張鑫,朱青永,徐慧敏,吳夢園,陳小娥,陳啟和,劉政捷,*
(1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 舟山 316022;2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310058)
黃綠卷毛菇(Floccularia luteovirens)又稱黃蘑菇、黃金菇、黃綠蜜環(huán)菌,屬于擔(dān)子菌門、傘菌綱、傘菌目、傘菌科、卷毛菇屬,是一種珍貴的食藥兩用菌[1]。黃綠卷毛菇主要分布在西藏、青海等地的草原或者高山草甸上[2],在我國著名醫(yī)學(xué)著作《四部醫(yī)典》中就有明確記載,外敷或者內(nèi)服黃綠卷毛菇可以治療寒性和不發(fā)熱的腫脹[3]。至今,祁連地區(qū)的牧民還有通過食用黃綠卷毛菇治療感冒的習(xí)俗。有研究發(fā)現(xiàn),黃綠卷毛菇干制子實(shí)體中含有大量粗蛋白、粗脂肪、脂肪酸和氨基酸等營養(yǎng)成分[4-6]。研究人員在黃綠卷毛菇子實(shí)體提取物中發(fā)現(xiàn)了多糖、甾醇、核黃素、凝集素等多種單體化合物,其表現(xiàn)出良好的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生理活性[7-9]。LIU 等[10]首次報道了黃綠卷毛菇的完整基因組序列,并對預(yù)測到的基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了原伊魯烷型倍半萜芳基酯生物合成基因簇。但是到目前為止,還鮮見關(guān)于黃綠卷毛菇子實(shí)體中此類化合物提取工藝優(yōu)化及活性研究的報道。
按照碳骨架類型分類,原伊魯烷型倍半萜芳基酯屬于三環(huán)倍半萜,這類化合物主要從高等真菌中分離得到,也有少部分來源于海洋動植物[11]。據(jù)前人報道,其酯類衍生物對萵苣的生長具有明顯的抑制作用并存在劑量效應(yīng)關(guān)系[12],在慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁小鼠模型中表現(xiàn)出顯著的抗抑郁活性[13]。從蜜環(huán)菌中提取出的原伊魯烷型倍半萜芳基酯可以通過分子靶向方式,抑制5-脂氧合酶的合成,從而降低哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏性鼻炎等疾病的發(fā)病風(fēng)險[14]。MISIEK 等[15]在蜜環(huán)菌中分離出7 種原伊魯烷型倍半萜芳基酯,并結(jié)合液相色譜/質(zhì)譜(liquid chromatography/mass spectrometry, LC/MS)與核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)分析分子量與分子結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其在體外表現(xiàn)出良好的抗真菌活性。BOHNERT等[16]同樣從蜜環(huán)菌中分離出原伊魯烷型倍半萜芳基酯,并對其抗真菌活性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該化合物的抗真菌能力取決于部分雙鍵的位置。LI等[17]在蜜環(huán)菌與附球菌共同培養(yǎng)的發(fā)酵液內(nèi)分離純化出新型原伊魯烷型倍半萜芳基酯結(jié)構(gòu)類似物,其在體外表現(xiàn)出較好的細(xì)胞毒性與乙酰膽堿酯酶抑制活性。原伊魯烷型倍半萜芳基酯來源豐富、結(jié)構(gòu)多樣,近年來已經(jīng)成為食品及藥品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
本研究以黃綠卷毛菇子實(shí)體為原料,以原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量為指標(biāo),研究不同溶劑對提取量的影響;并通過超聲波輔助提取法,在單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法分析,優(yōu)化原伊魯烷型倍半萜芳基酯的提取工藝。同時,采用體外抗氧化實(shí)驗及抑菌實(shí)驗探究黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯的生物活性,以期為后續(xù)黃綠卷毛菇相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。
黃綠卷毛菇購自青海省海北藏族自治州祁連縣;2,4-二羥基苯甲酸甲酯(分析純)、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)均購自上海麥克林生化科技有限公司;抗壞血酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.7%)、水楊酸、30%過氧化氫(H2O2)、乙酸乙酯、環(huán)己烷、石油醚、氯仿均為分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌由浙江大學(xué)陳啟和教授贈予。
BSA224S-CW 電子天平購自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;UV-5900紫外可見分光光度計購自上海元析儀器有限公司;SK5210HP 超聲波清洗機(jī)購自上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司;N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海愛朗儀器有限公司;5804R 臺式高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司。
1.3.1 原料預(yù)處理
將黃綠卷毛菇子實(shí)體凍干,經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后,過80目網(wǎng)篩,密封、避光保存于4 ℃冰箱中,備用。
1.3.2 原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取工藝流程
稱取一定量的黃綠卷毛菇子實(shí)體粉末并加入有機(jī)溶劑,用保鮮膜封口防止溶劑揮發(fā),放入超聲波清洗機(jī)中,在不同的料液比、超聲時間、超聲功率、超聲溫度下進(jìn)行提取,超聲結(jié)束后以8 000 r/min離心10 min,上清液即為黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取液。
1.3.3 原伊魯烷型倍半萜芳基酯的純化
采用硅膠柱層析法,樣品與硅膠(100~200目)按質(zhì)量比1∶1 吸附上樣,用20 倍體積硅膠(200~300目)裝柱,用石油醚-乙酸乙酯(按體積比50∶1→20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1→0∶1)梯度洗脫,得到7 個流分(Fr.1~Fr.7)。將流分Fr.3 經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜進(jìn)一步分離,用氯仿-甲醇(體積比1∶1)洗脫,流速為1 mL/min,共得到4 個流分(Fr.3-1~Fr.3-4),合并Fr.3-2 后旋干溶劑,得到黃綠卷毛菇中純化的原伊魯烷型倍半萜芳基酯。
1.3.4 原伊魯烷型倍半萜芳基酯含量的測定
精確稱取0.001 g 2,4-二羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中,加入乙酸乙酯定容至刻度線,得到0.1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別移取母液100、200、400、600、800、1 000 μL,并用乙酸乙酯補(bǔ)充至5 mL。充分搖勻后,以乙酸乙酯為空白對照,于260 nm波長處測定吸光度值,以2,4-二羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程:Y=52.532X+0.007 8,R2=0.999 6。取原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取液于260 nm 波長處測定吸光度值,按公式(1)計算黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量[C/(μmol/g)][18]。
C=(c×V×N)/m.(1)
式中:c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取液濃度,μmol/L;V為提取液總體積,mL;N為稀釋倍數(shù);m為黃綠卷毛菇子實(shí)體粉末質(zhì)量,g。
為探究不同有機(jī)溶劑對原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量的影響,采用石油醚、環(huán)己烷-乙酸乙酯(體積比3∶1)、乙酸乙酯3 種溶劑各40 mL,采用
1.3.2 節(jié)中的方法對黃綠卷毛菇子實(shí)體粉末進(jìn)行超聲波輔助提?。ǔ晻r間30 min、超聲溫度25 ℃、超聲功率270 W)。
精確稱取1.000 g黃綠卷毛菇子實(shí)體粉末,以原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量為指標(biāo),參考SHAHIDI[19]的報道,選取超聲時間10、20、30、40、50 min,超聲功率108、135、162、189、216 W,超聲溫度20、30、40、50、60 ℃,以及料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(質(zhì)量體積比)進(jìn)行提取,考察不同因素在不同水平下對原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量的影響。
根據(jù)單因素實(shí)驗結(jié)果,選取料液比(A)、超聲時間(B)、超聲功率(C)3 個因素為自變量,以原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量(Y)作為響應(yīng)值,使用Design-Expert 11 軟件,依據(jù)Box-Benhnken 中心組合實(shí)驗設(shè)計原理設(shè)計響應(yīng)面實(shí)驗,以優(yōu)化原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取工藝條件。響應(yīng)面實(shí)驗各因素與水平見表1。
表1 響應(yīng)面實(shí)驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments
1.7.1 DPPH 自由基清除率測定
精確稱取DPPH 0.001 0 g,加入24 mL 無水乙醇,超聲5 min 使其充分溶解,配制成DPPH 工作液。在預(yù)實(shí)驗的基礎(chǔ)上,取5 支試管加入濃度為4.00 mmol/L的原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取液(樣品),體積分別為200、400、600、800、1 000 μL,每管再分別加入2 mL DPPH 工作液與1 mL 無水乙醇,在黑暗條件下反應(yīng)30 min,反應(yīng)結(jié)束后在517 nm波長處測定溶液吸光度值,參比溶液為無水乙醇。以同濃度抗壞血酸為陽性對照,以乙酸乙酯為空白對照,每個濃度樣品平行測定3 次,根據(jù)公式(2)計算DPPH自由基清除率[20]。
式中:D1表示樣品中加入DPPH 工作液反應(yīng)后的溶液吸光度值;D2表示以無水乙醇代替DPPH 工作液反應(yīng)后的溶液吸光度值;D0表示以乙酸乙酯代替樣品時空白對照的吸光度值。
1.7.2 羥自由基清除率測定
在比色管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液1 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL和去離子水12 mL,最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL,充分搖勻后置于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min,反應(yīng)結(jié)束后在510 nm波長處測定溶液吸光度值,參比溶液為不加H2O2體系。按上述方法用濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L的原伊魯烷型倍半萜芳基酯(樣品)代替去離子水,參比溶液為去離子水。以同濃度抗壞血酸為陽性對照,以乙酸乙酯為空白對照。每個濃度樣品平行測定3次,根據(jù)公式(3)計算羥自由基清除率[21]。
對比兩組患者臨床療效和治療前后銀屑病嚴(yán)重程度以及血清干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)水平。(1)臨床療效:無效:療效指數(shù)<30%;一般:療效指數(shù)30%~59%;有效:療效指數(shù)>60%[7];(2)銀屑病嚴(yán)重程度:采用銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)評價,得分越低表示銀屑病嚴(yán)重程度越低[8]。
式中:D3表示加入FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液、H2O2溶液、樣品和去離子水反應(yīng)后的溶液吸光度值;D4表示加入FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液、樣品反應(yīng)后的溶液吸光度值;D′0表示以乙酸乙酯代替樣品時空白對照的吸光度值。
采用打孔法測定原伊魯烷型倍半萜芳基酯的抑菌活性[22],以大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌為指示菌。將凍存的上述3種菌株接種至Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化,隨后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,用接種環(huán)挑取活化后的單菌落接種至LB 液體培養(yǎng)基中,調(diào)整菌液濃度為1×106CFU/mL,備用。3種菌液分別與LB固體培養(yǎng)基混合后倒入平板中,待凝固后用滅菌的牛津杯(內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm)在平板上打孔,每個平板打3個孔,每孔中加入100 μL 0.40 mmol/L原伊魯烷型倍半萜芳基酯,用封口膜封好后置于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h,以加入乙酸乙酯為陰性對照,以加入同濃度的硫酸慶大霉素為陽性對照,測定抑菌圈直徑以評估原伊魯烷型倍半萜芳基酯的抑菌活性。
實(shí)驗均重復(fù)3次,結(jié)果取平均值,采用Microsoft Excel 2019、Design-Expert 11和Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖。
提取溶劑的極性影響著提取物的產(chǎn)率,根據(jù)相似相溶的原則,可以通過改變?nèi)軇┑臉O性來影響倍半萜化合物的溶解度,這對提取工藝的優(yōu)化影響顯著[23]。對比3種不同極性溶劑中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量,結(jié)果(圖1)表明,提取量排序為乙酸乙酯>環(huán)己烷-乙酸乙酯(體積比3∶1)>石油醚,采用乙酸乙酯提取的原伊魯烷型倍半萜芳基酯含量最高,故后續(xù)實(shí)驗選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。
圖1 不同溶劑對原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量的影響Fig.1 Effects of different solvents on extraction contents of protoilludane sesquiterpene aryl esters
2.2.1 料液比對提取量的影響
如圖2A所示,料液比在1∶20~1∶60(質(zhì)量體積比)范圍內(nèi)時,原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量在料液比1∶30時達(dá)到最大,這可能是由于溶劑與黃綠卷毛菇子實(shí)體粉末在此比例下接觸面積最大,原伊魯烷型倍半萜芳基酯溶出率高。隨著溶劑比例的不斷增加,提取量呈下降趨勢,原因可能是大部分原伊魯烷型倍半萜芳基酯成分已經(jīng)溶出,溶劑比例不斷增加導(dǎo)致其他化合物溶出增多,從而抑制了倍半萜類成分析出,使其含量降低[24]。
圖2 不同因素對黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量的影響Fig.2 Effects of different factors on the extraction contents of protoilludane sesquiterpene aryl esters from F. luteovirens
2.2.2 超聲時間對提取量的影響
如圖2B 所示,超聲時間設(shè)定在10~50 min 范圍內(nèi)時,原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量呈先升高后降低的趨勢,并在30 min時達(dá)到最大。隨著超聲時間的延長提取量下降,原因可能是剛開始超聲時,溶劑還未滲透進(jìn)黃綠卷毛菇子實(shí)體組織內(nèi),后續(xù)隨著超聲時間延長,超聲波的機(jī)械振動導(dǎo)致黃綠卷毛菇細(xì)胞壁被破壞,原伊魯烷型倍半萜芳基酯與其他雜質(zhì)一同被提取出來,從而導(dǎo)致該倍半萜類成分提取量降低[25]。
2.2.3 超聲溫度對提取量的影響
溫度是影響生物活性成分提取的一個重要因素,溫度的升高可以導(dǎo)致細(xì)胞壁軟化,增加物質(zhì)的溶解度和擴(kuò)散系數(shù),從而改變提取效率[19]。如圖2C所示,超聲溫度設(shè)定在20~60 ℃范圍內(nèi)時,隨著超聲溫度的升高,原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量呈先降低后升高的趨勢,并在40 ℃時提取量最低,60 ℃時提取量最高,但與20 ℃時相差不大。從節(jié)約能源的角度考慮,后續(xù)實(shí)驗選擇在20 ℃條件下進(jìn)行。
2.2.4 超聲功率對提取量的影響
如圖2D 所示,超聲功率設(shè)定在108~216 W 范圍內(nèi)時,原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量隨著超聲功率的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,并在162 W時達(dá)到最大。推測原因是超聲功率的不斷增大會導(dǎo)致提取液溫度升高,在超聲功率高于162 W 時可造成部分乙酸乙酯揮發(fā),影響了原伊魯烷型倍半萜芳基酯的溶出[26]。因此,選擇超聲功率162 W 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。
2.3.1 實(shí)驗設(shè)計與結(jié)果
根據(jù)Box-Behnken 中心組合實(shí)驗設(shè)計原理,綜合單因素實(shí)驗結(jié)果,選取料液比、超聲時間、超聲功率進(jìn)行3因素3水平共17個實(shí)驗分析。利用Design-Expert 11 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,得到的二次多項回歸方 程 為:Y=10.09+0.434 1A+0.198 1B+0.200 5C-0.701 3A2-0.297 8B2-0.559 5C2+0.076 2AB+0.063 5AC-0.134 5BC(R2=0.988 6),實(shí)驗設(shè)計及結(jié)果見表2。
表2 Box-Behnken中心組合實(shí)驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken center combination experiment design and results
2.3.2 方差分析結(jié)果
由表3 可以看出,該回歸模型p<0.000 1,說明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義,可以用作提取工藝實(shí)驗的優(yōu)化。失擬項p>0.05,說明該模型擬合程度較好,實(shí)驗誤差小。決定系數(shù)R2=0.988 6,表明自變量(料液比、超聲時間、超聲功率)與因變量(原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量)的關(guān)系顯著。校正系數(shù)Radj=0.974 0,說明該模型可以解釋97.40%的響應(yīng)值變化。一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2對因變量影響極顯著(P<0.01),交互項AB、AC對因變量無顯著影響(P>0.05)。根據(jù)F值[27]可知,各因素對原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量的影響排序為A(料液比)>C(超聲功率)>B(超聲時間)。
表3 響應(yīng)面實(shí)驗的方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of response surface experiments
2.3.3 響應(yīng)面分析結(jié)果
通過Design-Expert 11 軟件分析,得到黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量和各因素交互作用的響應(yīng)面。如圖3 所示,可以清晰地看到A(料液比)、B(超聲時間)、C(超聲功率)3因素兩兩之間的響應(yīng)面均為開口向下的上凸曲面,說明在曲面上存在極大值。隨著料液比、超聲功率的增加和超聲時間的延長,原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。響應(yīng)面的平緩或陡峭程度可以反映各實(shí)驗因素對響應(yīng)值影響的強(qiáng)弱程度,響應(yīng)面坡度越陡峭,則該因素值的改變對響應(yīng)值的影響越大[28]。從圖3 可知,料液比、超聲時間、超聲功率的交互曲面陡峭,且等高線呈橢圓形,表明各因素兩兩間相互作用明顯,對原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量有積極影響。
圖3 原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量與各因素(超聲時間、超聲功率和料液比)交互作用的響應(yīng)面與等高線Fig.3 Response surfaces and contours of interactions between the extraction contents of protoilludane sesquiterpene aryl esters and factors (ultrasonic time, ultrasonic power and solid-liquid ratio)
2.3.4 最佳提取工藝實(shí)驗驗證
根據(jù)回歸方程求解,得出原伊魯烷型倍半萜芳基酯最佳提取工藝為:料液比1∶33.355(質(zhì)量體積比)、超聲時間33.408 min、超聲功率166.250 W。根據(jù)實(shí)際情況,調(diào)整實(shí)驗條件為料液比1∶33(質(zhì)量體積比)、超聲時間33 min、超聲功率166 W。在此條件下測定原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量,平行測定3次,實(shí)驗結(jié)果顯示其提取量為10.107 μmol/g,與預(yù)測值接近,證明此模型可以用于黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取工藝的優(yōu)化。
2.4.1 DPPH 自由基清除作用
DPPH 是一種穩(wěn)定的氮中心自由基,它在乙醇溶液中呈現(xiàn)深紫色,在517 nm 波長處有吸收峰,并且在加入抗氧化劑后會變成無色或者淡黃色[29]。如圖4A 所示,原伊魯烷型倍半萜芳基酯(樣品)與抗壞血酸均可清除DPPH自由基。隨著樣品添加量的增加,DPPH自由基的清除率逐漸增加,最大添加量下清除率達(dá)到(62.60±1.88)%,而抗壞血酸(陽性對照)的最大清除率為(99.64±0.91)%。結(jié)果表明,原伊魯烷型倍半萜芳基酯具有較好的DPPH自由基清除能力。與李雷等[30]從紅花中提取出的倍半萜對映異構(gòu)體相比,本實(shí)驗結(jié)果中DPPH 自由基清除率更高,說明倍半萜化合物有較好的抗氧化能力。
圖4 黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯(樣品)對自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effects on radicals of protoilludane sesquiterpene aryl esters (samples) from F. luteovirens
2.4.2 羥自由基清除作用
羥自由基是一種比較活潑的自由基,利用H2O2與Fe2+反應(yīng)生成具有高反應(yīng)活性的羥自由基,加入水楊酸后在510 nm波長處測定溶液吸光度值,若實(shí)驗樣品具有清除羥自由基的能力,則吸光度值會逐漸降低[31]。由圖4B所示,羥自由基清除率隨樣品濃度的增加而增大,最大清除率達(dá)到(95.99±1.74)%,清除效果明顯優(yōu)于抗壞血酸(陽性對照),說明原伊魯烷型倍半萜芳基酯可有效減少羥自由基的產(chǎn)生。推測原因可能是原伊魯烷型倍半萜芳基酯與水楊酸相比競爭羥自由基的能力更強(qiáng),而抗壞血酸自身氧化生成的H2O2反而使溶液顯色程度增加,導(dǎo)致羥自由基的數(shù)量增加。
體外抑菌實(shí)驗結(jié)果(表4)表明,原伊魯烷型倍半萜芳基酯對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌均有抑制作用。參考李宇等[32]研究中對抗生素抑菌活性的界定:高度敏感,抑菌圈直徑>20 mm;中度敏感,抑菌圈直徑10~20 mm;輕度敏感或耐藥,抑菌圈直徑<10 mm。根據(jù)抑菌圈直徑分析,硫酸慶大霉素溶液(陽性對照)對3種供試菌株的抑制效果均為高度敏感。原伊魯烷型倍半萜芳基酯對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的抑制效果為中度敏感,抑菌圈直徑分別為15.7、16.1 mm,對大腸埃希菌的抑制能力相對較弱,抑菌圈直徑為9.4 mm。此結(jié)果與文獻(xiàn)[33]中所報道的原伊魯烷型倍半萜芳基酯對革蘭氏陽性菌活性抑制能力更強(qiáng)的結(jié)果一致,原因可能是分子構(gòu)型上羥基或雙鍵的位置不同,導(dǎo)致該倍半萜化合物對不同菌種的抑菌能力產(chǎn)生差異。
表4 黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯的抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of protoilludane sesquiterpene aryl esters from F. luteovirens
黃綠卷毛菇是一種珍稀的食藥兩用菌,其子實(shí)體中的活性成分具有很高的研究價值,不同的提取工藝對活性成分的提取效率有明顯影響。本研究發(fā)現(xiàn),原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量隨著溶劑極性的增大而升高。出現(xiàn)這種情況的原因可能是倍半萜內(nèi)酯中帶有鹵素原子和極性官能團(tuán),其在乙酸乙酯中的溶解度要比在石油醚中高,所以使用極性較高的溶劑更有利于此類化合物的溶出。SIDDIQUI等[34]在嘗試了幾種溶劑組合后,選擇用正己烷-乙酸乙酯(體積比3∶1)對香樟葉中的倍半萜內(nèi)酯進(jìn)行提取,優(yōu)化提取率為1.01%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。TRENDAFILOVA等[35]對土木香中2種倍半萜內(nèi)酯的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,通過不斷改變?nèi)軇┑臉O性,發(fā)現(xiàn)70%乙醇溶液為最佳提取溶劑。對比前人的研究,鮮見有人使用極性較低的溶劑進(jìn)行提取,本研究的結(jié)果與之一致。與SIDDIQUI 等[34]和TRENDAFILOVA 等[35]研究不同的是,本研究所選用的材料為菌類而非植物,但本研究的實(shí)驗結(jié)果與之基本一致,說明不同物種間的倍半萜內(nèi)酯具有一定的相似性。同樣的,李英迪等[36]從猴頭菇中提取三萜類化合物時發(fā)現(xiàn),通過增加溶劑的極性可以提高三萜類化合物的提取效率。綜上所述,本研究最終選用乙酸乙酯作為黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯的提取溶劑。
目前對黃綠卷毛菇子實(shí)體的研究多集中在多糖、蛋白質(zhì)和核黃素的提取方法優(yōu)化及活性分析等方面,而在萜類化合物方面鮮有報道。本研究首次利用超聲波輔助法提取黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯,并進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗以優(yōu)化提取工藝,發(fā)現(xiàn)原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量在超聲波的輔助下得到顯著提升。TIAN 等[37]利用超聲波輔助法提取雙孢蘑菇中的多糖,得到了相同的結(jié)論,即在超聲波的物理力作用下可加劇蘑菇子實(shí)體細(xì)胞的破壞程度,促使子實(shí)體內(nèi)物質(zhì)的溶出,從而提升物質(zhì)提取效率。SANTOS等[38]利用超聲波輔助法提取巴西燭樹中倍半萜時,發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲功率和超聲溫度一定時,倍半萜含量隨著料液比的增加表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢,在料液比為1∶15(質(zhì)量體積比)時提取量達(dá)到最大,與之相比本研究的最佳料液比為1∶33(質(zhì)量體積比),所需溶劑更多。出現(xiàn)這種差異的原因可能是菌類細(xì)胞壁中的木質(zhì)素含量遠(yuǎn)高于植物,木質(zhì)素可阻礙活性物質(zhì)的滲出[39]。調(diào)整料液比可以給材料和溶劑提供更大的接觸面積,材料溶脹程度增加有利于提取物的溶出。本研究中原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量的影響因素與ABOUHEIF 等[40]使用超聲波輔助法提取銀杏葉中的萜內(nèi)酯時基本相同,在超聲時間為36.63 min時萜內(nèi)酯的提取量達(dá)到最大,本研究結(jié)果與之基本一致,不同的是銀杏葉中萜內(nèi)酯的最佳提取溫度為57.58 ℃。造成差異的因素可能是在提取過程中各類組織細(xì)胞中成分不同,溫度會使萜類化合物發(fā)生分解或聚合,進(jìn)而影響提取效率。本研究中,在最優(yōu)提取工藝下原伊魯烷型倍半萜芳基酯提取量可達(dá)到10.107 μmol/g,與優(yōu)化前相比有較大提升,表明超聲波輔助提取法可有效提高原伊魯烷型倍半萜芳基酯的提取量,且兼具快捷、高效和低成本等優(yōu)點(diǎn),具有良好的應(yīng)用前景。
有研究從荔枝果皮中分離純化出2種倍半萜類化合物[41],并且發(fā)現(xiàn)其鐵離子還原能力(FRAP)、DPPH 自由基清除能力明顯優(yōu)于果皮中其他成分。本研究結(jié)果表明,原伊魯烷型倍半萜芳基酯具有一定的抗氧化能力。原伊魯烷型倍半萜芳基酯的DPPH自由基清除率最高可達(dá)(62.60±1.88)%,羥自由基清除率最高可達(dá)(95.99±1.74)%,與AIT OUAHIOUNE等[42]從長角豆中提取得到的倍半萜化合物的抗氧化性相似。這可能是由于原伊魯烷型倍半萜芳基酯具有較好的提供氫離子的能力,其與自由基上的不成對電子結(jié)合后展現(xiàn)出抗氧化性,這一發(fā)現(xiàn)也為未來食品天然抗氧化劑的開發(fā)提供了新思路。
原伊魯烷型倍半萜芳基酯對3種供試菌株均有抑制效果,對大腸埃希菌輕度敏感,對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌中度敏感。對比實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),原伊魯烷型倍半萜芳基酯對革蘭氏陽性菌的抑菌能力更強(qiáng),革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁含有的化學(xué)物質(zhì)不同可能是造成這一差異的因素。原伊魯烷型倍半萜芳基酯對革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的破壞程度更大,可導(dǎo)致其內(nèi)容物外泄進(jìn)而致其死亡。對比DUAN等[43]從毛韌革菌中提取出的倍半萜類化合物的抑菌效果,本研究中原伊魯烷型倍半萜芳基酯的抑菌效果更好。據(jù)MASYITA等[44]報道,植物精油中含有豐富的單帖和倍半萜等活性成分,對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌等具有明顯抑制效果。結(jié)合KUDUMELA等[45]的研究結(jié)果,說明從菌類和植物中提取的倍半萜類化合物可以作為未來抗生素的重要來源,但其具體的抑菌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
本研究通過對比3種溶劑對黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳基酯的提取結(jié)果,發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯為佳提取溶劑。隨后采用響應(yīng)面法對超聲波輔助提取原伊魯烷型倍半萜芳基酯的工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳提取工藝為料液比1∶33(質(zhì)量體積比)、超聲時間33 min、超聲功率166 W,在此條件下提取量達(dá)到10.107 μmol/g,表明超聲波輔助法對原伊魯烷型倍半萜芳基酯的提取具有顯著的提升效果??寡趸钚苑治霭l(fā)現(xiàn),原伊魯烷型倍半萜芳基酯對DPPH自由基和羥自由基有較好的清除能力,最大清除率分別為(62.60±1.88)%和(95.99±1.74)%。本研究還發(fā)現(xiàn)原伊魯烷型倍半萜芳基酯對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌均有抑制作用,表明其有作為食品工業(yè)中的天然抗氧化劑和防腐劑的潛力。本研究為黃綠卷毛菇中原伊魯烷型倍半萜芳香酯用于實(shí)際生產(chǎn)提供了理論支撐,拓展了黃綠卷毛菇的應(yīng)用范圍。