5’帽和3’多聚腺苷酸尾,包含2個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF),分別編碼4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein,nsp)nsp1～nsp4和5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C,E3,E2,6K,E1)[2]。甲病毒入侵靶細(xì)胞第一步是通過與靶細(xì)胞表面黏附因子結(jié)合進(jìn)而與特異性受體相互作用來實(shí)現(xiàn)的[3]。已有文獻(xiàn)報(bào)道了甲病毒相關(guān)的黏附因子和特異性受體,包括C型凝集素(C-type lectin)[4]、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)[5-6]、Mxra8 (matrix remodeling associated 8)[7]、低密度脂蛋白受體A類結(jié)構(gòu)域3(low density lipoprotein receptor class A domain containing 3,LDLRAD3)[8]、極低密度脂蛋白受體(very low density lipoprotein receptor,VLDLR)[9]等。目前,仍有一些致關(guān)節(jié)炎甲病毒(如CHIKV)在全世界范圍內(nèi)傳播。盡管甲病毒存在傳播流行的風(fēng)險(xiǎn),但由于某些甲病毒(如CHIKV、VEEV等)需要在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室甚至安全等級(jí)更高的實(shí)驗(yàn)室開展研究,極大阻礙了該領(lǐng)域的發(fā)展。此外,目前沒有針對(duì)甲病毒的特異性抗病毒藥物和疫苗被獲批用于臨床治療。

假病毒具有可操作性強(qiáng)、生物風(fēng)險(xiǎn)低、檢測(cè)方便、靈敏度高等優(yōu)勢(shì),故被廣泛應(yīng)用于高致病性病毒的研究,如冠狀病毒[10-11]、埃博拉病毒[12]、流感病毒[13]、CHIKV[14]、漢坦病毒[15]等。假病毒可以模擬活病毒感染的入胞過程[16],也可以測(cè)量與活病毒相關(guān)抗體的效價(jià)[17-18]。本研究構(gòu)建了基于鼠白血病病毒(murine leukemia virus, MLV)基因組的假病毒系統(tǒng),通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染將編碼MLV-gag/pol及異源病毒包膜蛋白的基因?qū)爰?xì)胞表達(dá),攜帶異源病毒包膜蛋白的假病毒顆粒會(huì)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中[19-20]。此外,利用甲病毒成員基因組的兼容性,本研究還構(gòu)建了基于SINV的病毒復(fù)制子顆粒(virus replicon particle, VRP)系統(tǒng),采用報(bào)告基因如綠色熒光蛋白(green fluorescence protein, GFP)基因取代結(jié)構(gòu)蛋白基因,而編碼不同甲病毒成員結(jié)構(gòu)蛋白的基因則通過反式互補(bǔ)表達(dá),輔助包裝出具備單輪感染特性的VRP。通過對(duì)甲病毒入侵感染相關(guān)的宿主因子如HS和受體Mxra8進(jìn)行驗(yàn)證,來說明假病毒和VRP能夠反映活病毒的入胞特征,從而為研究甲病毒家族成員的入侵感染機(jī)制和抗病毒策略等提供安全可靠的實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和感受態(tài)細(xì)胞293T細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、MEF細(xì)胞、MEFB3gat3(beta-1, 3-glucuronyltransferase 3)敲除細(xì)胞、MEFMxra8敲除細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存,大腸埃希菌Stbl3感受態(tài)細(xì)胞購自Thermo公司。

1.1.2 質(zhì)粒pCAGGS載體質(zhì)粒、pSINV、pCAGGS-Capsid、MLV-gag/pol和pMIG-GFP均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試劑本研究所用試劑包括AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen,AP-GX-250)、NucleoSpin Plasmid Mini kit (MN,740588.250)、MUL Assembly Cloning Kit(朗晶生物,PT008-200)、Polybrene(Sigma,TR-1003-G)、NEBNext Ultra II Q5 Master Mix(NEB,M0544L)、XhoI(NEB,R0146S)、EcoRI(NEB,R3101S)、EZ-Trans轉(zhuǎn)染試劑(李記生物,AC04L092)。

1.2 方法

1.2.1 甲病毒包膜蛋白編碼序列的合成根據(jù)GenBank公布的甲病毒成員序列,將以下病毒的包膜蛋白(E3-E2-6K-E1)基因交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成:SINV(U38305.1)、CHIKV-AF(EF452493.1)、CHIKV-LR(KY575571.1)、CHIKV-181/25(MT635337.1)、VEEV(L01442.2)、WEEV(KJ554983.1)和EEEV(AY705241.1)。

1.2.2 甲病毒包膜蛋白序列的擴(kuò)增使用SnapGene軟件設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)引物,以合成的包膜蛋白序列為模板,對(duì)甲病毒包膜蛋白序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。

1.2.3 重組質(zhì)粒pCAGGS-env的構(gòu)建與鑒定利用XhoI和EcoRI對(duì)pCAGGS載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,獲得線性化質(zhì)粒載體。通過MUL Assembly Cloning Kit將PCR產(chǎn)物分別和pCAGGS線性化載體片段進(jìn)行無縫連接,獲得包含甲病毒包膜蛋白的質(zhì)粒pC-env-SINV、pC-env-CHIKV-AF、pC-env-CHIKV-LR、pC-env-CHIKV-181/25、pC-env-VEEV、pC-env-WEEV和pC-env-EEEV。對(duì)獲得的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,將鑒定結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 病毒顆粒的包裝將處于對(duì)數(shù)生長期的293T細(xì)胞鋪于12孔板中,24 h后,在細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。

假病毒顆粒包裝:每孔加入的質(zhì)?？偭繛?.37 μg,各質(zhì)粒比例為pC-env∶MLV-gag/pol∶pMIG-GFP=0.74∶1∶1。按4∶1的質(zhì)量比使用EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑將各質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后收集上清液并于-80 ℃ 保存。

復(fù)制子顆粒包裝:每孔加入的質(zhì)粒總量為1 μg,各質(zhì)粒比例為pC-env∶pSINV-GFP∶pC-capsid=1∶1∶1。使用EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑按4:1的質(zhì)量比將各質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48 h收集上清液并于 -80 ℃保存。

1.2.5 感染實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞鋪于96孔板中,24 h后,在細(xì)胞密度達(dá)到90%～100%時(shí)準(zhǔn)備感染。

假病毒顆粒感染實(shí)驗(yàn):每孔加入100 μL病毒懸液(30 μL病毒+70 μL含2%胎牛血清和6 μg/mL polybrene的培養(yǎng)基)進(jìn)行感染。感染24 h后,換成新鮮的含2%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染48 h后,利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)病毒感染效率。

復(fù)制子顆粒感染實(shí)驗(yàn):每孔加入100 μL稀釋后的病毒懸液(30 μL病毒+70 μL含2%胎牛血清的培養(yǎng)基)進(jìn)行感染。感染24 h后,利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)病毒感染效率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過Graphpad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖。組間比較采用one-way ANOVA分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 含甲病毒包膜蛋白的假病毒顆粒的構(gòu)建

使用三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝假病毒,包括表達(dá)甲病毒包膜蛋白的表達(dá)質(zhì)粒(pC-env)、包裝質(zhì)粒(MLV-gag/pol)和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(pMIG-GFP),構(gòu)建策略如圖所示(見圖1A)。將三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞,48 h 后收集細(xì)胞上清液,感染BHK-21細(xì)胞,并通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP的表達(dá)(見圖1B、1C)。結(jié)果顯示,所有假病毒顆粒均能檢測(cè)到熒光蛋白的表達(dá), 表明假病毒顆粒包裝成功。

2.2 假病毒在驗(yàn)證入胞感染中的應(yīng)用

假病毒能在一定程度上模擬活病毒的入胞感染過程。因此,本研究利用假病毒感染驗(yàn)證HS和Mxra8對(duì)入胞的影響。用假病毒感染B3gat3基因敲除的MEF細(xì)胞,同時(shí)以野生型細(xì)胞做對(duì)照,發(fā)現(xiàn)所有假病毒在敲除細(xì)胞中的感染效率均顯著降低。在Mxra8基因敲除細(xì)胞中,只有包膜蛋白源自CHIKV的假病毒感染效率明顯降低(P<0.000 1),而致腦炎甲病毒成員的假病毒感染未受到影響(見圖2A、2B)。以上結(jié)果表明,HS是甲病毒入胞相關(guān)的通用宿主因子,而Mxra8是致關(guān)節(jié)炎甲病毒的特異性入胞受體,與已發(fā)表的結(jié)果一致[5-7]。因此,本研究認(rèn)為建立包裝的假病毒是研究甲病毒入侵感染過程的有效工具。

A: Fluorescence microscopy of pseudovirus infection on MEF WT cells, B3gat3 KO cells and Mxra8 KO cells. B: Flow cytometry analysis of pseudovirus infection on MEF WT cells, B3gat3 KO cells and Mxra8 KO cells, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1 compared with MEF WT group. KO: knockout.

2.3 構(gòu)建SINV VRP及VRP安全性驗(yàn)證

本研究還構(gòu)建了基于SINV基因組骨架的VRP三質(zhì)粒系統(tǒng):pSINV-GFP、pC-env和pC-Capsid,分別為26S啟動(dòng)表達(dá)GFP報(bào)告基因的SINV基因組、表達(dá)不同甲病毒成員的包膜蛋白E3-E2-6K-E1及SINV的衣殼蛋白,具體的構(gòu)建策略如圖3A所示。首先構(gòu)建了SINV VRP,即由SINV提供自身包膜蛋白。將三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24 h到48 h,可以觀察到GFP陽性細(xì)胞增多(見圖3B)。為了驗(yàn)證SINV VRP的感染性,用收集的SINV VRP感染293T細(xì)胞,可以觀察到熒光信號(hào)(見圖3C)。為了驗(yàn)證單輪感染復(fù)制子顆粒的安全性,將獲得的復(fù)制子顆粒進(jìn)行連續(xù)傳代。經(jīng)過2次傳代后,細(xì)胞均不表達(dá)GFP(見圖3D),表明安全的單輪感染復(fù)制子顆粒可以替代活病毒來研究其入侵特性等。

A: Schematic diagram of VRP construction. B: Fluorescence microscopy of three-plasmid co-transfection. C: Fluorescence microscopy of SINV VRP infection on 293T cells. D: Safety verification of SINV VRP by fluorescence microscopy. hpi: hours post infection. P1: the first passage; P2: the second passage.

2.4 構(gòu)建含不同甲病毒包膜蛋白的VRP

由于甲病毒基因組及其編碼蛋白的相似性,不同成員間具有靈活的兼容性,可以構(gòu)建含不同甲病毒包膜蛋白的嵌合VRP。因此,本研究僅通過替換表達(dá)包膜蛋白的pCAGGS-env質(zhì)粒,分別包裝了CHIKV-AF、CHIKV-181/25、EEEV、WEEV的嵌合VRP。在轉(zhuǎn)染后24 h到48 h,可以觀察到GFP陽性細(xì)胞明顯增多(見圖4A)。同時(shí),將收集的上清液感染MEF細(xì)胞,可以觀察到GFP陽性細(xì)胞(見圖4B),表明不同甲病毒成員的SINV嵌合VRP包裝成功。

A: Fluorescence microscopy of three-plasmid co-transfection. B: Fluorescence microscopy of VRP infection on MEF cells. hpi: hours post infection.

2.5 VRP在入胞感染中的應(yīng)用

因?yàn)閱屋喐腥镜腣RP可以替代活病毒成為研究入侵感染相關(guān)宿主因子的工具,本研究利用上述構(gòu)建的嵌合VRP感染驗(yàn)證HS和Mxra8對(duì)病毒入侵的影響。與之前假病毒感染結(jié)果相似,所有VRP感染效率在B3gat3基因敲除細(xì)胞中均顯著降低,而VRP感染Mxra8基因敲除細(xì)胞時(shí),只有含CHIKV包膜蛋白的VRP感染效率明顯降低,含致腦炎甲病毒EEEV和WEEV包膜蛋白的VRP感染效率沒有明顯變化(見圖5A、5B)。結(jié)果表明,HS是甲病毒入侵相關(guān)的通用宿主因子,而Mxra8只特異性地影響致關(guān)節(jié)炎甲病毒如CHIKV的入侵感染,與之前文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論一致[5-7]。

A: Fluorescence microscopy of VRP infection on MEF WT cells, B3gat3 KO cells and Mxra8 KO cells. B: Flow cytometry analysis of VRP infection on MEF WT cells, B3gat3 KO cells and Mxra8 KO cells. **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1 compared with MEF WT group. KO: knockout.

3 討論

甲病毒成員可通過節(jié)肢動(dòng)物如蚊蟲進(jìn)行傳播,威脅公共衛(wèi)生安全并具有潛在暴發(fā)流行的風(fēng)險(xiǎn)。近年來,一些社會(huì)和生態(tài)因素影響了節(jié)肢動(dòng)物的地理分布,甲病毒開始在世界范圍內(nèi)傳播和流行,并伴有較高的發(fā)病率和死亡率。目前,尚沒有具體的策略來應(yīng)對(duì)和預(yù)防甲病毒感染。甲病毒入侵靶細(xì)胞的第一步是通過病毒表面包膜糖蛋白與特異性受體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的,因此研究甲病毒的入胞機(jī)制,開發(fā)阻斷病毒入胞的抗病毒策略,具有重要意義。

盡管甲病毒成員之間具有相似性,包裝的假病毒也表達(dá)了相似的結(jié)構(gòu)蛋白,但包裝效率仍表現(xiàn)出了一定的差異。假病毒的包裝效率受多種因素的影響,不同的包裝系統(tǒng)會(huì)影響其包裝效率。常見的假病毒包裝系統(tǒng)包括MLV包裝系統(tǒng)、慢病毒載體包裝系統(tǒng)和水皰性口炎病毒包裝系統(tǒng),可以嘗試用其他假病毒包裝系統(tǒng)對(duì)MLV包裝系統(tǒng)包裝效率低的甲病毒進(jìn)行重新包裝測(cè)試;還可以通過優(yōu)化包裝系統(tǒng)中的質(zhì)粒提高假病毒的滴度,改變外源基因插入的位置或者通過強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因,使獲得的病毒滴度提高100～1 000倍[12];此外,不同的轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的比例、轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例以及轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞系選擇,也會(huì)影響假病毒包裝效率。

本研究圖2A中, MLV-EEEV、MLV-WEEV和MLV-VEEV在Mxra8敲除細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度明顯低于在MEF野生型細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度,而圖2B中統(tǒng)計(jì)分析的差異不顯著;同樣,圖5A中,VRP-EEEV和VRP-WEEV在Mxra8敲除細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度也有所降低,但圖5B中統(tǒng)計(jì)分析的差異亦不顯著。這種結(jié)果的差異可能是不同檢測(cè)手段導(dǎo)致的。熒光顯微鏡下視野選擇具有隨機(jī)性,用來觀察部分細(xì)胞的熒光表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)全部細(xì)胞的熒光表達(dá)情況,能反映整體細(xì)胞的熒光表達(dá)水平。此外,熒光顯微鏡無法辨別表達(dá)弱熒光信號(hào)的細(xì)胞;而流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)靈敏度更高,可以捕捉更多表達(dá)弱熒光信號(hào)的細(xì)胞。

目前,甲病毒復(fù)制子系統(tǒng)開發(fā)常用的甲病毒包括SINV[21]、SFV[22]和VEEV[23]。本研究在包裝SINV、CHIKV-AF和CHIKV-181/25的VRP時(shí),包裝效率較低,收集的上清液中感染細(xì)胞比例低,而在包裝EEEV和WEEV的VRP時(shí),包裝效率較高,這可能是SINV VRP系統(tǒng)對(duì)包膜蛋白序列的兼容性不同導(dǎo)致的。由于VRP系統(tǒng)的可行性和適用性需要驗(yàn)證,VRP感染效率低會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察分析和判斷,因此可以嘗試通過構(gòu)建基于SFV或VEEV的VRP系統(tǒng)來提高包裝效率,或者基于CHIKV包裝CHIKV-AF和CHIKV-181/25的VRP。收獲的VRP可感染多種細(xì)胞系并確定易感細(xì)胞系,有助于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中不同實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞系的選擇。

本研究在構(gòu)建VRP時(shí),將衣殼蛋白基因與包膜蛋白基因分別克隆到2個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒中表達(dá)。這種構(gòu)建策略與衣殼蛋白和包膜蛋白被克隆到同一質(zhì)粒表達(dá)的構(gòu)建策略相比,具有一定的優(yōu)勢(shì)。首先,同一質(zhì)粒表達(dá)衣殼蛋白和包膜蛋白,只須發(fā)生一次重組就能獲得完整的病毒基因組,而分別表達(dá)衣殼蛋白和包膜蛋白,須發(fā)生2次重組才能產(chǎn)生完整的病毒基因組,形成野生型病毒,重組率低,安全性更高。此外,用同一質(zhì)粒表達(dá)衣殼蛋白和包膜蛋白時(shí),會(huì)引入突變使得p62喪失細(xì)胞內(nèi)剪切功能,由此產(chǎn)生的病毒顆粒需要糜蛋白酶的激活才能具有感染性,應(yīng)用難度大,使用成本較高,而分別表達(dá)衣殼蛋白和包膜蛋白時(shí),不用引入p62的突變,不需要糜蛋白酶的激活,降低了操作難度,減少了使用成本,應(yīng)用更為廣泛[24-25]。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了基于MLV的假病毒系統(tǒng)和基于SINV的VRP系統(tǒng)。兩系統(tǒng)都產(chǎn)生了單輪感染性顆粒,可以在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作,安全性較好;可以模擬甲病毒的真實(shí)感染過程,本研究利用這兩種系統(tǒng)驗(yàn)證了B3gat3基因和Mxra8基因?qū)撞《救肭诌^程的影響;同時(shí)表達(dá)熒光蛋白報(bào)告基因,可以便捷地量化檢測(cè)結(jié)果?；贛LV的假病毒系統(tǒng)將基因整合到宿主基因組中,報(bào)告基因的表達(dá)更穩(wěn)定,適合長時(shí)間檢測(cè)?；赟INV的VRP系統(tǒng)利用了SINV的復(fù)制特性,可以更快速高效地合成所插入的報(bào)告基因,檢測(cè)更靈敏,也能更真實(shí)地模擬活病毒的感染過程。此外,由于本研究構(gòu)建的病毒顆粒只能完成一輪感染,無法還原活病毒持續(xù)感染誘導(dǎo)出的病變反應(yīng),存在一定的局限性。本研究構(gòu)建的MLV假病毒系統(tǒng)和SINV VRP系統(tǒng)為研究甲病毒入侵和研發(fā)抗病毒藥物提供了安全可靠的實(shí)驗(yàn)工具。