米美璇 張志想 李世訪 戰(zhàn)斌慧 合木提江·米吉提

關(guān)鍵詞：新疆野蘋果；高通量測序；蘋果莖溝病毒

新疆野蘋果Malus sieversii又名賽威氏蘋果，是珍貴的野生種質(zhì)資源，集中分布在我國新疆伊犁的鞏留縣、新源縣和霍城縣的野果林中。近年來，新疆野蘋果的保護(hù)逐漸引起了人們的重視。然而，目前新疆野蘋果上植物病毒的侵染情況仍不清楚。蘋果褪綠葉斑病毒（apple chlorotic leaf spot vi-rus，ACLSV）、蘋果莖溝病毒（apple stem groovingvlrus，ASGV）、蘋果莖痘病毒（apple stem pitting vi-rus，ASPV）是蘋果產(chǎn)業(yè)中最普遍的3種病毒，經(jīng)常復(fù)合侵染，引發(fā)“高接病”等，致使樹體終生帶毒、生長衰退、嫁接不親和，甚至死亡。為此，本研究采用高通量測序技術(shù)和RT-PCR技術(shù)，對采集自新疆伊犁野果林的野蘋果樣品進(jìn)行了病毒檢測和鑒定，檢測到ACLSV、ASGV和ASPV。結(jié)合RACE末端擴(kuò)增技術(shù)獲得ASGV的全基因組序列并進(jìn)行同源分析。該結(jié)果對新疆野蘋果保護(hù)和利用提供了重要參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品采集

2021年6月，于新疆伊犁新源縣和鞏留縣的野果林采集新疆野蘋果葉片樣品127份。

1.1.2主要劑

高保真酶2×TransStart FastPfu PCR Su-perMix、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit和CTAB購自北京冰達(dá)生物科技有限公司；克隆載體CV14-2ero Background pTOPO Cloning Kit購自北京艾德萊生物科技有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；DH 5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen試劑公司。

核酸提取所用CTAB緩沖液配制：1mol/LTris-Cl（pH 8.0）20 mL，3 mol/L NaCI 133.2mL，0.2mol/l EDTA（pH7.0）20 mL，CTAB（固體粉末）4g，滅菌水至200mL。

1.1.3引物設(shè)計(jì)與合成

本研究所選用的ACLSV、ASPV、ASGV檢測引物和ASGV全基因組擴(kuò)增引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1RNA提取

稱取新鮮葉片0.1g，用CTAB法提取所有樣品的總RNA，具體方法參考Li等。

1.2.2RNA測序文庫構(gòu)建、測序及生物信息學(xué)分析

將兩地采集的樣品各分為兩組，每組由6～8份樣品隨機(jī)組成。將混合后的樣本分別命名為S1（6份）、S2（6份）、S3（6份）、S4（8份），提取RNA。使用完整性、純度、濃度等質(zhì)量檢測均合格的RNA，去除rRNA后構(gòu)建文庫，由天津諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行高通量測序，高通量測序平臺為Illumina HiSeq2000。得到測序原始數(shù)據(jù)（raw reads）后，去除接頭序列、低質(zhì)量和未配對測序數(shù)據(jù)；獲得過濾的數(shù)據(jù)（cleanreads），將其與蘋果基因組比對，去除宿主來源的數(shù)據(jù)；再使用Trinity（v2.2.0）拼接數(shù)據(jù)，獲取序列重疊群（contigs）；將所得contigs在GenBank中的病毒數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST檢索。

1.2.3ACLSV、ASPV、ASGV的RT-PCR檢測和ASGV全基因組的擴(kuò)增

選取一份本研究中已鑒定為ASGV陽性的新疆野蘋果樣品cDNA為模板，進(jìn)行ASGV全基因組序列的擴(kuò)增和克隆，PCR擴(kuò)增體系和克隆步驟同上，ASGV的末端擴(kuò)增部分具體操作參照SMARTer⑥RACE 5'/3'試劑盒說明書。

1.2.4PCR產(chǎn)物克隆及測序

用凝膠回收試劑盒回收目的片段，將回收產(chǎn)物連人pTOPO載體，轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)，后篩選陽性克隆。每種病毒隨機(jī)選取2～4個陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.5ASGV全長基因組序列的一致性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用DNAMAN 9軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接、組裝，校正后，通過NCBI BLASTn工具在GenBank數(shù)據(jù)庫中對獲得的序列進(jìn)行同源序列檢索，用SDTv．1.2軟件和MEGA 7.0軟件分析ASGV-XJ分離物與已報道的其他分離物基因組間的序列（表2）一致性和親緣關(guān)系。采用Clustal W算法對序列進(jìn)行比對，鄰接法（NJ）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，自展校正值為1000;并以50%為閾值顯示系統(tǒng)發(fā)育樹，櫻桃病毒A（cherry virus A，CVA）美國櫻桃分離物全長基因組作為外參（NC003689）。

2結(jié)果與分析

2.1高通量測序結(jié)果與分析

經(jīng)高通量測序結(jié)果及生物信息學(xué)分析，4組樣品中有2組檢測到了病毒（表3）。從SI樣品中獲得了8條與ASPV同源的序列，與參考序列MZ148024.1的序列相似性為67%～94%。從S2樣品中獲得了1條與ASPV同源的序列，其長度為293nt，與參考序列M2148024.1的序列相似性為87.6%;1條與ACLSV同源的序列，長度為203 nt，與參考序列M2126498.1的序列相似性為93.5%。然而，獲得的病毒序列較短，相應(yīng)病毒基因組序列的覆蓋率較低。

2.2ACLSV、ASPV、ASGV的RT-PCR檢測

為進(jìn)一步驗(yàn)證高通量測序結(jié)果，對所有新疆野蘋果樣品（127份）進(jìn)行RT-PCR檢測，均檢測到ACLSV和ASPV。此外，考慮到除ACLSV和ASPV外，ASGV也是侵染蘋果的常見病毒之一。因此，也檢測了所有樣品是否含有ASGV?？倷z出率分別為22%（ACLSV）、19.7%（ASPV）、11%（ASGV）（圖1）。

2.3新疆野蘋果上3種病毒PCR產(chǎn)物的序列測定及比較分析

將這3種病毒的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和克隆、測序，將所得序列與GenBank中相關(guān)病毒的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行比對，在核苷酸水平上的相似性為84%～99%，在氨基酸水平上的相似性為80%～100%，進(jìn)一步證實(shí)了ACLSV、ASPV、ASGV的侵染。

2.4ASGV基因組的擴(kuò)增

通過基因組的擴(kuò)增、克隆和測序，獲得了ASGV新疆野蘋果分離物的基因組全長序列，暫時命名為ASGV-XJ。ASGV-XJ基因組的長度為6506nt，5＇和3＇非翻譯區(qū)長度分別為46nt和142nt。含2個重疊的開放閱讀框ORF1和ORF2。ORFI（47-6364nt）編碼分子量約241kD的多聚蛋白，包括2個保守結(jié)構(gòu)域，分別為復(fù)制酶區(qū)域（MTR、P-PRO、HEL和RdRp）和外殼蛋白（CP）；ORF2（4798-5760nt）編碼分子量約36 kD的移動蛋白（MP）。

2.5ASGV與其他分離物間的基因組序列一致性和系統(tǒng)發(fā)育分析

應(yīng)用SDT軟件分析了ASGV-XJ與已報道的其他分離物基因組間的核酸一致性，為81.1%～90.1%，其中與ASGV中國柑橘分離物（AY646511.1）一致性最低，與ASGV中國蘋果分離物（KX686100.1） 一致性最高。

應(yīng)用MEGA7．0軟件，基于全長基因組序列構(gòu)建的進(jìn)化樹被分為2個組（圖2）。組工包含14個分離物，可以進(jìn)一步分成3個亞組，新疆野蘋果分離物（ASGV-XJ）位于組工的亞組Ⅲ，ASGV-XJ與中國蘋果的分離物（KX686100.1）聚在同一分支。組Ⅱ包括6個分離物，分成2個不同分支，構(gòu)成2個亞組。

3結(jié)論與討論

新疆野蘋果既是非常重要的種質(zhì)資源，也是一些蘋果種植區(qū)常用的砧木材料，其保護(hù)和使用愈受重視。但目前主要關(guān)注蘋果小吉丁蟲Agrilus mali的危害，而很少考慮病毒的影響。我們發(fā)現(xiàn)新疆野蘋果會被我國蘋果上最常見的3種病毒（ACLSV、ASPV和ASGV）侵染。對ASGV新疆野蘋果分離物（ASGV-XJ）基因組進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增，將獲得ASGV-XJ的全基因組序列與已報道的其他分離物基因組間的核酸一致性為81.1%～90.1%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，系統(tǒng)發(fā)育樹分成2個組，ASGV-XJ與中國蘋果的分離物ASGV-XY（KX686100.1）聚在同一分支，分離物間沒有表現(xiàn)出寄主專一性和地理分布規(guī)律，這為新疆野蘋果的保護(hù)和利用帶來了重要啟示。保護(hù)方面，雖然這3種病毒在蘋果上通常是潛隱性的，而且在調(diào)查中也未發(fā)現(xiàn)明顯的癥狀，但不能排除病毒侵染導(dǎo)致植株早衰，或其他病蟲害更易發(fā)生的可能；利用方面，若利用帶毒植株作砧木，則會造成病毒的擴(kuò)散和蔓延，影響蘋果生產(chǎn)。因此，無論是保護(hù)還是利用，均需要加強(qiáng)病毒的檢測。此外，考慮到新疆野果林是較為獨(dú)立的區(qū)域，而這3種病毒均無傳毒媒介，那么本研究的結(jié)果則提出了新疆野蘋果上的病毒來源問題。未來這一問題的闡明應(yīng)該有助于深入了解這3種病毒的傳播及進(jìn)化。