張劍橋，楊 敏，寧茲功，路 璐

（1.清華大學(xué)深圳國際研究生院，廣東深圳 518055；2.深圳市羅湖區(qū)城市管理和綜合執(zhí)法局，廣東深圳 518003；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)（深圳）土木與環(huán)境工程學(xué)院，城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518055）

在合成化學(xué)工業(yè)中，異戊二烯（C5H8）作為前體物，可用于生產(chǎn)多種化工產(chǎn)品〔1〕，其中約95%的異戊二烯用于合成橡膠，全球年產(chǎn)量約2 000 萬t〔2〕。目前，異戊二烯主要通過裂解石油生產(chǎn)，年產(chǎn)量約為100 萬t 且仍在增長，年產(chǎn)值約為17～20 億美元。該生產(chǎn)過程以化石燃料為原料，不可持續(xù)且?guī)砭薮蟮奶寂欧帕俊?-4〕。從植物中收集異戊二烯是另一種生產(chǎn)方法。異戊二烯可以由許多植物在自然代謝中產(chǎn)生，并以太克數(shù)量級排放到地球大氣中〔5-7〕。然而，異戊二烯的揮發(fā)性使其收集非常困難。此外，植物種植依賴季節(jié)性，且需要大量土地資源，這阻礙了其大規(guī)模生產(chǎn)利用〔8-9〕。

因此，亟待研究與開發(fā)可持續(xù)的、高效的異戊二烯生產(chǎn)方法。通過合成生物學(xué)手段構(gòu)建基因工程菌，以轉(zhuǎn)化可再生的有機(jī)物來合成異戊二烯，是解決該問題的可行替代方案之一。目前已有大量研究表明，微生物宿主大腸桿菌可以通過異源MVA（Mevalonate，甲羥戊酸）途徑導(dǎo)入、內(nèi)源性MEP（Methylerythritol phosphate，甲基赤蘚糖醇磷酸）途徑修飾、異戊二烯合成酶（IspS）基因?qū)氲仁侄螌?shí)施基因工程改造，實(shí)現(xiàn)異戊二烯的高效生物合成〔10-11〕。盡管異戊二烯的生物合成理論與技術(shù)日趨完善，但目前的研究均以使用葡萄糖等相對昂貴的純有機(jī)物作為底物，使其合成成本居高不下，尋找低成本替代底物是解決這一問題的關(guān)鍵所在。

污水及其處理過程中產(chǎn)生的污泥含有非常豐富的資源，其蘊(yùn)含的化學(xué)能是處理污水、污泥所需消耗能源的9～10 倍〔12〕。從污水和污泥中回收有價(jià)值的資源（比如有機(jī)物、氮和磷等），有望最大限度地減少廢棄物產(chǎn)量，節(jié)約能源成本，并減少由于化石燃料消耗所帶來的二氧化碳排放〔13〕。在過去的幾十年中，關(guān)于污水中氮、磷的回收已有許多研究和運(yùn)用〔14-17〕，然而對有機(jī)物的回收、利用，除微生物厭氧產(chǎn)甲烷外，所采用的生物手段還比較單一，研究還不夠充分。廢棄活性污泥（WAS）是污水生物處理過程中大量產(chǎn)生的一種有機(jī)廢棄物，是大多數(shù)污染物和微生物的最終歸屬，對其的合理處置是污水處理工業(yè)面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。目前，WAS 主要用于厭氧消化產(chǎn)甲烷，反應(yīng)后剩余的厭氧消化污泥（ADS）通常只能用于做肥料〔18-19〕、填埋〔20〕或者焚燒〔21〕。事實(shí)上，ADS 中有機(jī)物含量依然很高〔22〕，含有大量多糖類、蛋白質(zhì)類及腐殖酸類等有機(jī)物，適宜微生物生長繁殖，是生物合成法生產(chǎn)異戊二烯的潛在底物。

筆者構(gòu)建了同時(shí)具有MEP 和MVA 途徑的基因工程大腸桿菌，以從ADS 中提取的溶解性有機(jī)物為唯一底物，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了污泥有機(jī)物的資源化利用及異戊二烯的合成。探究了污泥有機(jī)物作為唯一底物合成異戊二烯的最適條件，并進(jìn)一步揭示了提高異戊二烯產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。

1 材料與方法

1.1 廢棄污泥有機(jī)物為底物的異戊二烯生物合成工藝

基因工程大腸桿菌利用ADS 有機(jī)物合成異戊二烯的流程如圖1 所示，構(gòu)建了以Escherichia coli為底盤細(xì)胞的基因工程菌，通過超聲將污泥中的溶解性有機(jī)物提取出來，進(jìn)而研究基因工程菌利用污泥有機(jī)物為唯一底物定向合成異戊二烯的能力。

圖1 利用廢棄污泥有機(jī)物合成異戊二烯的流程示意Fig.1 The schematic flow of isoprene production from waste sludge organics by biosynthesis

1.2 工程大腸桿菌的構(gòu)建與保存

合成異戊二烯的工程大腸桿菌的構(gòu)建遵循先前研究進(jìn)行〔23〕。簡言之，以強(qiáng)啟動子PGI 或PL**替換E.coli染色體上dxs、dxr和idi基因內(nèi)源的啟動子，用源于Sacchromyces cerevisiae的idi替換內(nèi)源的idi，強(qiáng)化E.coli本身的MEP 途徑，此外，將來自Enterococcus faecalis的mvaE、mvaS基因，和來自S.cerevisiae的PMK、PMD 和IDI 整合到E.coli的染色體上，再導(dǎo)入2 個(gè)質(zhì)粒，pES 和pSK 以分別表達(dá)MVA 上游途徑的IspS 和甲羥戌酸激酶（MK），這樣就獲得了同時(shí)具有MEP 和MVA 途徑，且能夠高效合成異戊二烯的大腸桿菌。

將一部分工程大腸桿菌用Luria Bertani（LB）培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h，并于-80 ℃保存在40%的甘油中備用。另一部分保存在平板上并且每周重新激活用于實(shí)驗(yàn)。平板培養(yǎng)首先需要制備含有氨芐西林、大觀霉素和氯霉素的LB 固體培養(yǎng)基，然后用預(yù)先在LB中培養(yǎng)了8 h 的菌株在平板上劃線，并在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h。其中氨芐西林、大觀霉素、氯霉素的質(zhì)量濃度分別為100、100、30 mg/L。

1.3 厭氧消化污泥有機(jī)物提取

本研究所用ADS 取自北京高碑店污水污泥處理廠，取樣后立刻轉(zhuǎn)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室并在4 ℃下存儲，有機(jī)物提取在取樣一周內(nèi)完成。為了釋放出污泥胞內(nèi)的有機(jī)物，先將ADS 樣品置于帶有散熱裝置的燒杯中，然后在探針式超聲波儀（Bio Safer Co.，China）中超聲處理15 min，超聲頻率為25 kHz。超聲處理后，從污泥中提取有機(jī)物的方法與之前報(bào)道的EPS 提取方法相似〔24〕。簡言之，將樣品置于50 mL 試管中，然后以6 000 r/min 離心15 min，隨后離心上清液過0.45 μm 膜，并將獲得的濾液于4 ℃條件下避光儲存?zhèn)溆谩Ｎ勰嘤袡C(jī)物的主要生化指標(biāo)和有機(jī)質(zhì)質(zhì)量濃度分別為pH=7.89、COD 1 860.0 mg/L、總磷24.5 mg/L、總氮562.1 mg/L、蛋白質(zhì)1 365.4 mg/L、多糖936.2 mg/L、腐殖酸4 671.8 mg/L。

1.4 以污泥有機(jī)物為唯一底物合成異戊二烯

將工程大腸桿菌從平板上活化到LB 培養(yǎng)基，然后接種到含有ADS 有機(jī)物溶液的密閉搖瓶中，并在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)一定時(shí)間。具體分為3 步：1）菌株活化。在存儲菌株的平板上選取一個(gè)菌落，接種到LB培養(yǎng)基中，在37 ℃的旋轉(zhuǎn)搖床（220 r/min）中培養(yǎng)8 h，完成菌株活化。2）搖瓶培養(yǎng)。將活化的大腸桿菌溶液轉(zhuǎn)移到含有25 mL ADS 有機(jī)物溶液的250 mL 密封搖瓶中，大腸桿菌初始OD600為0.2，加入一定量的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside，IPTG），使其在體系中的初始濃度為1 mmol/L，然后在恒溫37 ℃的搖瓶中以220 r/min 培育24 h。3）分析。紫外-可見分光光度計(jì)（GENESYS 150，Thermo Scientic Co.，Ltd.，USA）用于測定大腸桿菌的濃度；異戊二烯的質(zhì)量濃度則通過氣相色譜法（TRACE 1310，Thermo Scientific Co.，Ltd.，USA）測定。用氣體進(jìn)樣針抽取封閉搖瓶上空1 mL 氣體樣品注入氣相色譜儀定量測定異戊二烯。色譜柱采用PLOT-Q column（30 m×0.53 mm×40 μm，天美公司）；檢測器為火焰離子化檢測器（Flame ionization detector，F(xiàn)ID），氫氣和氧氣用于產(chǎn)生和維持火焰，氮?dú)庾鳛檩d氣。GC 進(jìn)樣口溫度維持在120 ℃，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣體積為1 mL。通過配制不同濃度的異戊二烯標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma），測量對應(yīng)峰面積，即可以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而獲得樣品準(zhǔn)確質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果和討論

2.1 工程菌培養(yǎng)最適污泥有機(jī)物濃度優(yōu)化

ADS 中含有大量的有毒有害物質(zhì)（如重金屬等），對微生物具有一定的毒害作用從而抑制其生長，因此首先研究了工程大腸桿菌在不同濃度污泥有機(jī)物溶液中的生長情況，如圖2 所示。

從圖2（a）～圖2（c）可以看出，在污泥有機(jī)物溶液稀釋倍數(shù)小于等于25 倍時(shí)，工程大腸桿菌幾乎無法生長，培養(yǎng)18 h 后OD600相較初始值維持不變甚至略有下降，說明高濃度ADS 有機(jī)物對工程大腸桿菌的生長存在抑制作用。但從圖2（d）～圖2（f）可以發(fā)現(xiàn)，底物稀釋倍數(shù)分別為40、100、200倍時(shí)，工程菌經(jīng)過數(shù)小時(shí)的適應(yīng)期后均能逐步生長，經(jīng)18 h 培養(yǎng)后工程大腸桿菌OD600從初始的0.220 分別增長到0.368、0.365、0.325，表明稀釋倍數(shù)增大，污泥有機(jī)物中毒性物質(zhì)的抑制作用在一定程度上得以緩解。該結(jié)果表明以污泥有機(jī)物為唯一底物培養(yǎng)工程大腸桿菌，污泥有機(jī)物濃度是關(guān)鍵因子。

異戊二烯的產(chǎn)率與底物有機(jī)物濃度息息相關(guān)，而高污泥有機(jī)物濃度會抑制工程菌生長，綜合考慮異戊二烯的產(chǎn)率和工程菌生存因素，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)中異戊二烯的產(chǎn)率，本研究中選擇將ADS 有機(jī)物稀釋40 倍作為底物使用。

2.2 污泥有機(jī)物為唯一底物的異戊二烯生物合成效能及pH 的影響

利用搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究以污泥有機(jī)物為唯一底物的異戊二烯生物合成效能。圖3 為以污泥有機(jī)物為唯一底物時(shí)的工程大腸桿菌生長曲線及異戊二烯累積產(chǎn)量。

圖3 以污泥有機(jī)物為唯一底物的大腸桿菌增殖曲線（a）及異戊二烯的累積產(chǎn)量（b）Fig.3 Time courses for cell growth with ADS as substrate （a） and cumulative isoprene production （b）

從圖3 可以看出，相較于對照組，污泥有機(jī)物和菌體系的實(shí)驗(yàn)組OD600和異戊二烯產(chǎn)量均有明顯提升，證明以污泥有機(jī)物為唯一底物合成異戊二烯是可行的，且在培養(yǎng)24 h 后基本達(dá)到平衡。從圖3（a）可以看到，在培養(yǎng)期內(nèi)工程菌的累積生長曲線可分為快速增長期和平臺期，前24 h 培養(yǎng)期屬于快速增長期，OD600從初始的0.210 增長到0.370，增長速率為76.2%；之后24 h 培養(yǎng)期則基本達(dá)到平臺期，OD600的增長速率僅為13.5%。圖3（b）是異戊二烯累積產(chǎn)量折線圖。由于實(shí)驗(yàn)開始時(shí)接種了初始OD600為0.210 的菌液，這些菌內(nèi)部殘留的中間代謝產(chǎn)物仍然會繼續(xù)合成路徑直至生成異戊二烯，然而這部分產(chǎn)量并不是利用污泥有機(jī)物代謝產(chǎn)生的。為了更準(zhǔn)確地表達(dá)工程菌利用污泥有機(jī)物合成異戊二烯的效率，設(shè)置了水+菌作為對照控制組，并且用與污泥有機(jī)物為底物的實(shí)驗(yàn)組相同的方法換算為異戊二烯產(chǎn)量。由圖3 可以發(fā)現(xiàn)，異戊二烯累積產(chǎn)量與工程菌的OD600呈正相關(guān)，前24 h 培養(yǎng)期內(nèi)異戊二烯產(chǎn)量快速累積達(dá)到33.8 mg/g（以底物的COD 為基準(zhǔn)），隨后的12 h 內(nèi)其累計(jì)產(chǎn)量幾乎保持不變（48 h 后約34.9 mg/g）。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)異戊二烯的累積產(chǎn)量與工程大腸桿菌的OD600密切正相關(guān)，優(yōu)化大腸桿菌生長環(huán)境有望提升異戊二烯的累積產(chǎn)量。通常大腸桿菌適宜在中性條件下生長（pH 為7 左右），然而ADS 初始pH接近8（屬弱堿性），進(jìn)一步探究了pH 對細(xì)菌增殖及異戊二烯合成的影響。經(jīng)過24 h 培養(yǎng)后，不同pH 條件下工程大腸桿菌最終的OD600及異戊二烯累計(jì)產(chǎn)量如圖4 所示。

從圖4 可以看出，pH 為7 是異戊二烯生產(chǎn)的最適pH，在此pH 下工程大腸桿菌得到最大量的增殖且異戊二烯產(chǎn)量也最大。當(dāng)pH 由初始的8 調(diào)到7 時(shí)，培養(yǎng)24 h 后的OD600從0.370 增加到0.430，而更低的pH（6）下OD600反而僅為0.400。同樣的，當(dāng)pH 由初始的8 調(diào)到7 時(shí)，培養(yǎng)24 h 后的異戊二烯累積產(chǎn)量（以底物的COD 為基準(zhǔn)）從33.6 mg/g 增加到40.5 mg/g，而pH 為6 時(shí)僅為35.1 mg/g。所以，pH 為7 的中性環(huán)境是工程大腸桿菌合成異戊二烯的適宜條件。

2.3 各營養(yǎng)元素對異戊二烯產(chǎn)量的影響

底物各營養(yǎng)元素的均衡在生物合成中發(fā)揮重要作用，以廢棄污泥有機(jī)物為唯一底物，存在營養(yǎng)成分比例不均衡問題，進(jìn)而影響著異戊二烯產(chǎn)量。為此，通過向污泥有機(jī)物溶液中添加適量的其他元素，如氮、磷、鈉、鉀、鈣和鎂，以進(jìn)一步探索異戊二烯生產(chǎn)產(chǎn)量的影響因素，結(jié)果如圖5 所示。

從圖5 可以看出，添加氮、磷、鈉、鉀、鈣、鎂，培養(yǎng)24 h 后異戊二烯產(chǎn)量（以底物的COD 為基準(zhǔn)）從40.6 mg/g 分別變?yōu)?4.4、39.6、43.4、41.4、42.5、46.5 mg/g，沒有明顯區(qū)別；但添加少量葡萄糖（500 mg/L）后急速增加至73.5 mg/g。結(jié)果表明，污泥有機(jī)物中不缺乏氮、磷、鈉、鉀、鈣、鎂等元素，而生物可利用碳源不足是制約工程大腸桿菌合成異戊二烯的主要因素。造成這種情況的原因可能有兩個(gè)，一是所構(gòu)建的工程大腸桿菌無法直接利用污泥中的多糖、腐殖酸等大分子物質(zhì)，二是稀釋顯著降低污泥中的生物可利用有機(jī)物含量。為進(jìn)一步提升異戊二烯產(chǎn)量，接下來的研究建議從以下3 方面展開：1）通過改造大腸桿菌的代謝途徑，提升其對污泥中大分子碳源的利用能力；2）通過提高大腸桿菌的抗污染負(fù)荷能力，使其能夠在不經(jīng)稀釋的污泥有機(jī)物生長繁殖；3）探索其他富含小分子有機(jī)物的廢水發(fā)酵合成異戊二烯。

3 結(jié)論與展望

通過構(gòu)建具有MEP 和MVA 途徑的工程大腸桿菌，以從ADS 中提取的溶解性有機(jī)物為唯一底物，實(shí)現(xiàn)了污泥有機(jī)物的資源化利用及異戊二烯的合成。

1）24 h 搖瓶培養(yǎng)后，以污泥有機(jī)物稀釋40 倍作底物，工程大腸桿菌合成異戊二烯累積產(chǎn)量（以底物的COD 為基準(zhǔn)）能達(dá)到33.8 mg/g，證明了以ADS 中提取的溶解性有機(jī)物為唯一底物，合成具有高附加值異戊二烯的科學(xué)可行性。

2）從ADS 中提取的有機(jī)物溶液中含有抑制改造工程菌生存的毒性物質(zhì)，在利用改造大腸桿菌合成異戊二烯前，需要對污泥提取有機(jī)物做適當(dāng)前處理（如稀釋等）。

3）污泥有機(jī)物溶液的pH 和工程大腸桿菌可利用碳源是影響異戊二烯產(chǎn)量的重要因素，pH 為7 是工程大腸桿菌生產(chǎn)異戊二烯的適宜條件，適當(dāng)增加碳源可顯著提升異戊二烯累積產(chǎn)量（73.5 mg/g）。

4）可通過改造大腸桿菌的代謝途徑提升其對污泥中的大分子碳源利用能力，或增強(qiáng)其抗污染負(fù)荷能力等途徑進(jìn)一步提高異戊二烯合成效能。