顧華香 程 驗 李鵬飛 張國偉 季 敏 管懷進

2017年,亞洲干眼協(xié)會在其新共識中明確指出干眼(DE)是一種多因素引起的以淚膜不穩(wěn)定為核心特征的慢性疾病。淚膜由內(nèi)側(cè)的黏液層、中間的水液層和外側(cè)的脂質(zhì)層組成,炎癥、淚液滲透壓升高、瞼板腺功能障礙、屈光手術(shù)、結(jié)膜松弛等均會導(dǎo)致淚膜的不穩(wěn)定[1]?；贒E的新定義,該共識提出了淚膜導(dǎo)向型治療的新概念,并強調(diào)了以淚膜作為治療目標(biāo)和穩(wěn)定淚膜在DE治療中的重要作用[2]。干細胞是具有自我更新和分化潛能的細胞,在一定條件下可以定向分化成機體內(nèi)的功能細胞,具有很強的可塑性,目前發(fā)現(xiàn)的成體干細胞主要有造血干細胞、間充質(zhì)干細胞、組織特異性祖細胞等[3]。來自眼部的干細胞以及其他來源如骨髓、脂肪的間充質(zhì)干細胞因其強大的免疫調(diào)節(jié)功能、營養(yǎng)作用和分化能力已被嘗試用于各種眼表疾病的治療[4-6],可有效彌補藥物治療的不足,使病變的組織精準(zhǔn)再生,維持眼表微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。近年來,DE受到廣泛關(guān)注,而淚膜導(dǎo)向型治療的提出以及再生醫(yī)學(xué)的新興發(fā)展使得DE的治療更傾向于精準(zhǔn)化再生醫(yī)療模式。因此,本文將主要對干細胞在DE再生治療中的作用機制進行綜述。

1 淚膜動力學(xué)及生物學(xué)功能

與既往國際上提出的DE定義相比,此次亞洲干眼協(xié)會提出的新定義首次指出淚膜不穩(wěn)定是引起眼部癥狀和視力損害的關(guān)鍵病理機制,眼表損傷不再作為DE確診的必要條件,出現(xiàn)眼部不適癥狀結(jié)合淚膜不穩(wěn)定即可確診為DE[1]。

1.1 淚膜動力學(xué)及淚膜破裂

淚膜是眼表的重要組成部分,淚膜穩(wěn)定是保護眼表上皮免受干燥應(yīng)激的重要機制之一[7]。淚膜形成的過程大致分兩步,首先,水液層隨著眼瞼瞬目涂布在眼表上皮表面,沉積時其厚度由上瞼對淚液向上的抽吸力和眼表上皮對淚液向下的黏性阻力之間的平衡所決定[8];其次,瞼板腺持續(xù)分泌脂質(zhì),再由下瞼的脂質(zhì)覆蓋表面和缺乏脂質(zhì)層的上淚液表面之間的張力梯度驅(qū)動而向上擴散形成脂質(zhì)層[9]。隨后黏蛋白沿著新形成的水—脂質(zhì)界面擴散,進一步促進淚液和脂質(zhì)在眼表的均勻分布[10]。因此,淚膜三層結(jié)構(gòu)不應(yīng)被看作獨立的功能單位,而是相互協(xié)作的整體,其中任一成分的改變均會影響淚膜動力學(xué)改變,進而導(dǎo)致淚膜破裂[11]。研究表明,各類型的DE其淚膜破裂模式不同,如水液缺乏型DE表現(xiàn)為線條狀或區(qū)域狀淚膜破裂,脂質(zhì)缺乏型DE表現(xiàn)為隨機淚膜破裂,黏蛋白缺乏型DE表現(xiàn)為點狀或酒窩狀破裂,這均為眼科醫(yī)生在臨床診療中精準(zhǔn)評估DE的分型及決定后續(xù)適用的治療方案提供了新的診療思路[12]。

1.2 淚膜不穩(wěn)定在DE發(fā)病機制中的作用

1.2.1 淚膜不穩(wěn)定影響高階像差

淚膜是光線接觸到的第一個折射表面,在保持角膜表面光滑方面起著關(guān)鍵作用[13]。當(dāng)系統(tǒng)出現(xiàn)波前像差時,折射光線不會再聚到預(yù)期的唯一像點,導(dǎo)致圖像散焦或失真。研究表明,淚膜不穩(wěn)定會增加患者不規(guī)則的高階像差并引起眼球光學(xué)界面的異常,從而導(dǎo)致視覺功能和光學(xué)質(zhì)量受損[14]。

1.2.2 淚膜不穩(wěn)定對眼表的損害

在角膜上皮之前,淚膜是抵御環(huán)境和病原體的第一道細胞防線。淚膜不穩(wěn)定會使眼表直接接觸外界病原體,并導(dǎo)致機會性暴露,增加角膜上皮感染和損傷的機會[15]。同時,淚膜含有許多生長因子、抗菌肽、分泌型 IgA 和維生素等[16],它們通過維持免疫穩(wěn)態(tài)并提高宿主防御能力對眼表健康至關(guān)重要[17]。一旦淚膜屏障破壞,先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)被激活將進一步引起眼表炎癥,繼而加劇上皮細胞的損傷。角膜上皮屏障的破壞是中重度DE的標(biāo)志,常被用作評估DE嚴重程度的標(biāo)準(zhǔn)之一[18]。

1.2.3 淚膜不穩(wěn)定引起角膜神經(jīng)病理性疼痛

研究顯示,眼表受到刺激會增加瞬目率,而滴用麻醉藥會導(dǎo)致瞬目率降低[19]。由于眼表干燥或淚膜不穩(wěn)定常會引起DE患者的眼表刺激,導(dǎo)致DE患者瞬目增加。當(dāng)覆蓋眼表的淚膜變薄時,淺表上皮細胞對頻繁的瞬目運動產(chǎn)生的機械應(yīng)力增高,從而會損傷終末神經(jīng)分支,引起角膜慢性疼痛。這啟動了神經(jīng)退化和再生的循環(huán),導(dǎo)致角膜和結(jié)膜神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[20]。再生后的神經(jīng)興奮性也會發(fā)生改變,接受刺激的閾值降低,導(dǎo)致DE患者出現(xiàn)痛覺過敏或異常性疼痛[21]。

2 干細胞在修復(fù)淚膜各層結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用

2.1 水液層

水液缺乏型DE是DE的一個主要亞型,淚腺腺泡細胞產(chǎn)生和分泌初級淚液,構(gòu)成淚膜中最主要的水液層,其分泌不足會嚴重影響眼表的穩(wěn)態(tài)[18]。當(dāng)淚腺受到急性或慢性損傷時,淚腺會被淋巴細胞和其他免疫細胞浸潤,破壞腺泡、導(dǎo)管和肌上皮細胞的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致淚腺功能的喪失,最終引起水液缺乏型DE[22]。Dietrich等[23]誘導(dǎo)缺水型小鼠模型后,通過移植骨髓來源的間充質(zhì)干細胞使萎縮的腺泡細胞恢復(fù)到總淚腺組織的62.0%,與注射鹽水后的自發(fā)再生相比,腺泡細胞增加了25.0%,并恢復(fù)了模型鼠的淚液總量。此研究證實了體外干細胞移植的高治療潛力,并表明當(dāng)內(nèi)在再生潛力不足以恢復(fù)淚腺功能時,外用細胞療法可實現(xiàn)更高的治療效果。Gromova等[24]成功從小鼠淚腺中分選出表達細胞黏附分子的淚腺上皮祖細胞(EPCPs),分離出來的EPCPs在體外培育1周后可重新聚集分化為導(dǎo)管和腺泡結(jié)構(gòu);進一步研究證實,將EPCPs注射到血小板反應(yīng)蛋白-1敲除(TSP-1-/-) 的DE小鼠淚腺中,這些 EPCPs可以成功地移植到病變導(dǎo)管和腺泡中并恢復(fù)腺泡結(jié)構(gòu),同時,EPCPs 可以增加患有慢性淚腺功能障礙的TSP-1-/-小鼠的淚液分泌。這證明了內(nèi)源性祖細胞移植可用于治療淚腺功能障礙所致的水液缺乏型DE。綜上所述,與常規(guī)的人工淚液療法相比,外源性干細胞或內(nèi)源性祖細胞對治療嚴重缺水型DE患者是一種更有希望的方法。

2.2 黏蛋白層

黏蛋白對淚膜的穩(wěn)定性至關(guān)重要,其位于淚膜的最內(nèi)層,多種黏蛋白嵌入角結(jié)膜上皮細胞的微絨毛之間,確保水液能均勻的涂布于眼表,結(jié)膜杯狀細胞是分泌黏蛋白的主要來源[10]。然而患有嚴重眼表疾病者,如斯-約綜合征、瘢痕型類天皰瘡、移植物抗宿主病和累及結(jié)膜的嚴重堿燒傷,通常會存在結(jié)膜杯狀細胞在眼表上皮細胞中完全喪失,引發(fā)黏蛋白缺乏型DE[25]。結(jié)膜上皮是由結(jié)膜上皮細胞和杯狀細胞雙類型細胞組成,其分化和發(fā)育尚未得到很好的表征,有研究一直在不斷嘗試各種策略來培養(yǎng)結(jié)膜上皮尤其是杯狀細胞[26]。Nomi等[27]使用生長因子輔助培養(yǎng)策略,通過表皮生長因子首先驅(qū)動多能干細胞發(fā)育成為結(jié)膜上皮譜系,接著利用角質(zhì)細胞生長因子誘導(dǎo)分離的細胞促進杯狀細胞的成熟,成功培育出能產(chǎn)生黏蛋白的功能性結(jié)膜上皮細胞片。Zhong等[28]使用無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)成功地擴增了兔衍生的結(jié)膜干細胞,免疫熒光顯示干細胞標(biāo)志物和杯狀細胞黏蛋白MUC5AC和MUC16呈陽性表達;接著將實驗組細胞封裝在水凝膠中,使用注射器將其輸送到兔結(jié)膜囊下,通過使用慢病毒載體來標(biāo)記細胞,結(jié)果顯示,第5天水凝膠微結(jié)構(gòu)成功將細胞遞送到球結(jié)膜上皮中。這項研究成功地將3D打印技術(shù)與干細胞移植相結(jié)合,為干細胞將來能夠治療嚴重眼表疾病包括黏蛋白缺乏型DE的微創(chuàng)治療提供了重要臨床思路。除了干細胞移植工程,由干細胞脫細胞技術(shù)制成的脫細胞組織也被用于組織修復(fù)。一項結(jié)膜缺損的兔模型體內(nèi)實驗利用脂肪間充質(zhì)干細胞的低免疫原性制造了脫細胞基質(zhì),與羊膜移植組相比,脫細胞基質(zhì)組兔治療后具有更好的分層上皮結(jié)構(gòu)且含有更多的杯狀細胞,且在促進傷口愈合方面顯示出巨大的優(yōu)勢[29]。在眼表重建中,源于此類干細胞的脫細胞基質(zhì)也可作為一種有前途的結(jié)膜組織替代物。隨著對結(jié)膜杯狀細胞表型的探索,利用細胞療法或組織工程均有望在未來的臨床治療中使退化的杯狀細胞結(jié)構(gòu)再生并恢復(fù)其分泌功能,也為治療黏蛋白缺乏型DE提供了新的視角。

2.3 脂質(zhì)層

脂質(zhì)層位于淚膜的最外側(cè),由瞼板腺分泌并通過眼瞼瞬目促使其釋放,通過保護水液層不蒸發(fā)來維持眼表的穩(wěn)態(tài),同時還保護眼免受環(huán)境威脅和感染[30]。當(dāng)瞼板腺功能障礙影響瞼脂生成時,可導(dǎo)致脂質(zhì)缺乏型DE,且瞼板腺功能障礙通常伴隨著腺體萎縮缺失,這也是脂質(zhì)缺乏型DE無法治愈的主要原因[31]。瞼板腺由圍繞中央導(dǎo)管組織的幾個腺泡組成,腺泡包含分泌瞼脂的瞼板腺上皮細胞,在瞼板腺細胞成熟并最終分化后,它們會破裂并釋放其脂質(zhì)成分[32]。因此,瞼板腺細胞群在整個生命過程中需要不斷更新補充,那么可能存在調(diào)節(jié)瞼板腺細胞生長發(fā)育的成體干細胞群。一項動物體內(nèi)實驗顯示,Krox20細胞系可誘導(dǎo)產(chǎn)生完整且成熟的瞼板腺,若敲除Krox20則會導(dǎo)致瞼板腺標(biāo)志物K14和PPARγ的缺失,同時在眼瞼中也檢測不到油紅O染色標(biāo)記的脂質(zhì),這提示Krox20為瞼板腺干細胞標(biāo)志物,敲除Krox20可能會影響瞼板腺的發(fā)育[33]。除干細胞標(biāo)志物外,干細胞“生態(tài)位”的特征也尚未得到很好的表征,尋找瞼板腺發(fā)育過程祖細胞起源的潛在位點也是一直在探索的方向。Parfitt等[34]通過使用H2B-GFP/K5tTA小鼠,在3D重建中利用譜系追蹤轉(zhuǎn)基因熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn),熒光標(biāo)記細胞主要局限于腺泡內(nèi)導(dǎo)管上皮的末端區(qū)域,這表明導(dǎo)管上皮的末端是瞼板腺干細胞的潛在位點,而不是如先前闡明的那樣位于外周或中央導(dǎo)管[35]。近年來的研究中,雖然瞼板腺的形態(tài)發(fā)育得到了很好的描述[36],但瞼板腺功能障礙介導(dǎo)DE的細胞動力學(xué)尚未完全清楚,能夠成功鑒定出產(chǎn)生瞼板腺的干細胞群對于恢復(fù)瞼板腺的功能并再生腺體具有臨床價值,這提示干細胞可作為脂質(zhì)缺乏型DE的有效治療策略。

3 結(jié)束語

2017亞洲干眼共識將淚膜不穩(wěn)定定義為DE的核心特征,并在此基礎(chǔ)上提出了淚膜導(dǎo)向型治療策略, DE治療需先確定哪一層淚膜受到影響,進而針對性治療。鑒于DE的個體差異性和復(fù)雜性,僅僅是對癥治療仍停留在“治標(biāo)”層面,仍有大量患者表現(xiàn)出久治難愈,因此,對常規(guī)治療無效的個體亟待一種新型療法。本文主要闡述了干細胞在各類DE中發(fā)揮的再生和替代作用。各層眼表組織中均存在干細胞的生態(tài)位,而且將各類型干細胞靶向移植治療DE模型動物受損的外分泌腺取得顯著效果。隨著對干細胞分化潛能的深入研究和臨床應(yīng)用的不斷探索,干細胞有望為更高效、更精準(zhǔn)的DE治療提供新的思路與方向。