雷彩虹, 俞林雙, 金萬慧, 朱海霖, 陳建勇

(1. 浙江理工大學(xué) 紡織科學(xué)與工程學(xué)院(國際絲綢學(xué)院), 浙江 杭州 310018; 2. 浙江省現(xiàn)代紡織技術(shù)創(chuàng)新中心, 浙江 紹興 312000; 3. 湖北省纖維檢驗局, 湖北 武漢 430000)

絲素蛋白(SF)是一種來源于蠶絲的大分子蛋白質(zhì)[1],由甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸等多種氨基酸組成,具有良好的生物相容性和生物降解性,以及一定的抗炎作用[2]。近年來,絲素基生物材料已在創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域得到了很多研究與應(yīng)用[3],成為傷口敷料應(yīng)用的優(yōu)先選擇材料[4]。單一的絲素基生物材料的抗菌性能弱,限制了其在創(chuàng)面敷料中的應(yīng)用[5]。殼聚糖(CS)是一種由天然多糖脫除部分乙酰基得到的材料,具有無毒性、良好的生物相容性和較強(qiáng)的抗菌性[6],在醫(yī)用敷料領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[7]。

靜電紡絲制備的纖維膜呈現(xiàn)出相互連接的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有可調(diào)節(jié)的孔隙率和較好的生物相容性[8],不僅利于細(xì)胞呼吸增殖,加速創(chuàng)面愈合,其較大的比表面積又能增加吸水量,可有效提高止血效率[9]。趙新哲等[10]將膠原蛋白與聚氧化乙烯(PEO)在鹽酸溶液中混合,通過靜電紡絲制得一種新型的止血敷料。Li等[11]用靜電紡絲制備苯丙氨酸基聚酯脲復(fù)合納米纖維膜,其具有良好的細(xì)胞相容性和血液相容性,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有很好的抑制作用,以及減少傷口二次感染的可能性。Varshney等[12]利用靜電紡絲技術(shù)制備絲素蛋白/大豆分離蛋白共混膜,大鼠全層皮膚損傷實(shí)驗表明該共混膜有利于傷口愈合,能夠促進(jìn)組織再生。由此可見,靜電紡絲技術(shù)是一種制備功能性纖維膜的高效方法,在創(chuàng)傷敷料領(lǐng)域具有很大的發(fā)展?jié)撃?可開發(fā)出優(yōu)異性能的纖維膜材料。

本文以殼聚糖為生物抗菌劑,以六氟異丙醇和三氟乙酸為溶劑分別溶解絲素蛋白和殼聚糖,制備混合紡絲溶液;最后利用靜電紡絲技術(shù)制備得到復(fù)合纖維膜,并研究其微觀形貌、吸水率、止血性能和抗菌性能,以期開發(fā)一種具有良好止血效果和抗菌效果的絲素基纖維膜材料,為開發(fā)新的絲素基傷口敷料提供參考。

1 實(shí)驗部分

1.1 實(shí)驗材料

蠶繭,浙江米賽絲綢有限公司;六氟異丙醇(99.5%)、三氟乙酸,上海晶純生化科技股份有限公司;殼聚糖(黏度為100～200 mPa·s),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無水碳酸鈉、無水氯化鈣、無水乙醇、氯化鈉,分析純,杭州高晶化工有限公司;磷酸鹽緩沖液(PBS,pH值為7.2～7.4),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;新西蘭兔血,杭州賽洛進(jìn)生物科技有限公司;營養(yǎng)瓊脂、酵母浸粉、蛋白胨,杭州百思生物技術(shù)有限公司;金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 6538)、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 11229),上海魯微科技有限公司;滅菌級醫(yī)用止血紗布敷料,南昌市奧康醫(yī)療器械有限公司。

1.2 絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合纖維膜的制備

絲素蛋白的制備[13]:將蠶繭在2%碳酸鈉溶液中于98 ℃脫膠3 h后,取出用去離子水沖洗直至沒有膩滑感,再于60 ℃烘干,密封備用;然后,按1∶50的浴比將洗凈后的蠶絲加入三元溶液CaCl2/CH3CH2OH/H2O(量比為1∶2∶8)中在98 ℃下溶解3 h,在室溫下冷卻后置于凱特TG18 G臺式高速離心機(jī)中,以1 200 r/min的速度進(jìn)行離心,15 min后取出上清液抽濾;將抽濾完的清液倒入透析袋中在去離子水中透析3 d,每隔12 h更換一次去離子水,得到絲素蛋白溶液;最后,在-80 ℃下對絲素蛋白溶液進(jìn)行冷凍干燥3 d后得到純絲素蛋白[14]。

紡絲液的配制:以六氟異丙醇為溶劑,配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的絲素蛋白溶液;同時以三氟乙酸為溶劑,配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的殼聚糖溶液;根據(jù)絲素蛋白與殼聚糖質(zhì)量比(10∶0、10∶1、5∶1、10∶3、5∶2)配制不同的絲素蛋白/殼聚糖(SF/CS)混合液,磁力攪拌12 h,靜置消泡,即得到絲素蛋白/殼聚糖紡絲液。

靜電紡絲制備SF/CS復(fù)合纖維膜:將SF、SF/CS紡絲液倒入一次性注射器內(nèi),用內(nèi)徑為0.84 mm的不銹鋼點(diǎn)膠針頭作為噴射口,注射泵推進(jìn)速度為0.5 mL/h,電壓設(shè)置為15 kV,針頭與滾軸的接收距離為10 cm,紡絲時間為2 h,利用JDF05靜電紡絲機(jī),采用硅油紙包裹滾軸的方式收集復(fù)合纖維膜。靜電紡絲過程中電壓和接收距離可進(jìn)行微調(diào),最后將制得的SF/CS復(fù)合纖維膜用75%乙醇浸泡1 h后取出,室溫自然干燥。純絲素蛋白纖維膜(質(zhì)量比為10∶0)樣品記為SF,質(zhì)量比為10∶1、5∶1、10∶3、5∶2的SF/CS復(fù)合纖維膜樣品依次記為SF/CS1、SF/CS2、SF/CS3、SF/CS4。

1.3 表面形貌觀察

將樣品平鋪在導(dǎo)電膠上鍍金處理,通過JSM-5610LV場發(fā)射掃描電子顯微鏡對其表面形貌進(jìn)行觀測,設(shè)置電壓為5 kV。通過 Image-Pro Plus 6.0 軟件在電鏡照片中隨機(jī)選取100根纖維進(jìn)行測量并計算平均直徑及方差。

1.4 化學(xué)結(jié)構(gòu)測試

采用Nicolet is50傅里葉變換紅外光譜儀分析不同復(fù)合纖維膜樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu),測試范圍為 4 000～500 cm-1。

1.5 吸水率測試

吸水率是評價材料體外止血性能的重要指標(biāo)[15]。首先,將各樣品剪成3 cm×3 cm的正方形,稱取質(zhì)量記為md(g)。然后,將樣品分別放入10 mL的PBS溶液中,在室溫下靜置24 h后取出,除去樣品表面多余的水后稱取質(zhì)量,記為mW(g)。以止血紗布為對照,每組樣品測量3次取平均值。樣品吸水率(W)的計算公式為

1.6 體外凝血指數(shù)測試

體外凝血指數(shù)(BCI)是衡量材料止血效果的重要指標(biāo)。當(dāng)血液接觸材料時會使血液凝結(jié),當(dāng)未凝固的血液遇到水時,紅細(xì)胞會吸收水分而破裂釋放血紅蛋白,因此,采用DR3900臺式可見分光光度計測定上清液的血紅蛋白濃度,計算凝血指數(shù)[16]。將50 mg樣品放入離心管中,在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育5 min,然后在離心管中加入100 μL新西蘭兔血。將相同體積的兔血放入含有50 mg止血紗布的離心管中作為對照;另取離心管,其中不加任何樣品加入等量兔血作為陰性對照。孵育后立即將20 μL 0.2 mol/L CaCl2溶液加到離心管中,5 min后加入25 mL去離子水,在50 r/min、37 ℃下振蕩5 min,振蕩后取適量上清液,采用臺式可見分光光度計在545 nm下測定上清液的紫外吸光度。實(shí)驗組和對照組每組樣品測量3次取其平均值。樣品的體外凝血指數(shù)SBCI計算公式為

式中:A1為各組樣品測得的紫外吸光度;A0為陰性對照組的紫外吸光度。

1.7 體外凝血時間測試

體外凝血時間是指材料接觸血液到血液完全凝固時所需要的時間,表征材料促進(jìn)血液凝固的能力,時間越短表明其止血效果較好[17]。將20 mg樣品放在試管中,于37 ℃預(yù)熱5 min后加入1 mL新西蘭兔血,于37 ℃恒溫孵育3 min,然后加入500 μL 25 mmol/L CaCl2溶液,記錄直至倒置試管血液不流動時的時間,即為凝血時間。將未添加樣品的空白組作為對照組,采用同樣的處理方式進(jìn)行測試。每組測量3次取平均值。

1.8 抗菌性能測試

參照 GB/T 20944.1—2007 《紡織品 抗菌性能的評價 第1部分:瓊脂平皿擴(kuò)散法》和 GB/T 20944.3—2008 《紡織品 抗菌性能的評價 第3部分:振蕩法》,對樣品的抗菌性能進(jìn)行測試。檢測菌種選用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌,樣品的抗菌性能以抑菌圈直徑和抑菌率表征。

抑菌圈直徑:將液態(tài)的無菌瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中,待其冷卻固化后,取適量菌液在平板上均勻地涂板,并將復(fù)合纖維膜制成直徑為6 mm的圓形試樣,分別置于培養(yǎng)皿的中間位置,于37 ℃恒溫密封培養(yǎng);24 h后用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑的大小。每組樣品測量3次取平均值。

抑菌率:向裝有3.6 mL生理鹽水的離心管中放入400 μL濃度為107CFU/mL的菌液,稱取50 mg樣品放入菌懸液中,振蕩使細(xì)菌均勻分布,培養(yǎng)24 h后稀釋104倍,然后移取10 μL菌液涂瓊脂平板并密封倒置。將平板在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,對平板上生長的細(xì)菌菌落數(shù)進(jìn)行計數(shù)(Nm)。以未放樣的空白組細(xì)菌菌落數(shù)為對照組(N0),每組樣品測量3次取平均值。樣品的抑菌率(R)計算公式為

2 結(jié)果與討論

2.1 表面形貌分析

圖1示出不同質(zhì)量比的絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合纖維膜的表面形貌。從圖1(a)～(b)可看出,未浸泡乙醇前,純絲素蛋白纖維膜中的纖維呈光滑松散、無串珠結(jié)構(gòu),而浸泡乙醇后纖維呈致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。從圖1(c)～(f)可看出,加入殼聚糖后,SF/CS復(fù)合纖維膜中出現(xiàn)較細(xì)的纖維。與純絲素蛋白膜((0.61±0.22) μm)相比,制得的4種SF/CS復(fù)合纖維膜的纖維直徑均增加,SF/CS1、SF/CS2、SF/CS3、SF/CS4復(fù)合纖維膜的平均直徑分別為(0.74±0.37) μm、(0.79±0.21) μm、(0.78±0.34) μm、(0.77±0.38) μm。靜電紡的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于纖維膜接觸創(chuàng)面時增加細(xì)胞的結(jié)合位,使其增殖[18]。

圖1 復(fù)合纖維膜的掃描電鏡照片

2.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖2為不同質(zhì)量比的SF/CS復(fù)合纖維膜的紅外光譜圖?？梢钥闯?所有纖維膜在3 280 cm-1附近均出現(xiàn)O—H和N—H伸縮振動峰,在1 625 cm-1處出現(xiàn)酰胺I的吸收峰[19],在1 520 cm-1處出現(xiàn)酰胺II的吸收峰[20],都表現(xiàn)為典型的β折疊結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)可使SF不溶于水。同時復(fù)合纖維膜在1 029 cm-1處出現(xiàn)吸收峰,為殼聚糖中二級醇羥基υ( C—O ) 結(jié)構(gòu)[21]。以上表明CS的典型特征峰和SF的特征峰均在SF/CS復(fù)合纖維膜中出現(xiàn),說明SF與CS屬于物理共混且沒有新物質(zhì)產(chǎn)生。

圖2 復(fù)合纖維膜的紅外光譜圖

2.3 吸水率分析

圖3 復(fù)合纖維膜的吸水率

2.4 體外凝血指數(shù)分析

圖4示出不同質(zhì)量比的SF/CS復(fù)合纖維膜的體外凝血情況及凝血指數(shù)。

從圖4(a)可看出,加入纖維膜后,血液凝固成血凝塊并沉降在離心管的底部,隨著殼聚糖添加量的增加,復(fù)合纖維膜吸收血液的量增多,上清液的顏色逐漸變淡。從圖4(b)可以看出,與止血紗布((80.01±1.38)%)相比,純SF絲素蛋白纖維膜和SF/CS1、SF/CS2、SF/CS3和SF/CS4復(fù)合纖維膜的BCI值均減小,分別為(75.15±0.80)%、(67.96±0.79)%、(33.11±0.41)%、(28.24±0.86)%和(24.36±0.69)%,表明其體外促凝血能力優(yōu)于止血紗布,這歸因于SF/CS復(fù)合纖維膜具有較高的吸水率(見圖3),在與血液接觸時能夠快速吸水分,增加血液的黏度促使血液加速凝固。

2.5 體外凝血時間分析

圖5示出不同質(zhì)量比的SF/CS復(fù)合纖維膜的體外凝血效果。

圖5 復(fù)合纖維膜的體外凝血效果

由圖5可以看出,隨著殼聚糖添加量的增加,復(fù)合纖維膜的凝血時間逐漸縮短,其中SF/CS4復(fù)合纖維膜的凝血時間((137.00±0.82) s)最短,凝血效果最好,說明殼聚糖可以增強(qiáng)絲素蛋白纖維膜的凝血性能。這是由于殼聚糖是顯正電性的多糖聚合物,可通過靜電作用力吸附帶負(fù)電荷的血小板和紅細(xì)胞,殼聚糖的親水性氨基可吸附纖維蛋白原,且能抑制溶纖酶的活性,利于血栓的形成[23]。

2.6 抗菌性能分析

圖6示出采用瓊脂平皿擴(kuò)散法[24]測量的不同質(zhì)量比的SF/CS復(fù)合纖維膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑?？梢钥闯?純絲素蛋白纖維膜對2個菌種僅具有輕微的抗菌性能,隨著殼聚糖添加量的增加,SF/CS復(fù)合纖維膜對2種菌種的抑菌圈直徑都呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。從圖6還可看出,復(fù)合纖維膜對金黃色葡萄球菌的抗菌性明顯優(yōu)于大腸桿菌,這是由于殼聚糖可與革蘭氏陰性菌的脂多糖、革蘭氏陽性菌中的磷壁酸結(jié)合,從而導(dǎo)致細(xì)胞壁的損傷,使細(xì)胞膜功能紊亂,且對革蘭氏陽性菌的抑制作用比革蘭氏陰性菌強(qiáng)[23]。

圖6 復(fù)合纖維膜的抑菌圈直徑

圖7示出采用振蕩法[25]測量的不同質(zhì)量比的SF/CS復(fù)合纖維膜的抗菌效果。從圖7(a)～(b)可看出,與空白對照的瓊脂平板相比,純絲素蛋白纖維膜的瓊脂平板上菌落數(shù)量減少,但仍能觀察到大量菌落,這說明雖然純絲素蛋白纖維膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有一定的抑制作用,但其抑菌效果并不顯著。當(dāng)殼聚糖添加量增加時,SF/CS1、SF/CS2、SF/CS3、SF/CS4瓊脂平板上生長的菌落數(shù)目逐漸減少。其中當(dāng)SF和CS的質(zhì)量比為5∶2時,所制得的復(fù)合纖維膜SF/CS4具有較強(qiáng)的抗菌活性,對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑和抑菌率分別為(15.34±0.04) mm和(93.27±0.97)%,對大腸桿菌的抑菌圈直徑和抑菌率分別為(11.88±0.04) mm和(73.93±0.85)%。殼聚糖的抗菌機(jī)制是其分子中攜帶了正電荷,可與負(fù)電性微生物的細(xì)胞壁相結(jié)合,從而破壞菌體的細(xì)胞壁[26]。此外,復(fù)合纖維膜的抗菌性能與殼聚糖的添加量成正相關(guān),但當(dāng)SF和CS的質(zhì)量比超過5∶2時,紡絲液進(jìn)行靜電紡絲時穩(wěn)定性變差,因此,綜合殼聚糖用量、凝血效果和抗菌性,本文實(shí)驗沒有進(jìn)一步制備更高質(zhì)量比的SF/CS復(fù)合纖維膜。

圖7 復(fù)合纖維膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌效果

3 結(jié) 論

本文采用靜電紡絲技術(shù)制備了不同質(zhì)量比的絲素/殼聚糖(SF/CS)復(fù)合纖維膜,并探討了其微觀形貌、吸水率、止血性能和抑菌性能。復(fù)合纖維膜的抗菌性、止血性能與殼聚糖的添加量密切相關(guān),當(dāng)絲素蛋白和殼聚糖質(zhì)量比為5∶2時,制得的復(fù)合纖維膜(SF/CS4)具有較高的吸水率,抗菌效果較好,對大腸桿菌的抑菌圈直徑和抑菌率分別為(11.88±0.04) mm和(73.93±0.85)%,對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑和抑菌率分別為(15.34±0.04) mm和(93.27±0.97)%。由止血性能測試結(jié)果可知,SF/CS4復(fù)合纖維膜的體外凝血指數(shù)較小,體外凝血時間較短,止血性能優(yōu)于止血紗布。本文實(shí)驗制備的絲素基復(fù)合纖維膜材料性能較優(yōu),未來可進(jìn)一步探究其在傷口創(chuàng)面愈合中的應(yīng)用。