吳瀟彤，史延，李爽，王少華，張坤

（浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江省奶牛遺傳改良與乳品質(zhì)研究重點實驗室，浙江 杭州 310058）

長期經(jīng)高強度選育的荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性能已得到顯著提升[1]，但問題也隨之而來，高產(chǎn)奶牛的繁殖效率比較低。影響奶牛繁殖效率的因素有很多，比如品種、環(huán)境、飼養(yǎng)管理、繁殖技術(shù)、疾病等[2]，這些因素可能會導(dǎo)致受精失敗、早期胚胎發(fā)育阻滯、遺傳缺陷或流產(chǎn)。因此，對牛胚胎發(fā)育調(diào)控的研究有助于開發(fā)相關(guān)措施，提高奶牛繁殖效率。

哺乳動物的發(fā)育起始于高度分化的配子（精子和卵細胞）結(jié)合形成受精卵，歷經(jīng)6～7 次（以牛為例）有絲分裂后，單細胞的受精卵逐步發(fā)育成囊胚（受精后6～7 d，圖1）。隨后，囊胚到達子宮并在受精后19～21 d著床，進一步發(fā)育成胎兒。正常的早期胚胎發(fā)育是后續(xù)胎兒成功發(fā)育的前提（本文所指的早期胚胎發(fā)育階段特指受精后胚胎發(fā)育到囊胚期的過程）。因此，早期胚胎發(fā)育過程中誘導(dǎo)胚胎分化的調(diào)控機制是目前早期胚胎發(fā)育研究的熱點。

圖1 小鼠和牛早期胚胎發(fā)育過程中的形態(tài)變化及關(guān)鍵生物學(xué)事件Fig.1 Morphological changes and key biological events during early embryonic development in mice and cattle

早期胚胎發(fā)育主要依靠母源mRNA 和蛋白質(zhì)，直到合子基因組激活（zygotic genome activation,ZGA）的發(fā)生（小鼠為2細胞期，牛為8—16細胞期）。隨后胚胎形態(tài)發(fā)生變化，卵裂球由先前的松散狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛ハ鄩嚎s的緊實狀態(tài)，即致密化。同時，細胞形成頂端-基底軸，胚胎極性由此建立[3]。細胞極性建立和不對稱分裂對于胚胎后續(xù)的發(fā)育至關(guān)重要。在桑葚胚期，位于滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm, TE）細胞基底膜區(qū)域的鈉鉀泵將含Na+的液體泵入TE 細胞外間隙，形成多個微腔，隨著Na+不斷積累，形成滲透梯度，液體持續(xù)泵入微腔，直至達到細胞外間隙的承受閾值，多個微腔破裂形成一個充滿液體的囊胚腔[4]，標志著囊胚的形成。在囊胚形成前后，早期胚胎大致發(fā)生2 次細胞譜系分化，最終形成3 種類型的胚層細胞——TE細胞、原始內(nèi)胚層（primitive endoderm, PE）細胞、上胚層（epiblast, EPI）細胞。多種信號通路參與胚胎細胞譜系分化，如Hippo、Notch、Wnt、MEK/ERK通路等。本文從胚胎形態(tài)變化、轉(zhuǎn)錄因子以及細胞信號通路等角度，綜述牛和小鼠早期胚胎發(fā)育過程中細胞譜系分化的調(diào)控。

1 早期胚胎發(fā)育過程中的胚胎形態(tài)變化

哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程中形態(tài)變化相似，但發(fā)育進程差異較大，關(guān)鍵生物學(xué)事件如ZGA、致密化等發(fā)生的時間存在差異（圖1）。

1.1 早期卵裂

精卵結(jié)合形成受精卵意味著早期胚胎發(fā)育的開始，隨后受精卵不斷進行細胞分裂，此過程稱為“卵裂”。胚胎中卵裂球的分裂并不同步，因此在某些時刻胚胎中細胞數(shù)目為奇數(shù)。隨著分裂不斷進行，胚胎的細胞數(shù)目持續(xù)增加，但胚胎的體積變化不大[5]，為后續(xù)的胚胎致密化奠定基礎(chǔ)。此外，這一時期存在一個重要的生物學(xué)事件——ZGA。在ZGA 之前，合子基因組保持轉(zhuǎn)錄沉默，胚胎發(fā)育主要依靠母源mRNA 和蛋白質(zhì)。合子基因組正常激活后，大量母源mRNA 降解，只有部分母源mRNA編碼的蛋白質(zhì)可以在這一時期之后少量表達。小鼠和牛發(fā)生ZGA的時間并不相同。在小鼠中，次要ZGA 發(fā)生在胚胎1 細胞S 期到2 細胞G1 期[6]，此時合子基因轉(zhuǎn)錄水平較低且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物高度混雜[7]；主要ZGA發(fā)生在2細胞晚期，此時大量合子基因被激活并且開始轉(zhuǎn)錄；而在牛中，ZGA發(fā)生在8—16細胞期[8]（表1）。

表1 小鼠和牛早期胚胎發(fā)育時期和事件比較Table 1 Comparison of periods and events of early embryonicdevelopment between mice and cattle

1.2 致密化和極性化

胚胎在歷經(jīng)前幾輪分裂后，迎來一個重要的形態(tài)變化——胚胎致密化。哺乳動物中胚胎致密化發(fā)生的時間存在差異，小鼠胚胎致密化發(fā)生在8 細胞期[9]，而牛胚胎致密化發(fā)生在16—32 細胞期[10]（表1）。

致密化發(fā)生前，小鼠胚胎的微絨毛在卵裂球上均勻分布。當(dāng)小鼠胚胎發(fā)育至8 細胞期，微絨毛開始富集在細胞表面區(qū)域，此時，胚胎的頂端-基底軸開始形成。形成的頂端膜區(qū)域使卵裂球產(chǎn)生極性[3]，并使其進行不對稱分裂。子代通過不對稱分裂獲得頂端膜區(qū)域[11]，細胞極性得以維持。在小鼠胚胎發(fā)育至16細胞期時，內(nèi)部細胞表面的微絨毛分布稀疏，而外部細胞頂端膜區(qū)域的微絨毛分布密集[12]。在牛胚胎9—15 細胞期，部分卵裂球中微絨毛的分布出現(xiàn)極化，16細胞期之后細胞極化變得更加明顯[13]。埃茲蛋白（ezrin, EZR）負責(zé)連接膜蛋白和肌動球蛋白[14]。有研究認為，EZR 參與微絨毛的形成：胚胎致密化發(fā)生前，EZR 在細胞表面均勻分布；致密化發(fā)生后，磷酸化的EZR 開始聚集在細胞的頂端膜區(qū)域，隨著細胞不斷分裂，在16 細胞期EZR 只在外部細胞中表達[15]。在小鼠胚胎中，頂端膜區(qū)域的形成在細胞譜系分化過程中發(fā)揮重要作用，但在牛胚胎中，抑制頂端膜區(qū)域的形成不會影響囊胚發(fā)育[16]，說明早期胚胎發(fā)育過程中細胞譜系分化的調(diào)控機制具有物種特異性。

在胚胎的頂端膜區(qū)域，有大量蛋白酶激活受體（proteinase-activated receptors, PARs）復(fù)合體富集，包括PAR3、PAR6 和非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C, aPKC），在基底膜區(qū)域，有大量E-鈣黏蛋白（E-cadherin，又叫CDH1）和PAR1 富集。CDH1 參與細胞-細胞接觸點的黏著連接。在缺失CDH1 的胚胎中，外部細胞不能形成完整的上皮組織[17]。在分子水平上，富含CDH1 的絲狀偽足從黏著連接和頂端膜區(qū)域的邊緣向鄰近細胞的頂端膜區(qū)域延伸并與鄰近細胞緊密黏附[18]。在形態(tài)上，胚胎發(fā)生致密化時，卵裂球變得扁平，細胞界限變得模糊，細胞與細胞之間的接觸增加[19]。在非極性細胞中，頂端膜蛋白aPKC的含量低于極性細胞，肌球蛋白的收縮性高于極性細胞[3]，因此非極性細胞被周圍的極性細胞向胚胎內(nèi)部擠壓。隨著非極性細胞的內(nèi)化，極性和非極性細胞收縮性的差異逐漸增大[3]。胚胎致密化和極性化為囊胚腔的形成奠定了基礎(chǔ)。

1.3 囊胚腔的形成與擴張

細胞分裂和胚胎致密化持續(xù)進行，TE細胞持續(xù)壓縮，上皮組織對機械力的感應(yīng)持續(xù)增強，使細胞-細胞連接處逐漸成熟，即TE 細胞上皮組織逐漸成熟[20]。同時，基底膜區(qū)域的鈉鉀泵，即Na+/K+-ATP酶將液體泵入TE細胞外間隙，形成多個微腔[4]。液體持續(xù)泵入微腔使腔內(nèi)濃度高于腔外，形成滲透梯度，而滲透梯度又促使液體繼續(xù)泵入微腔，形成正反饋。當(dāng)腔內(nèi)液體累積達到微腔的承受閾值時，液體繼續(xù)泵入微腔會使微腔破裂，大量微腔破裂合并形成一個囊胚腔，隨后，破裂的細胞外間隙恢復(fù)密封狀態(tài)，微腔再次形成，如此循環(huán)往復(fù)，囊胚腔隨之?dāng)U張[20]。

2 關(guān)鍵基因與信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對胚胎細胞譜系分化的影響

早期胚胎大致經(jīng)過2次細胞譜系分化形成3類細胞（TE細胞、PE細胞和EPI細胞）譜系。最終，TE細胞分化為胎盤，PE細胞分化為卵黃囊，EPI細胞分化為胎兒。在早期胚胎發(fā)育過程中，第一次細胞譜系分化的正常進行是第二次細胞譜系分化成功進行的前提。其中，胚胎極性建立和不對稱分裂對第一次細胞譜系分化至關(guān)重要。針對第一次細胞譜系分化過程，科學(xué)家提出了多種假說。這些假說本質(zhì)上相互關(guān)聯(lián)，共同調(diào)控第一次細胞譜系分化并指導(dǎo)第二次細胞譜系分化。

2.1 “極性假說”

哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程中，由單個細胞分裂而來且形態(tài)相似的細胞卻擁有不同的細胞命運。細胞命運為何不同？細胞分裂方式為何不同？細胞位置為何有內(nèi)外之分？基于這些疑問，科學(xué)家提出了多種模型。其中一個模型是“內(nèi)-外假說”，該假說強調(diào)細胞所處位置是決定細胞命運的主要因素[21]。胚胎外側(cè)細胞發(fā)育為TE 細胞，內(nèi)側(cè)細胞發(fā)育為內(nèi)細胞團（inner cell mass, ICM）。另外一個模型是“極性假說”，該假說認為細胞極性的建立誘導(dǎo)細胞分化命運[11]。細胞極性形成后產(chǎn)生2種分裂方式，當(dāng)細胞的分裂方向平行于頂端-基底軸時，發(fā)生對稱分裂，產(chǎn)生2 個具有極性的子代細胞；而當(dāng)細胞的分裂方向垂直于頂端-基底軸時，發(fā)生不對稱分裂，產(chǎn)生1 個極性子代細胞和1 個無極性的子代細胞。

這些假說相互關(guān)聯(lián)，協(xié)同決定細胞命運。例如，從ICM 分離出的細胞可以形成具有極性的TE細胞[22]。極性蛋白aPKC 和PAR3 可通過調(diào)節(jié)細胞間的緊密連接蛋白來影響胚胎細胞間的黏附性[23]，其表達受阻會使外部細胞保持外側(cè)位置的競爭力下降，從而發(fā)生內(nèi)化。由此，胚胎致密化會增加細胞間接觸，促進細胞黏附蛋白表達，從而促進細胞極化[24]。然而，細胞極化受阻會影響細胞的不對稱分裂，引起細胞錯誤定位，使細胞分化過程混亂。胚胎頂端膜區(qū)域受損雖不影響牛囊胚形成，但會導(dǎo)致小鼠胚胎的TE細胞和ICM細胞分化失敗[25]，說明在牛胚胎中有其他途徑參與調(diào)節(jié)細胞分化。

2.2 第一次細胞譜系分化

Hippo信號通路由胚胎致密化和頂端極性蛋白啟動，如血管動蛋白（angiomotin, AMOT）和神經(jīng)纖維瘤蛋白亞型2（neurofibromin 2, NF2），并且胚胎內(nèi)部細胞和外部細胞會獲得不同的Hippo 信號，產(chǎn)生不同的命運，說明細胞極性和不對稱分裂影響Hippo通路的活性[26]。抑制AMOT不會影響牛囊胚發(fā)育[27]。在小鼠胚胎內(nèi)部細胞中，AMOT 分布于細胞-細胞連接處，位于AMOT N 端結(jié)構(gòu)域的第176位絲氨酸殘基被大腫瘤抑制激酶1/2（large tumor suppressor kinase 1/2, LATS1/2）磷酸化后，會抑制肌動蛋白的活性，從而激活Hippo通路[28]；而在外部細胞中，AMOT 位于細胞頂端膜區(qū)域，與肌動蛋白互作，抑制Hippo通路。哺乳動物不育系20樣激酶1/2（mammalian sterile twenty-like kinase 1/2, MST1/2）和LATS1/2 是Hippo 信號通路的核心級聯(lián)組件。在牛早期胚胎中，MST1/2 在細胞質(zhì)中表達且功能冗余，在抑制細胞增殖、促進細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用。同時，敲除Mst1/2會導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育阻滯[29]。Lats1/2參與小鼠胚胎ICM的形成，并調(diào)控細胞分化命運[30]。

首先，Hippo 通路上游因子AMOT 等被激活，MST1/2 與 支 架 蛋 白SAV1（salvador family WW domain containing protein 1）和調(diào)節(jié)支架蛋白MOB1（MOB kinase activator 1）結(jié)合形成復(fù)合物，使LATS1/2磷酸化[31]。隨后，磷酸化的LATS1/2使胚胎內(nèi)部細胞中的Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associated protein,YAP）/具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, TAZ）磷酸化。磷酸化的YAP/TAZ滯留在細胞質(zhì)，不能作為轉(zhuǎn)錄共激活因子與內(nèi)部細胞核中的TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子4（TEA domain transcription factor 4, TEAD4）結(jié)合，內(nèi)部細胞的多能性得以維持。Hippo 通路在胚胎外部細胞中則保持沉默，未被磷酸化的YAP/TAZ 進入細胞核與TEAD4 結(jié)合，促使外部細胞分化為TE 細胞。在小鼠胚胎中，敲低Lats1/2會導(dǎo)致內(nèi)部細胞核中的YAP 表達升高[30]。TAZ 始終在細胞質(zhì)表達[32]，并且抑制YAP 表達不會影響囊胚發(fā)育[33]。在牛胚胎中，TAZ不僅持續(xù)在細胞質(zhì)表達，還在囊胚期部分卵裂球的細胞核中表達，敲低TAZ不會影響牛囊胚率，但會使TE細胞數(shù)顯著下降[34]。抑制YAP1會導(dǎo)致牛囊胚率下降[27]。因此，YAP 和TAZ作為連接LATS 激酶和下游轉(zhuǎn)錄因子TEAD4 的橋梁，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

TEAD4是小鼠胚胎TE細胞分化的上游調(diào)控因子，卻不是牛胚胎TE細胞形成和分化所必需的。在牛早期胚胎中，16 細胞期TEAD4轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)，桑葚胚期TEAD4大量表達[35]，囊胚期TE細胞和ICM細胞中均有TEAD4表達，且TE 細胞中TEAD4mRNA 水平高于ICM 細胞[36]。利用RNA 干擾抑制TEAD4 表達時，胚胎仍能發(fā)育至囊胚[36]，并且OCT4（organic cation/carnitine transporter 4）、NANOG（Nanog homeobox）、GATA3（GATA binding protein 3）和CDX2（caudal type homeobox 2）的表達均不受影響[35]，說明在牛早期胚胎發(fā)育過程中有其他途徑調(diào)控CDX2，如TFAP2C（transcription factor AP-2 gamma）就可以誘導(dǎo)CDX2表達[37]。

細胞通信網(wǎng)絡(luò)因子2（cellular communication network factor 2, CCN2）由4個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域組成：胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor binding protein, IGFBP）結(jié)構(gòu)域、血管性血友病C 型（von willebrand type C, vWC）重復(fù)序列、血小板反應(yīng)蛋白（thrombospondin, TSP）重復(fù)序列和含有半胱氨酸基元的C 端（C-terminal, CT）結(jié)構(gòu)域[38]。在牛胚胎中，敲低CCN2會導(dǎo)致TEAD4及多能因子OCT4和NANOG的表達顯著下降，敲低TEAD4會導(dǎo)致CCN2的表達顯著下降，說明TEAD4和CCN2相互作用，共同調(diào)節(jié)牛胚胎TE 細胞的分化[36]。

在小鼠早期胚胎中，抑制Tead4后，胚胎不能形成囊胚腔，Cdx2和Gata3表達下降，Oct4和Nanog未受影響[39]。在小鼠胚胎干細胞中，TEAD4僅在細胞質(zhì)中表達，而在小鼠滋養(yǎng)外胚層干細胞中，細胞質(zhì)和細胞核中均有TEAD4表達[40]。由此推測，TEAD4在內(nèi)部細胞核中表達會阻礙TE細胞和ICM細胞的分離，影響囊胚形成；反之，內(nèi)部細胞中TE 細胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序會遭到破壞，導(dǎo)致內(nèi)部細胞向ICM 細胞分化[40]。由此可見，在牛和小鼠早期胚胎中，TEAD4的表達模式及對下游轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控存在差異。

TE細胞的標記基因CDX2在TE細胞的形成和維持中發(fā)揮重要作用。在牛胚胎中，ICM 細胞中CDX2的轉(zhuǎn)錄水平低于TE細胞[41]，敲低CDX2后，TE細胞數(shù)、ICM 細胞數(shù)和總細胞數(shù)保持不變，多能因子SOX2（SRY-box transcription factor 2）和OCT4的表達和定位不受影響[42]，TE 細胞標記基因IFNT（interferon-tau）和KRT8（keratin 8）的表達也不受影響[43]，GATA3的表達下降。此外，敲低CDX2雖不影響牛囊胚形成，但會使囊胚發(fā)育延遲，以及使TE細胞上皮組織的完整性遭到破壞[43]，說明CDX2對牛胚胎TE 細胞的形成雖不是必需的，但對維持TE細胞的完整性至關(guān)重要。有觀點認為，?；蛭稽c在染色體區(qū)域的位置影響其在譜系分化過程中的表達，如在CDX2和NANOG高表達時期，其基因位點傾向于分布在染色體區(qū)域的外側(cè)[44]。此外，YAP 在細胞中的定位與CDX2 的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)有關(guān)，且CDX2在細胞核中的表達滯后于YAP[45]。Wnt 家族成員3A（Wnt family member 3A, WNT3A）可能通過WNT-YAP/TAZ 信號通路激活和調(diào)節(jié)CDX2[46]。在小鼠胚胎中，敲除合子Cdx2不會影響囊胚發(fā)育，然而，敲除母源-合子Cdx2會造成TE細胞分化混亂甚至小鼠胚胎死亡[47]，說明合子Cdx2不是TE 細胞形成所必需的，而母源Cdx2對TE 細胞的分化至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎中，Cdx2和細胞極性相互作用可以調(diào)控細胞核的位置，比如，在進行不對稱分裂的細胞中，細胞核位于細胞基底區(qū)域，而在進行對稱分裂的細胞中，細胞核位于細胞頂端區(qū)域，CDX2表達升高，細胞核向頂端區(qū)域移動[48]。

H1FOO（H1 histone family member O, oocytespecific）是連接組蛋白1（linker histone 1, H1）的一個變體蛋白，其表達始于卵母細胞，ZGA 后被合子H1 取代[49]。連接組蛋白的氨基酸序列具有高度可變性，導(dǎo)致物種間H1FOO 序列存在差異。在小鼠胚胎中，敲低H1foo會使胚胎延遲進入2細胞期，但過表達H1foo并不影響胚胎發(fā)育[50]。在牛中，敲低H1FOO后，胚胎停滯在桑葚胚期[51]，譜系分化因子CDX2、GATA3、KRT8和極性相關(guān)基因AMOT、EZR的表達均下降，抑制性染色質(zhì)標記因子H3K9me3和H3K27me3 的含量上升，開放性染色質(zhì)標記因子H4K16ac 的含量下降；過表達H1FOO后，牛的囊胚率下降約50%[50]，說明H1FOO通過調(diào)節(jié)細胞分化和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)參與牛早期胚胎發(fā)育調(diào)控。

Notch信號通路在物種間高度保守，并在細胞分化和凋亡等方面發(fā)揮重要作用[52]。在經(jīng)典的Notch信號通路中，配體（Delta-like 1/3/4 和Jagged 1/2）和受體（Notch 1/2/3/4）結(jié)合，通過蛋白酶解激活Notch受體，釋放Notch 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch intracellular domain, NICD）。隨后，NICD進入細胞核與轉(zhuǎn)錄效應(yīng)器RBPJ（recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region）結(jié)合，招募其他共激活因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，從而發(fā)揮調(diào)控作用[51]。在小鼠中，Notch 信號通路在4 細胞期被激活，并且只在TE細胞中活躍，說明Notch信號通路在第一次細胞譜系分化過程中發(fā)揮重要作用[53]。干擾Notch 信號通路會影響囊胚發(fā)育，促使SOX2表達下降[54]。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠囊胚中，Notch 信號通路與Hippo信號通路共同調(diào)控CDX2 在TE 細胞中的特異性表達[53]：Notch、Hippo信號與CDX2上游的增強子結(jié)合，NICD/RBPJ 與SBNO1（Strawberry Notch homolog 1）結(jié)合，從而激活CDX2[55]。在牛胚胎中，NOTCH1mRNA 的表達在受精后顯著上升，在2 細胞期達到峰值，隨后逐漸下降，在桑葚胚期和囊胚期其表達均較低。RBPJ 在卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中持續(xù)表達，在8 細胞期之前，RBPJ 在細胞核和細胞質(zhì)內(nèi)均表達；在16細胞期及之后，RBPJ僅在細胞核中表達。敲低NOTCH1，牛的囊胚率顯著下降，CDX2、TFAP2A和H1FOO表達下降。敲低RBPJ雖然不影響牛囊胚形成，但形成的囊胚較小，且總細胞數(shù)減少[51]。以上研究說明，Notch 信號通路通過調(diào)控H1FOO，參與牛卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程調(diào)控。牛和小鼠胚胎第一次細胞譜系分化過程見圖2。

圖2 小鼠和牛胚胎第一次細胞譜系分化Fig.2 First cell lineage differentiation in mice and cattle embryos

2.3 第二次細胞譜系分化

在第二次細胞譜系分化過程中，ICM細胞進一步分化為EPI細胞和PE細胞。EPI細胞表達大量多能因子，如NANOG、SOX2等，這些因子在維持細胞多能性方面起到至關(guān)重要的作用。PE 細胞表達大量促進與維持PE 細胞分化的因子，如GATA4/6、SOX17、PDGFRA（platelet-derived growth factor receptor alpha）等，這些因子相互作用共同調(diào)控EPI細胞和PE細胞的分化。

在胚胎內(nèi)部細胞中，OCT4 對維持胚胎多能性和調(diào)節(jié)細胞分化起到重要作用。在牛卵母細胞中，OCT4轉(zhuǎn)錄本水平較低，ZGA后其表達水平升高，致密化階段其轉(zhuǎn)錄水平急劇升高[56]。盡管ZGA 前期能檢測到OCT4和SOX2轉(zhuǎn)錄本，但未能檢測到相應(yīng)蛋白[57]，說明牛胚胎中OCT4與ZGA 的關(guān)聯(lián)可能不密切。牛胚胎的TE 細胞和ICM 細胞中均有OCT4表達，且敲除牛合子OCT4后，胚胎仍能表達OCT4，表明母源OCT4在牛早期胚胎發(fā)育過程中對維持OCT4表達發(fā)揮一定作用[58]，敲除OCT4后仍能形成囊胚，SOX2和GATA6的表達不受影響，NANOG和SOX17的表達被抑制[59]。在敲除OCT4的牛胚胎中表達外源成纖維細胞生長因子4（fibroblast growth factor 4, FGF4）時，NANOG 和SOX17 不能恢復(fù)表達[59]，說明在牛胚胎中OCT4對維持EPI細胞多能性和PE 細胞分化發(fā)揮重要作用，CDX2 最初與OCT4共定位，但在囊胚期能觀察到明顯的譜系分離[60]。在小鼠早期胚胎中，OCT4 處于多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心[58]，OCT4 和CDX2 相互抑制以調(diào)控TE 細胞和ICM 細胞的分化。小鼠OCT4 存在TFAP2C 結(jié)合位點，可以抑制CDX2 的表達，而牛OCT4 不存在TFAP2C結(jié)合位點[61]，說明OCT4在牛和小鼠胚胎中的功能存在差異。

在牛胚胎中，SOX2表達始于16細胞期，囊胚期時SOX2在ICM細胞中特異性表達。敲除SOX2后，在蛋白質(zhì)水平上，NANOG 和OCT4 的表達均顯著下降[62]。NANOG表達始于8—16細胞期[60]，在早期囊胚中，NANOG 在TE 細胞和ICM 細胞中均有表達。敲除NANOG后，胚胎形成較小的囊胚腔，GATA6遷移至ICM 細胞中表達，SOX2和GATA6的表達下降，CDX2的表達不受影響[63]，說明NANOG在TE細胞分化中無明顯作用，但在EPI細胞、PE細胞的分化和多能性的維持方面發(fā)揮重要作用。在敲除NANOG的牛胚胎中，抑制促分裂原活化的蛋白激酶激酶［mitogen-activated protein kinase (MAPK)kinase, MEK］會導(dǎo)致胚胎死于囊胚期前，這與在小鼠胚胎中的情況相似[64]；表達FGF4 不能完全恢復(fù)SOX17 的表達，這與在小鼠胚胎中的情況相反[64]。在牛早期胚胎中，NANOG和GATA6在ICM細胞中呈現(xiàn)“椒-鹽”分布模式[58]。GATA6在牛胚胎的ICM細胞和TE細胞均有表達[65]。

在牛胚胎中，F(xiàn)GF 激活下游促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）誘導(dǎo)細胞分化[66]。敲低成纖維細胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2）后，牛胚胎中NANOG和GATA6的表達不受影響，HNF4A（hepatocyte nuclear factor 4 alpha）的表達顯著下降，并且EPI細胞和PE前體細胞數(shù)目不受影響[67]。抑制牛卵母細胞FGF10表達會阻礙囊胚發(fā)育，限制卵丘擴大[68]。有研究發(fā)現(xiàn)，微RNA（microRNA, miRNA）在調(diào)控牛胚胎多能性方面發(fā)揮重要作用。例如，miR-218 直接調(diào)節(jié)CDH2和NANOG的表達，并且能在ICM細胞中調(diào)節(jié)NANOG以響應(yīng)FGF 信號通路[69]。抑制牛胚胎的MAPK會促進內(nèi)細胞團中NANOG的表達，抑制GATA6的表達，而SOX2和OCT4的表達不受影響[70]。雙重抑制牛胚胎的MAP2K 和GSK3（glycogen synthase kinase 3）時，F(xiàn)GF4和NANOG的表達升高，PDGFRA和SOX1的表達降低，細胞類型由PE 細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镋PI 細胞[71]，說明MAP2K 和GSK3 可以促進細胞向PE細胞分化。

牛胚胎中SOX17表達始于16—32細胞期，最初，SOX17與NANOG共表達，在囊胚后期表達開始分離，抑制MEK 信號后，SOX17的表達在囊胚期下降[71]。激活Wnt 信號會 促 進ICM 細胞中OCT4、NANOG、SOX2和KLF4（KLF transcription factor 4）的表達，抑制TE 細胞中CDX2的表達[72]，說明Wnt信號對細胞向EPI細胞分化起到一定作用。激活素A 促進囊胚發(fā)育，抑制NANOG和SOX2的表達，促進CDX2和GATA6的表達[73]，說明激活素A 促使細胞向PE 細胞分化[73]。此外，在JAK/STAT3（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 3）通路中，磷酸化的STAT3 與SOX2、NANOG 在細胞核共定位，且JAK被抑制后SOX2的表達顯著下降，ICM 細胞中未檢測到磷酸化的STAT3[74]，說明JAK/STAT3對于EPI細胞的分化起到重要作用。在小鼠胚胎中，PE細胞和EPI細胞的分化依賴于FGF/MAP信號，干擾ERK 會抑制GATA4/6 的表達[75]。敲低轉(zhuǎn)錄因子SMARCA5（SWI/SNF related,matrix associated,actin dependent regulator of chromatin,subfamily a,member 5），OCT4在TE細胞和ICM細胞中表達，且SOX17 和NANOG 的表達降低，EPI 細胞和PE 細胞的分化受到影響[76]，說明SMARCA5對小鼠EPI細胞和PE 細胞的分化起到一定作用。牛和小鼠胚胎的第二次細胞譜系分化見圖3，牛和小鼠早期胚胎發(fā)育生物學(xué)機制比較見表2。

表2 小鼠和牛早期胚胎發(fā)育生物學(xué)機制比較Table 2 Comparison of biological mechanisms at early embryonic development between mice and cattle

圖3 小鼠和牛胚胎第二次細胞譜系分化Fig.3 Second cell lineage differentiation in mice and cattle embryos

3 結(jié)語

迄今為止，大部分關(guān)于哺乳動物胚胎發(fā)育的研究以小鼠為模型進行。由于存在種間差異，不同物種的胚胎發(fā)育模式存在差異。哺乳動物胚胎都要歷經(jīng)從受精卵到2 細胞、4 細胞、8 細胞、桑葚胚、囊胚等時期的形態(tài)轉(zhuǎn)變，而各時期的持續(xù)時間、相同生物學(xué)事件的發(fā)生時期、轉(zhuǎn)錄因子的表達模式、轉(zhuǎn)錄因子的互作等在不同物種間存在差異。

哺乳動物早期胚胎發(fā)育是一系列動態(tài)變化的過程，包括物理變化和化學(xué)變化。物理變化指胚胎形態(tài)發(fā)生改變，主要與2個生物學(xué)事件相關(guān)，包括胚胎致密化和極性化以及囊胚腔的形成?；瘜W(xué)變化指關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄本的變化，合子基因組激活使胚胎內(nèi)的基因表達發(fā)生劇烈變化，大部分母源基因降解，合子基因?qū)崿F(xiàn)由沉默到轉(zhuǎn)錄爆發(fā)的轉(zhuǎn)變，從而調(diào)控后續(xù)發(fā)育。胚胎發(fā)育受到多種因素的影響，如細胞微環(huán)境、細胞所處位置、細胞極性和機械力的感知等，這些因素可能相互作用共同調(diào)控胚胎發(fā)育，因而在分析某一現(xiàn)象時不能孤立看待某一因素。此外，由于種間差異，基于小鼠的研究不能完全照搬運用于其他物種，因此，有必要對其他物種的胚胎發(fā)育進行研究以及進行物種間胚胎發(fā)育比較，拓展對哺乳動物胚胎發(fā)育的認知。