李偉宏，高 娟，王風(fēng)云*，鄭 巖

1. 河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 450042

2. 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 201203

橘紅素又稱桔皮素，屬于甲氧基黃酮類化合物，主要存在于柑橘屬植物中[1]，具有抗腫瘤、抑制哮喘、抗炎、保護(hù)神經(jīng)、抑制肝腎損傷等活性[2]。橘紅素通過抑制Ras/MEK/ERK 信號(hào)通路蛋白表達(dá)[3]，可有效抑制卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的增殖與侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡。橘紅素通過抑制DMBA 誘導(dǎo)的乳腺癌大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]，從而對(duì)乳腺癌具有明顯療效，可作為治療乳腺癌候選藥物之一，因此橘紅素在婦科腫瘤方面具有一定開發(fā)價(jià)值。橘紅素口服劑量達(dá)3000 mg/kg 時(shí)，14 d 后仍未觀察到毒性反應(yīng)[5]，可見該成分毒性極小，安全性較高。據(jù)報(bào)道[6]，橘紅素油水分配系數(shù)（lgP）為3.5，屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中II 類藥物。課題組測(cè)得橘紅素在25 ℃水中溶解度為（23.25±0.09）μg/mL，極低的溶解度導(dǎo)致溶出速率及溶出度極差，且胃腸道穩(wěn)定性差[7]，容易發(fā)生降解，導(dǎo)致口服絕對(duì)生物利用度僅為6.02%[8]。目前，僅見桔皮素自微乳[9]納米制劑報(bào)道，但該制劑中表面活性劑及助表面活性劑用量較高，存在安全隱患，且處方組成復(fù)雜。

脂質(zhì)納米粒（lipid-based nanoparticles）在提高難溶性藥物生物利用度、改善藥效等方面獲得醫(yī)藥研究者的廣泛認(rèn)可，且生物相容性高，是難溶性藥物納米制劑的優(yōu)良載體[10]。固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles，SLNs）是采用合成或天然的固態(tài)脂質(zhì)為載體材料，將難溶性藥物包裹或分散于其中而制成的一種脂質(zhì)納米粒[11-15]，是研究相對(duì)較早的一種納米制劑。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carriers，NLCs）系經(jīng)SLNs 改良而來，通過在載體中引入液態(tài)脂質(zhì)而制備的一種脂質(zhì)納米粒[16-19]，屬于第2 代脂質(zhì)納米粒。為解決橘紅素生物利用度低下問題，比較SLNs 和NLCs 在儲(chǔ)存穩(wěn)定性、促吸收作用等方面優(yōu)劣，本研究在單因素考察的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）優(yōu)化橘紅素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（tangeretin nanostructured lipid carriers，Tan-NLCs）處方工藝，并制備橘紅素固體脂質(zhì)納米粒（tangeretin solid lipid nanoparticles，Tan-SLNs），比較Tan-NLCs 和Tan-SLNs 理化性質(zhì)、體外釋藥、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和口服藥動(dòng)學(xué)行為等，為中藥難溶性成分脂質(zhì)納米粒的選擇提供依據(jù)，也為橘紅素納米制劑研發(fā)提供研究資料。

1 儀器、材料與動(dòng)物

Master-Sizer 3000 型粒度分析儀，英國(guó)馬爾文公司；Quintix125D-1CN 型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；1200 型高效液相色譜儀（HPLC），DAD 檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司；TMX-22R 型高速離心機(jī)，美國(guó)Beckman 公司；CJB-S-10D型實(shí)驗(yàn)室數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，鄭州特爾儀器設(shè)備有限公司；KQ-5200DE 型超聲儀，上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司；RC-8DS 型溶出試驗(yàn)儀，天津市國(guó)銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司；JEM-2100Plus 型透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會(huì)社；OLB-WD1000 型氮吹儀，歐萊博科學(xué)儀器有限公司；DSC214 Polyma型差示掃描量熱儀，德國(guó)耐馳儀器公司；D8 Advance型X 射線粉末衍射儀，意大利布魯克儀器公司。

橘紅素原料藥，批號(hào)20210308，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.0%，南京廣潤(rùn)生物制品有限公司；橘紅素對(duì)照品，批號(hào)201105，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%，大連美侖生物技術(shù)有限公司；反式-1,2-二苯乙烯對(duì)照品，批號(hào)20211208，上海博飛美科化學(xué)科技有限公司；單硬脂酸甘油酯（批號(hào) 20201014）、乳糖（批號(hào)20201011），西安天正藥用輔料有限公司；油酸（批號(hào)20210120）、泊洛沙姆188（批號(hào)20201319），山西錦洋藥用輔料有限公司。

18 只健康SD 大鼠，清潔級(jí)，雌雄兼用，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證編號(hào)為SCXK（豫）2020-0001。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R 原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 Tan-NLCs 及Tan-SLNs 的制備

高壓均質(zhì)法制備Tan-NLCs。精密稱取橘紅素20 mg、處方量的單硬脂酸甘油酯及油酸，置于圓底燒瓶中，加入20 mL 無水乙醇，置于70 ℃水浴中加熱磁力攪拌（850 r/min）至溶解澄清，作為有機(jī)相。取一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)泊洛沙姆188 水溶液50 mL 置于70 ℃水浴中，磁力攪拌（850 r/min）至溶解澄清，作為水相。將有機(jī)相逐滴加至水相中，磁力攪拌（850 r/min）30 min，立即進(jìn)行高壓均質(zhì)。置于?10 ℃冰箱中固化10 min，過0.45 μm 水性微孔濾膜，收集續(xù)濾液并補(bǔ)加蒸餾水至50 mL，即得Tan-NLCs 混懸液。除不加液態(tài)脂質(zhì)油酸外，同法制備Tan-SLNs。

2.2 HPLC 法測(cè)定橘紅素含量

2.2.1 測(cè)定條件 色譜柱為Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；波長(zhǎng)為374 nm；柱溫為35 ℃；流動(dòng)相為甲醇-水（50∶50）；進(jìn)樣量為10 μL；體積流量為1.0 mL/min。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密稱取20.0 mg 橘紅素對(duì)照品轉(zhuǎn)移至100 mL 量瓶中，加入甲醇80 mL 超聲30 s 溶解，放置10 min 后甲醇稀釋定容，得質(zhì)量濃度為200 μg/mL 橘紅素對(duì)照品儲(chǔ)備液。采用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度為10.00、5.00、2.50、1.00、0.50、0.05 μg/mL 系列橘紅素對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各個(gè)質(zhì)量濃度（X）的峰面積（Y），以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y＝16.800 4X＋0.152 0，r＝0.999 9，結(jié)果表明橘紅素在0.05～10.00 μg/mL存在良好的線性關(guān)系。

2.2.3 Tan-NLCs 和Tan-SLNs 供試品溶液的制備精密取Tan-NLCs 混懸液1 mL 至50 mL 量瓶中，加入甲醇40 mL 超聲5 min（工作2 s，間隔1 s，功率為250 W），甲醇稀釋定容。采用0.45 μm 微孔濾膜濾過，精密取續(xù)濾液5 mL 至10 mL 量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋定容，搖勻即得Tan-NLCs 供試品溶液。同法制備Tan-SLNs 供試品溶液。

2.2.4 專屬性考察 取單硬脂酸甘油酯、油酸等輔料按“2.1”項(xiàng)下方法制備空白樣品（不含橘紅素），按“2.2.3”項(xiàng)方法制備空白樣品溶液。取空白樣品溶液、橘紅素對(duì)照品溶液、Tan-NLCs 供試品溶液和Tan-SLNs 供試品溶液分別進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。表明輔料未干擾橘紅素色譜峰，專屬性良好，理論塔板數(shù)以橘紅素計(jì)不低于6500。

2.2.5 精密度考察 分別取同1 份Tan-NLCs 和Tan-SLNs 供試品溶液，各6 份，分別按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定橘紅素峰面積，計(jì)算得橘紅素峰面積的RSD 分別為1.50%和1.82%，表明精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性考察 取同1份Tan-NLCs和Tan-SLNs樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法分別平行制備6 份Tan-NLCs 和Tan-SLNs 供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算得橘紅素質(zhì)量濃度的RSD 分別為1.04%和0.86%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性考察 取Tan-NLCs 和Tan-SLNs 供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 測(cè)定橘紅素含量，計(jì)算得橘紅素峰面積的RSD 分別為0.68%和1.13%，結(jié)果表明Tan-NLCs 和Tan-SLNs 供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.8 準(zhǔn)確度考察 精密取Tan-NLCs 樣品0.5 mL置于50 mL 量瓶中，共9 份，分為低、中、高3 組，每組各3 份。分別加入橘紅素對(duì)照品儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度為200 μg/mL）0.5 mL（低）、1.0 mL（中）和1.5 mL（高），按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣測(cè)定橘紅素含量，計(jì)算得橘紅素的平均加樣回收率為100.12%，RSD 為1.53%。

Tan-SLNs 樣品同法操作，測(cè)得計(jì)算得平均加樣回收率為99.17%，RSD 為0.96%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明準(zhǔn)確度較高。

2.3 質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定

精密取Tan-NLCs 混懸液1 mL，置于超濾管中（截留相對(duì)分子質(zhì)量為8000～12 000），12 000 r/min離心（離心機(jī)溫度為4 ℃，半徑為6.4 cm）20 min，取外管液測(cè)定游離橘紅素質(zhì)量（m游離）。另精密取Tan-NLCs 混懸液1 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定橘紅素總量（m總），計(jì)算Tan-NLCs 的包封率和載藥量。Tan-SLNs 包封率和載藥量同法測(cè)定。

m代表藥物總量和脂質(zhì)載體總量

取Tan-NLCs 混懸液，蒸餾水稀釋至50 倍，搖勻，取適量于粒度分析儀上測(cè)定粒徑及ζ 電位。Tan-SLNs 粒徑及ζ 電位同法測(cè)定。

2.4 Tan-NLCs 處方工藝單因素考察

2.4.1 脂藥比的考察 固定桔皮素20 mg，脂質(zhì)載體為單硬脂酸甘油酯和油酸，固液脂質(zhì)比為4∶1，泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%，均質(zhì)壓力為70 MPa，均質(zhì)次數(shù)為8 次的條件下考察脂藥比對(duì)Tan-NLCs 包封率、載藥量和粒徑的影響。結(jié)果見表1，Tan-NLCs 包封率隨著脂藥比的增加而增加，載藥量隨著脂藥比的增加呈逐漸下降趨勢(shì)，可見脂質(zhì)載體對(duì)藥物的包載能力是有限的[16]，脂質(zhì)用量過多時(shí)會(huì)影響Tan-NLCs 載藥量。粒徑隨著脂藥比的增加總體呈增加趨勢(shì)，可能是由于脂質(zhì)用量過多時(shí)體系黏度較大，導(dǎo)致形成粒徑變大。因此脂藥比對(duì)Tan-NLCs 包封率、載藥量和粒徑影響較大，需繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化。

表1 脂藥比的考察 (±s, n = 3)Table 1 Investigation of lipid-drug ratio (±s, n = 3)

表1 脂藥比的考察 (±s, n = 3)Table 1 Investigation of lipid-drug ratio (±s, n = 3)

脂藥比 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm 5∶1 43.62±1.12 6.72±0.14 191.55±13.44 10∶1 58.71±1.62 5.43±0.19 202.78±10.89 15∶1 78.99±0.97 4.94±0.22 190.23±9.62 20∶1 81.12±1.05 3.75±0.15 226.89±10.11 25∶1 81.77±1.32 3.14±0.16 244.40±10.68

2.4.2 固液脂質(zhì)比的考察 固定桔皮素20 mg，脂藥比為15∶1，泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%，均質(zhì)壓力為70 MPa，均質(zhì)次數(shù)為8 次的條件下考察固液脂質(zhì)比對(duì)Tan-NLCs 包封率、載藥量和粒徑的影響。結(jié)果見表2，不同固液脂質(zhì)比制得的Tan-NLCs粒徑在190～210 nm。Tan-NLCs 的包封率和載藥量均隨著固液脂質(zhì)比增加呈先增加后下降情況，表明固液脂質(zhì)比對(duì)Tan-NLCs 的包載藥物能力有較大影響[20]，因此需對(duì)固液脂質(zhì)比進(jìn)行優(yōu)化。

表2 固液脂質(zhì)比的考察 (±s, n = 3)Table 2 Investigation of solid-liquid lipid ratio (±s, n = 3)

表2 固液脂質(zhì)比的考察 (±s, n = 3)Table 2 Investigation of solid-liquid lipid ratio (±s, n = 3)

固液脂質(zhì)比 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm 2∶1 34.75±0.89 2.11±0.21 201.17±8.47 3∶1 58.62±1.07 3.64±0.19 206.50±10.26 4∶1 77.84±1.48 4.82±0.23 193.36±9.11 5∶1 74.23±1.52 4.56±0.18 191.48±8.97 6∶1 71.90±1.14 4.30±0.20 204.92±9.25

2.4.3 泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)考察 固定桔皮素20 mg，脂藥比為15∶1，固液脂質(zhì)比為4∶1，均質(zhì)壓力為70 MPa，均質(zhì)次數(shù)為8 次條件下考察泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Tan-NLCs 包封率、載藥量和粒徑的影響。結(jié)果見表3，隨著泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加Tan-NLCs 包封率和載藥量均呈先增加后下降趨勢(shì)，表明合適的泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)利于Tan-NLCs 包載藥物。Tan-NLCs 粒徑隨著泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而下降，可能是由于泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大乳化能力越強(qiáng)，越利于形成較小粒徑的Tan-NLCs[17]。泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Tan-NLCs包封率、載藥量和粒徑影響較大，需繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化。

表3 泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的考察 (±s, n = 3)Table 3 Investigation of poloxamer 188 concentration(±s, n = 3)

表3 泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的考察 (±s, n = 3)Table 3 Investigation of poloxamer 188 concentration(±s, n = 3)

泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm 0.50 67.94±0.99 4.18±0.22 251.29±12.51 0.75 73.62±1.16 4.56±0.18 234.16±10.69 1.00 79.17±1.10 4.87±0.19 198.35±8.97 1.25 75.89±1.58 4.71±0.24 187.64±8.86 1.50 72.16±1.36 4.43±0.20 180.77±9.02

2.4.4 均質(zhì)壓力的考察 固定桔皮素20 mg，脂藥比為15∶1，固液脂質(zhì)比為4∶1，泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%，均質(zhì)次數(shù)為8 次的條件下考察均質(zhì)壓力對(duì)Tan-NLCs 包封率、載藥量和粒徑的影響。結(jié)果見表4，均質(zhì)壓力大于90 MPa 時(shí)Tan-NLCs 包封率和載藥量出現(xiàn)下降情況，且粒徑變大，可能是均質(zhì)壓力過大時(shí)體系溫度急劇上升，對(duì)Tan-NLCs有破壞作用，導(dǎo)致藥物泄露。故選擇均質(zhì)壓力為80 MPa 制備Tan-NLCs。

表4 均質(zhì)壓力的考察 (±s, n = 3)Table 4 Investigation of homogeneous pressures (±s,n = 3)

表4 均質(zhì)壓力的考察 (±s, n = 3)Table 4 Investigation of homogeneous pressures (±s,n = 3)

均質(zhì)壓力/MPa 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm 50 75.13±1.19 4.62±0.23 285.56±20.61 60 77.43±1.60 4.74±0.21 243.91±15.26 70 78.86±1.34 4.76±0.19 203.67±9.63 80 79.07±0.99 4.74±0.24 190.84±8.19 90 75.25±1.08 4.58±0.23 209.45±10.04 100 70.48±1.17 4.31±0.18 218.30±10.99

2.4.5 均質(zhì)次數(shù)的考察 固定桔皮素20 mg，脂藥比為15∶1，固液脂質(zhì)比為4∶1，泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%，均質(zhì)壓力為80 MPa 條件下考察均質(zhì)次數(shù)對(duì)Tan-NLCs 包封率、載藥量和粒徑的影響。結(jié)果見表5，均質(zhì)次數(shù)大于8 次時(shí)Tan-NLCs 包封率和載藥量均出現(xiàn)下降情況，且粒徑變大，可見過多均質(zhì)可能對(duì)Tan-NLCs 產(chǎn)生破壞，由于均質(zhì)次數(shù)為6 次時(shí)Tan-NLCs 包封率和載藥量相對(duì)較大，且粒徑小于200 nm，故選擇均質(zhì)6 次來制備Tan-NLCs。

表5 均質(zhì)次數(shù)的考察 (±s, n = 3)Table 5 Investigation of homogeneous times (±s, n = 3)

表5 均質(zhì)次數(shù)的考察 (±s, n = 3)Table 5 Investigation of homogeneous times (±s, n = 3)

均質(zhì)次數(shù)/次 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm 2 80.94±1.38 5.03±0.21 281.95±19.50 4 80.79±0.94 5.04±0.14 238.23±14.17 6 82.12±1.17 5.10±0.19 192.44±9.28 8 79.66±1.30 4.78±0.16 193.62±8.13 10 74.80±1.45 4.56±0.24 218.79±9.99 12 70.19±1.22 4.39±0.18 240.61±10.23

2.5 BBD-RSM 優(yōu)化Tan-NLCs 處方

2.5.1 優(yōu)化方案 根據(jù)單因素考察結(jié)果，選擇脂藥比、固液脂質(zhì)比、泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為主要影響因素，分別作為自變量X1、X2、X3。Tan-NLCs 的包封率、載藥量和粒徑分別作為因變量Y1、Y2、Y3。采用BBD-RSM 優(yōu)化Tan-NLCs 處方，各個(gè)因素水平見表6。為得到較高的包封率和載藥量，且粒徑較小的Tan-NLCs 處方工藝，將包封率、載藥量和粒徑作歸一化處理，計(jì)算3 者總評(píng)歸一值（overall desirability，OD）。包封率（d1）和載藥量（d2）歸一化的計(jì)算公式為dmax＝(Mi－Mmin)/(Mmax－Mmin)；粒徑（d3）歸一化的計(jì)算公式為dmin＝(Mmax－Mi)/(Mmax－Mmin)，其中Mi代表該試驗(yàn)組中實(shí)際值，Mmax為試驗(yàn)組中最大值，Mmin為試驗(yàn)組中最小值；OD 值計(jì)算公式為OD＝(d1d2…dk)1/k。根據(jù)試驗(yàn)方案，測(cè)得不同Tan-NLCs 處方的包封率、載藥量、粒徑及OD 值結(jié)果見表6。

表6 BBD-RSM 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Experiment designs and results of BBD-RSM

2.5.2 模型擬合、分析與最佳處方 使用Design Expert V11.1.2.0 版本對(duì)OD 值數(shù)據(jù)和自變量進(jìn)行擬合，得二次多元回歸方程為OD＝0.870－0.046X1＋0.094X2＋0.087X3－0.230X1X2＋0.120X1X3＋0.037X2X3－0.480X12－0.170X22－0.160X32，模型R2＝0.993 1，Radj2＝0.984 3，兩者較為接近且均大于0.98，可見該數(shù)學(xué)模型對(duì)Tan-NLCs 處方研究具有可靠的指導(dǎo)意義。方差分析見表7，數(shù)學(xué)模型的失擬項(xiàng)P＝0.057 6＞0.05，說明未知因素對(duì)模型干擾較小，模型P值＜0.000 1，說明模型具有極顯著性意義。模型中X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X12、X22和X32均具極顯著差異（P＜0.01）。

表7 方差分析Table 7 Analysis of variance

固定脂藥比（X1）、固液脂質(zhì)比（X2）、泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）中間值不變，繪制自變量與OD 值三維曲面圖，結(jié)果見圖2。設(shè)置目標(biāo)值最小為0，最大為1，得到Tan-NLCs 最佳處方為脂藥比為14.47∶1、固液脂質(zhì)比為4.39∶1、泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.06%，預(yù)測(cè)的Tan-NLCs 的包封率、載藥量、粒徑和OD 值分別為85.79%、5.54%、178.62 nm 和0.911。

圖2 各因素與響應(yīng)值的三維圖Fig. 2 Three-dimensional plots of independent factors and response values

2.6 Tan-NLCs 工藝驗(yàn)證

為便于實(shí)際操作，將Tan-NLCs 最佳處方略作調(diào)整，即脂藥比為14.5∶1、固液脂質(zhì)比為4.4∶1、泊洛沙姆188 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.05%。平行制備3 批Tan-NLCs，分別測(cè)定包封率、載藥量和粒徑，計(jì)算Tan-NLCs 各個(gè)指標(biāo)的偏差［偏差＝(實(shí)測(cè)值－預(yù)測(cè)值)/預(yù)測(cè)值］。結(jié)果見表8，各個(gè)指標(biāo)相對(duì)偏差均小于±5%，證明該數(shù)學(xué)模型對(duì)Tan-NLCs 處方工藝研究具有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。

表8 處方驗(yàn)證結(jié)果 (±s, n = 3)Table 8 Validation results of prescription (±s, n = 3)

表8 處方驗(yàn)證結(jié)果 (±s, n = 3)Table 8 Validation results of prescription (±s, n = 3)

指標(biāo) 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm實(shí)測(cè)值 85.13±1.01 5.43±0.19 184.77±8.63預(yù)測(cè)值 85.79 5.54 178.62偏差/% ?0.77 ?1.98 3.44

2.7 Tan-SLNs 的制備

參考Tan-NLCs 確定的處方工藝，不再加入液態(tài)脂質(zhì)油酸，按“2.1”項(xiàng)下方法制備Tan-SLNs，考察不同脂藥比對(duì)Tan-SLNs 包封率、載藥量和粒徑的影響，結(jié)果見表9。隨著脂藥比的增加，Tan-SLNs的包封率逐漸增加，當(dāng)脂藥比大于16.5∶1 后繼續(xù)增加固體脂質(zhì)用量，包封率基本不再增加，但載藥量下降，且粒徑增大，故選擇脂藥比為16.5∶1 來制備Tan-SLNs。此時(shí)Tan-SLNs 包封率、載藥量和粒徑分別為（73.07±1.38）%、（4.11±0.22）%和（226.09±10.25）nm。

表9 脂藥比的考察 (±s, n = 3)Table 9 Investigation of different lipid-drug ratio (±s,n = 3)

表9 脂藥比的考察 (±s, n = 3)Table 9 Investigation of different lipid-drug ratio (±s,n = 3)

脂藥比 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm 14∶1 65.53±1.02 4.27±0.14 196.84±10.26 14.5∶1 67.22±1.41 4.24±0.18 203.14±11.10 15∶1 69.58±0.97 4.23±0.13 206.87±12.07 15.5∶1 71.19±1.19 4.28±0.20 212.40±11.26 16∶1 72.02±1.23 4.18±0.19 215.68±9.94 16.5∶1 73.07±1.38 4.11±0.22 226.09±10.25 17∶1 73.22±1.46 4.02±0.17 244.98±12.78 17.5∶1 73.18±0.94 3.93±0.12 269.57±11.33 18∶1 73.26±1.03 3.80±0.23 286.61±13.17

2.8 Tan-NLCs 和Tan-SLNs 的表征

2.8.1 粒徑分布和ζ 電位 Tan-NLCs 和Tan-SLNs的粒徑分布見圖3，Tan-NLCs 粒徑分布在100～350 nm，PDI 值為0.095。Tan-SLNs 粒徑分布在100～600 nm，PDI 值為0.141，Tan-SLNs 粒徑分布范圍較寬，PDI 值大于Tan-NLCs。Tan-NLCs 和Tan-SLNs的ζ 電位分別為（?37.84±1.62）mV 和（?38.68±1.57）mV，結(jié)果見圖4。

圖3 Tan-NLCs 和Tan-SLNs 的粒徑分布圖Fig. 3 Particle size distributions of Tan-NLCs and Tan-SLNs

圖4 Tan-NLCs 和Tan-SLNs 的ζ 電位圖Fig. 4 ζ potentials of Tan-NLCs and Tan-SLNs

2.8.2 Tan-NLCs和Tan-SLNs的TEM觀察 取Tan-NLCs 和Tan-SLNs 混懸液樣品，蒸餾水稀釋50 倍，滴管吸取適量滴至銅網(wǎng)，1.5%磷鎢酸鈉染色，置于30 ℃真空干燥箱2 h，于TEM 下觀察Tan-NLCs 和Tan-SLNs 的微觀形態(tài)。結(jié)果見圖5，Tan-NLCs 和Tan-SLNs 呈橢圓形或球形。

圖5 Tan-NLCs (A) 和Tan-SLNs (B) 的TEM 圖Fig. 5 TEM of Tan-NLCs (A) and Tan-SLNs (B)

2.9 Tan-NLCs 和Tan-SLNs 凍干粉的制備

精密量取Tan-NLCs 混懸液50 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的乳糖，震蕩溶解，分裝至西林瓶中。置于?45 ℃冰箱中預(yù)凍2 d，敞口置于冷阱?35 ℃冷凍干燥機(jī)中（真空度0.1 mPa），冷凍干燥2 d，取出即得凍干粉。

Tan-SLNs 凍干粉同法制備，結(jié)果見圖6。采用蒸餾水復(fù)溶Tan-NLCs 凍干粉，測(cè)得平均包封率為（80.16±1.43）%，平均粒徑為（223.26±9.17）nm，平均ζ 電位為（?31.09±1.15）mV。蒸餾水復(fù)溶Tan-SLNs 凍干粉，測(cè)得平均包封率為（68.69±1.38）%，平均粒徑為（269.28±8.84）nm，平均ζ 電位為（?28.11±1.40）mV。

圖6 樣品外觀Fig. 6 Appearance of samples

2.10 體外釋藥行為考察

分別取橘紅素原料藥、Tan-NLCs 凍干粉和Tan-SLNs 凍干粉適量，使橘紅素含量均為10 mg，分別加入pH 2.0 磷酸鹽緩沖液（PBS）5 mL，轉(zhuǎn)移至活化后透析袋中（截留相對(duì)分子質(zhì)量8000～12 000），扎緊。釋放介質(zhì)為pH 2.0 PBS，介質(zhì)體積為1000 mL，介質(zhì)溫度為（37±1）℃，溶出儀轉(zhuǎn)速為75 r/min，于0、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、18、24 h 取樣5 mL，并補(bǔ)加pH 2.0 PBS 5 mL。12 000 r/min離心（離心機(jī)溫度為4 ℃，半徑為6.4 cm）20 min，取上清液測(cè)定橘紅素含量。同法測(cè)定橘紅素原料藥、Tan-NLCs 凍干粉和Tan-SLNs 凍干粉在pH 6.8 PBS中釋藥情況，結(jié)果見圖7。Tan-NLCs 凍干粉和Tan-SLNs 凍干粉均可增加橘紅素釋放速率和累積釋放度，且Tan-SLNs 凍干粉釋藥速率和累積釋放度均高于Tan-NLCs 凍干粉。2 種脂質(zhì)納米粒釋藥模型擬合結(jié)果見表10，均符合Weibull 模型，呈雙相動(dòng)力學(xué)特征[21-22]。

圖7 pH 2.0 PBS 和pH 6.8 PBS 中體外釋藥結(jié)果 (±s, n = 6)Fig. 7 In vitro release curves in pH 2.0 PBS and pH 6.8 PBS (±s, n = 6)

表10 Weibull 釋藥模型和相關(guān)系數(shù)Table 10 Weibull release model and coefficient

2.11 示差量熱掃描（ differential scanning calorimetry，DSC）法分析研究

取橘紅素原料藥、空白輔料、物理混合物（原料藥和輔料比例與Tan-NLCs 凍干粉一致）、Tan-NLCs 凍干粉和Tan-SLNs 凍干粉適量置于樣品槽，壓制后進(jìn)行DSC 分析，分析條件：Al2O3為參比物，升溫范圍為30～300 ℃，升溫速度為10 ℃/min。結(jié)果見圖8，橘紅素原料藥在154.5 ℃出現(xiàn)熔點(diǎn)峰，可能由于單硬脂酸甘油酯和油酸等脂質(zhì)輔料熔點(diǎn)較低，隨著儀器逐漸升溫脂質(zhì)先行溶解，進(jìn)而對(duì)橘紅素熔點(diǎn)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致物理混合物中橘紅素熔點(diǎn)峰提前至136.7 ℃。Tan-NLCs 凍干粉和Tan-SLNs 凍干粉DSC 圖譜僅可觀察到空白輔料的DSC 圖譜，而橘紅素熔點(diǎn)峰消失，證明橘紅素在Tan-NLCs 凍干粉和Tan-SLNs 凍干粉中物相發(fā)生變化。

圖8 DSC 結(jié)果Fig. 8 Results of DSC

2.12 X 射線粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRPD）法分析

取橘紅素原料藥、乳糖、空白輔料、物理混合物（原料藥和輔料比例與Tan-NLCs 凍干粉一致）、Tan-NLCs 凍干粉和Tan-SLNs 凍干粉適量置于樣品槽中進(jìn)行XRPD 掃描，結(jié)果見圖9。橘紅素原料藥在8.1°、9.5°、12.2°、14.5°、18.7°、24.1°、27.6°、29.4°等處出現(xiàn)特征晶型峰。由于輔料的掩蔽作用在物理混合物XRPD圖譜中仍可見橘紅素在9.5°、14.5°和29.7°處的特征晶型峰。Tan-NLCs 凍干粉和Tan-SLNs 凍干粉XRPD 圖譜中橘紅素晶型峰消失，說明橘紅素在Tan-NLCs 凍干粉和Tan-SLNs 凍干粉中可能以無定形形式存在。

圖9 XRPD 結(jié)果Fig. 9 Results of XRPD

2.13 Tan-NLCs 凍干粉和Tan-SLNs 凍干粉穩(wěn)定性研究

取Tan-NLCs 凍干粉和Tan-SLNs 凍干粉密封于西林瓶中，置于溫度30 ℃、濕度60%恒溫恒濕箱中，90 d 后取樣復(fù)溶后測(cè)定包封率、粒徑、ζ 電位。結(jié)果見表11，Tan-SLNs 凍干粉放置90 d 后包封率大幅度下降，粒徑增大，ζ 電位絕對(duì)值變小。Tan-NLCs 凍干粉包封率、粒徑和ζ 電位絕對(duì)值與新制備Tan-NLCs 凍干粉相比均未出現(xiàn)明顯變化，可見Tan-NLCs 凍干粉穩(wěn)定性高于Tan-SLNs 凍干粉。

表11 穩(wěn)定性結(jié)果 (±s, n = 3)Table 11 Stability results (±s, n = 3)

表11 穩(wěn)定性結(jié)果 (±s, n = 3)Table 11 Stability results (±s, n = 3)

樣品 包封率/% 粒徑/nm ζ 電位/mV Tan-SLNs 凍干粉 54.16±1.69 492.83±58.71 ?17.44±1.30 Tan-NLCs 凍干粉 80.20±1.35 230.79±13.45 ?30.26±1.52

2.14 口服藥動(dòng)學(xué)研究

2.14.1 實(shí)驗(yàn)方案 取橘紅素原料藥、Tan-NLCs 凍干粉和Tan-SLNs 凍干粉，加入0.5%的CMC-Na 溶液配制ig 液，臨用現(xiàn)配。取禁食過夜的SD 大鼠18只，隨機(jī)分成3 組，分別稱量體質(zhì)量，按50 mg/kg ig 給藥后立即計(jì)時(shí)。于0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12 h 將待取血大鼠用乙醚麻醉，立即于眼眶后靜脈叢取血約0.25 mL，玻璃毛細(xì)管引流至含肝素離心管中，渦旋5 s 混勻，3000 r/min 離心2 min，取上層血漿冷凍保存。

2.14.2 血漿樣品的處理[8]采用甲醇稀釋配制質(zhì)量濃度為2000 ng/mL 反式-1,2-二苯乙烯對(duì)照品，作為藥動(dòng)學(xué)研究用內(nèi)標(biāo)溶液。精密取血漿樣品100 μL和50 μL 內(nèi)標(biāo)溶液離心管中，加入0.5 mL 乙腈，渦旋混合30 s，靜置10 min，8000 r/min 離心（半徑為6.4 cm）20 min。取上清液至另一離心管中，置于45 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?，加?00 μL 乙腈復(fù)溶，8000 r/min 離心（半徑為6.4 cm）5 min，取上清液進(jìn)樣測(cè)定。

2.14.3 線性關(guān)系考察 血藥濃度測(cè)定色譜條件同“2.2.1”項(xiàng)下。取質(zhì)量濃度為5 μg/mL 橘紅素對(duì)照品溶液，甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為2000、1000、500、250、100、50 ng/mL 一系列對(duì)照品溶液，分別取100 μL 至另一離心管中，置于45 ℃水浴中氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL 空白血漿渦旋混合30 s，按“2.14.2”項(xiàng)下操作并測(cè)定。橘紅素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），橘紅素與反式-1,2-二苯乙烯峰面積比為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得回歸方程Y＝0.002 2X＋0.250 4，r＝0.997 2，結(jié)果表明橘紅素血漿對(duì)照品溶液在50～2000 ng/mL 存在線性關(guān)系。

2.14.4 專屬性考察 取空白血漿、血漿對(duì)照品溶液（橘紅素質(zhì)量濃度100 ng/mL）、血漿樣品（Tan-SLNs凍干粉ig 5 h），按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。色譜圖見圖10，表明血漿內(nèi)源性物質(zhì)未對(duì)橘紅素和反式-1,2-二苯乙烯產(chǎn)生干擾，專屬性高。

圖10 空白血漿 (A)、血漿對(duì)照品溶液 (B) 和血漿樣品(C) 的HPLC 圖Fig. 10 HPLC of blank plasma (A), plasma reference solution (B), plasma sample (C)

2.14.5 穩(wěn)定性考察 取橘紅素原料藥ig 2 h 的血漿樣品，于處理后0、3、6、9、12、18 h 進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得橘紅素與反式-1,2-二苯乙烯峰面積比的RSD為5.66%，表明血漿樣品溶液穩(wěn)定性良好。

2.14.6 精密度考察 取低、中、高質(zhì)量濃度（50、1000、2000 ng/mL）橘紅素血漿對(duì)照品溶液，同1 d連續(xù)測(cè)定6 次，計(jì)算得橘紅素與內(nèi)標(biāo)面積比的RSD分別為7.11%、4.86%、5.29%，結(jié)果表明日內(nèi)精密度良好；低、中、高質(zhì)量濃度橘紅素血漿對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定6 d，每天測(cè)試1 次，計(jì)算得橘紅素與反式-1,2-二苯乙烯峰面積比的RSD 分別為8.90%、6.28%、4.88%，表明日間精密度良好。

2.14.7 重復(fù)性考察 取Tan-SLNs ig 1 h 血漿樣品，按“2.14.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份血漿樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得橘紅素與內(nèi)標(biāo)面積比的RSD 分別為4.16%，結(jié)果表明該法重復(fù)性良好。

2.14.8 加樣回收率考察 取空白血漿配制橘紅素質(zhì)量濃度分別為50、1000、2000 ng/mL 血漿樣品，各平行3 份，按“2.14.2”項(xiàng)下方法操作制備血漿樣品溶液，測(cè)定橘紅素與反式-1,2-二苯乙烯峰面積，帶入血漿對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算橘紅素測(cè)得質(zhì)量濃度，并與實(shí)際配制質(zhì)量濃度相比計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示平均加樣回收率為96.10%，RSD為6.23%，表明準(zhǔn)確度較高。

2.14.9 定量限和檢測(cè)限考察 取橘紅素質(zhì)量濃度為50 ng/mL 的血漿樣品（不含反式-1,2-二苯乙烯），逐步稀釋并測(cè)定，結(jié)果顯示定量限和檢測(cè)限分別為10 ng/mL 和5 ng/mL。

2.14.10 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 橘紅素原料藥、Tan-NLCs 凍干粉和Tan-SLNs 凍干粉的藥-時(shí)曲線見圖11。DAS 3.0 軟件非房室模型計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表12。與橘紅素原料藥相比，Tan-SLNs 的tmax、t1/2、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞均有顯著性改變（P＜0.05、0.01），其中tmax延后至（3.12±0.55）h，t1/2延長(zhǎng)至（5.14±0.73）h，Cmax和相對(duì)口服吸收生物利用度分別提高至2.01 倍和3.10 倍。Tan-NLCs 的tmax、t1/2、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞也均有顯著性改變（P＜0.05、0.01），其中tmax延后至（3.17±0.64）h，t1/2延長(zhǎng)至（5.10±0.81）h，Cmax和相對(duì)口服吸收生物利用度分別提高至2.83 倍和4.59 倍，可見Tan-SLNs 和Tan-NLCs 可促進(jìn)橘紅素口服吸收。與Tan-SLNs 相比，Tan-NLCs 的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞有顯著性增加（P＜0.05），因此Tan-NLCs 促吸收作用優(yōu)于Tan-SLNs。

圖11 藥-時(shí)曲線 (±s, n = 6)Fig. 11 Drug concentration-time curves (±s, n = 3)

表12 主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (±s, n = 6)Table 12 Main pharmacokinetic parameters (±s, n = 6)

表12 主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (±s, n = 6)Table 12 Main pharmacokinetic parameters (±s, n = 6)

與橘紅素比較：*P＜0.05**P＜0.01；與Tan-SLNs 比較：#P＜0.05*P < 0.05**P < 0.01 vs tangeretin;#P < 0.05 vs Tan-SLNs

參數(shù) 單位 橘紅素 Tan-SLNs Tan-NLCs tmax h 1.96±0.33 3.12±0.55* 3.17±0.64*t1/2 h 3.90±0.66 5.14±0.73* 5.10±0.81*Cmax ng?mL?1 603.72±114.68 1 214.08±352.13** 1 710.79±403.11**#AUC0～t ng?h?mL?1 1 748.64±375.97 5 422.12±486.94** 8 021.30±1 178.56**#AUC0～∞ ng?h?mL?1 1 907.36±401.85 5 608.75±541.76** 8 211.92±1 273.78**#

3 討論

Tan-NLCs 包封率和載藥量高于Tan-SLNs，可能是由于在固態(tài)脂質(zhì)中引入液態(tài)脂質(zhì)后形成空間結(jié)構(gòu)缺陷，有利于包載更多藥物；藥物在液態(tài)脂質(zhì)中溶解度往往較高，從而使更多藥物被包載進(jìn)入Tan-NLCs。2 種脂質(zhì)納米粒在pH 2.0 PBS 和pH 6.8 PBS中釋藥結(jié)果顯示，Tan-SLNs 釋藥速率和累積釋放度均高于Tan-NLCs，可能是由于Tan-SLNs 中藥物在分布在表層或淺表層，釋藥阻力相對(duì)較小。Tan-NLCs 處方中引入液態(tài)脂質(zhì)后影響了藥物分布[10]，使藥物更易聚集于Tan-NLCs 內(nèi)部，因而釋藥阻力大于Tan-SLNs，最終使Tan-NLCs 釋藥速率和累積釋放度均低于Tan-SLNs，緩釋特征更為明顯。

Tan-SLNs平均粒徑和PDI值均大于Tan-NLCs，可能與體系黏度相關(guān)[23]。體系黏度越小形成脂質(zhì)納米粒的粒徑也越小，由于Tan-NLCs 處方中引入液態(tài)脂質(zhì)后體系黏度及表面張力均隨之下降，故更易形成粒徑較小的Tan-NLCs，且粒徑分布更窄。Tan-SLNs 和Tan-NLCs 凍干粉的XRPD 和DSC 研究結(jié)果表明，橘紅素在Tan-SLNs 和Tan-NLCs 凍干粉可能以無定型形式存在，放置90 d 后，Tan-SLNs 凍干粉包封率下降、粒徑增大、ζ 電位絕對(duì)值變小，可見Tan-SLNs 凍干粉儲(chǔ)存穩(wěn)定性存在一定問題。Tan-NLCs 凍干粉放置90 d 后包封率、粒徑和ζ 電位與新制備的Tan-NLCs 凍干粉相比基本無變化，說明Tan-NLCs 凍干粉儲(chǔ)存穩(wěn)定性高于Tan-SLNs 凍干粉?？赡苁怯捎赥an-NLCs 處方中引入液態(tài)脂質(zhì)后可有效避免藥物被排擠出固態(tài)脂質(zhì)晶格[10]，提高儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

Tan-SLNs 和Tan-NLCs 的tmax均發(fā)生顯著性延后，可能是由于Tan-SLNs 和Tan-NLCs 緩釋作用，從而影響了藥物進(jìn)入血液循環(huán)速度所致[24-25]。Tan-SLNs 和Tan-NLCs 的t1/2均顯著性延長(zhǎng)，可能是由于部分Tan-SLNs 和Tan-NLCs 以整體形式進(jìn)入血液循環(huán)[17]，從而使t1/2延長(zhǎng)，利于增加藥物體循環(huán)時(shí)間及吸收程度。

Tan-SLNs 和Tan-NLCs 的Cmax和相對(duì)口服吸收生物利用度顯著性增加，可能與桔皮素溶解度及溶出度增加有關(guān)，解決了吸收瓶頸；橘紅素在Tan-SLNs 和Tan-NLCs 中以無定型形式存在，無定型藥物比結(jié)晶型藥物更易吸收；Tan-SLNs 和Tan-NLCs的包裹作用增加了橘紅素穩(wěn)定性，使之免受胃腸道各種酶、pH 值影響，增加了進(jìn)入血液循環(huán)的量[21]；橘紅素比表面積激增，利于與胃腸道充分接觸，促進(jìn)了藥物吸收。Tan-NLCs 促吸收作用高于Tan-SLNs，可能是由于Tan-NLCs 穩(wěn)定性高于Tan-SLNs；Tan-NLCs 粒徑小于Tan-SLNs，更易發(fā)揮納米制劑特殊的吸收機(jī)制[20]；處方中液態(tài)油脂對(duì)藥物具有更大的增溶能力，且液態(tài)油脂本身具有增加藥物透膜滲透作用[26-27]。

綜上，本實(shí)驗(yàn)成功制備了Tan- SLNs 和Tan-NLCs 凍干粉，橘紅素溶出度及生物利用度得到明顯改善，但Tan-NLCs 凍干粉儲(chǔ)存穩(wěn)定性高于Tan-SLNs 凍干粉，促吸收效果更大，后續(xù)將對(duì)Tan-NLCs凍干粉藥效學(xué)展開評(píng)價(jià)，進(jìn)一步豐富研究資料。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突