柳朔怡 顧全 李會平 戚桂杰 魯程緋

摘要：目的 分析雷氏普羅威登斯菌對碳青霉烯類藥物耐藥機制與氨基糖苷類藥物異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象的探索。 方法 對2016—2021年收集的4株多重耐藥的雷氏普羅威登斯菌（multidrug resistant Providencia Rettgeri， MRPRE）臨床分離株的耐藥性和攜帶的耐藥基因進行分析。采用異質(zhì)性耐藥菌譜分析與亞抑菌濃度抗生素誘導(dǎo)實驗探索慶大霉素異質(zhì)性耐藥菌株對氨基糖苷類和碳青霉烯類抗生素的適應(yīng)性耐藥。結(jié)果 本研究共收集4株MRPRE，其中3株檢出blaNDM-1基因，對碳青霉烯類高度耐藥，同時對第一、二、三代頭孢菌素、氨曲南、復(fù)方磺胺甲惡唑、喹諾酮類藥物耐藥。1株未檢出碳青霉烯酶基因，但對氨基糖苷類抗生素異質(zhì)性耐藥，在亞抑菌濃度慶大霉素誘導(dǎo)下，慶大霉素MIC值由8 ?g/mL上升至64 ?g/mL，亞胺培南MIC值由2 ?g/mL上升至8 ?g/mL，出現(xiàn)適應(yīng)性耐藥。結(jié)論 雷氏普羅威登斯菌可攜帶blaNDM-1對碳青霉烯類抗生素高度耐藥，同時表現(xiàn)對多種抗生素的多重耐藥。異質(zhì)性耐藥菌株在亞抑菌濃度慶大霉素誘導(dǎo)下可出現(xiàn)慶大霉素與亞胺培南的適應(yīng)性耐藥。

關(guān)鍵詞：雷氏普羅威登斯菌；碳青霉烯酶；新德里金屬酶；異質(zhì)性耐藥

中圖分類號：R372 ?文獻標(biāo)志碼：A

Analysis of carbapenem resistance and aminoglycoside heteroresistance mechanisms of Providencia rettgeri

Liu Shuoyi1， Gu Quan2， Li Huiping2， Qi Guijie1， and Lu Chengfei1

（1. Prenatal Diagnosis and Genetic Disease Diagnosis Center， Tangshan Maternal and Child Health Hospital， Tangshan 063000;

2. Tangshan Peoples Hospital， Tangshan 063000）

Abstract Objective To analyze the mechanism of carbapenem resistance and aminoglycoside heteroresistance of Providencia Rettgeri. Methods Four clinical isolates of multidrug resistant Providencia rettgeri（MRPRE） were collected from 2016 to 2021. Carbapenemase genes were determined by PCR and sequence analysis. Aminoglycoside heteroresistance was confirmed with population analysis profile. After pretreatment with sub-inhibitory concentration of gentamicin， the adaptive resistance of Providencia Rettgeri against aminoglycosides and carbapenems was observed. Results A total of four MRPRE strains were collected in this study. Three strains were highly resistant to carbapenems with blaNDM-1 gene. Meanwhile， they were resistant to cephalosporins， aztreonam， cotrimoxazole， and quinolones. One strain was negative for carbapenemase genes， but presented as aminoglycoside heteroresistance. After pretreatment with sub-inhibitory concentration of gentamicin， strains demonstrated adaptive resistance to gentamicin and imipenem. The MIC value of gentamicin increased from 8 to 64 ?g/mL， and that of imipenem increased from 2 to 8 ?g/mL. Conclusion We report three clinical strains of multidrug-resistant Providencia Rettgeri with blaNDM-1 gene. The adaptive resistance of Providencia Rettgeri against gentamicin and imipenem could be induced by the sub-inhibitory concentration of gentamicin in vivo.

Key words Providencia Rettgeri; Carbapenemase; New Delhi metallo-β-lactamase 1; Heteroresistance

普羅威登斯菌屬隸屬于變形菌門，γ-變形菌綱，腸桿菌目，目前已有10個分類種，分別為產(chǎn)堿普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens），大紅谷倉普羅威登斯菌（P. burhodogranariea），海恩巴赫普羅威登斯菌（P. heimbachae），雷極普羅威登斯菌（P. rettgeri），拉氏普羅威登斯菌（P. rustigianii），斯尼普羅威登斯菌（P. sneebia），斯氏普羅威登斯菌（P. stuartii），居線蟲普羅威登斯菌（P. vermicola），華西普羅威登斯菌（P. huaxiensis）和泰國普羅威登斯菌（P. thailandensis）。相較于腸桿菌科的其他屬，普羅威登斯菌較少引起院內(nèi)感染[1]，其中斯氏普羅威登斯菌和雷氏普羅威登斯菌在臨床較為普遍，其主要引起尿路感染與腹瀉，此外也有肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、傷口和血流感染相關(guān)報道[2]。近年來，國內(nèi)外屢有報道發(fā)現(xiàn)多重耐藥的普羅威登斯菌[3]。特別是攜帶blaNDM-1的普羅威登斯菌[4]，

其表現(xiàn)為對臨床首選抗感染藥物的泛耐藥性，包括對β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類和碳青霉烯類均表現(xiàn)高耐藥性。此外由于抗感染治療的失敗，亞抑菌濃度抗生素的誘導(dǎo)，普羅威登斯菌可對氨基糖苷類和喹諾酮類藥物出現(xiàn)異質(zhì)性耐藥。給臨床治療與院感控制帶來巨大挑戰(zhàn)。

本文在2016—2021年收集了4株多重耐藥的雷氏普羅威登斯菌（multidrug resistant Providencia Rettgeri， MRPRE）臨床分離株，對其耐藥性與耐藥基因進行分型，結(jié)合臨床感染資為臨床合理用藥與院感防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

實驗菌株分離自2016—2021年唐山市人民醫(yī)院臨床微生物檢驗標(biāo)本，采用VITEK 2 Compact鑒定并于-80 ℃甘油保存。質(zhì)控菌株霍氏腸桿菌（ATCC700323）與改良碳青霉烯滅活試驗輔助菌株（ATCC25922）購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（national center for nedical culture collections， CMCC）。

1.2 實驗儀器

血平板、MH平板購自鄭州安圖生物公司，K-B藥敏紙片與營養(yǎng)肉湯購自溫州康泰生物公司，抗生素粉末購自O(shè)xoid公司。VITEK 2 Compact以及配套生化鑒定卡（GN）和體外藥敏卡（GN09）購自生物梅里埃公司。西門子MicroScan WalkAway 96革蘭陰性菌藥敏板（Neg MIC 38）購自貝克曼公司。PCR實驗材料（Taq PCR Mix 預(yù)混體系）與引物合成購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 菌株鑒定與耐藥表型

菌株生化鑒定按VITEK 2.0 Compact全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)說明操作。擴增16S rRNA基因并測序進行基因鑒定，測序結(jié)果以Blast比對搜索Genbank數(shù)據(jù)庫。擴增引物為原核生物通用引物8F、1492R，65 ℃退火溫度，擴增程序參照文獻[5]。擴增產(chǎn)物Sanger測序交由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

菌株體外藥敏試驗按VITEK 2 Compact革蘭陰性菌體外藥敏卡（GN09）和西門子MicroScan WalkAway 96革蘭陰性菌藥敏板（Neg MIC 38）標(biāo)準(zhǔn)進行操作。異質(zhì)性耐藥表型采用K-B法測量，異質(zhì)性耐藥（heteroresistance， HR）表現(xiàn)為抑菌圈內(nèi)有菌落生長，非異質(zhì)性耐藥在抑菌圈內(nèi)無菌落生長，測量抑菌圈直徑后按照CLSI M100-S30判斷敏感性。

采用改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method， mCIM）聯(lián)合EDTA改良碳青霉烯滅活試驗（EDTA-carbapenem inactivation method， eCIM）對菌株產(chǎn)碳青霉烯酶類型進行補充試驗，操作與結(jié)果判讀依據(jù)為CLSI M100-S30。mCIM陽性、eCIM陰性提示試驗菌株攜帶絲氨酸型碳青霉烯酶；mCIM陽性、eCIM陽性提示試驗菌株攜帶金屬β-內(nèi)酰胺酶。

1.4 耐藥基因檢測

根據(jù)既有報道，對常見的絲氨酸碳青霉烯酶和金屬碳青霉烯酶進行擴增檢測[6]。具體基因名稱與引物信息見表1。blaKPC、blaVIM和blaIMP基因的擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。blaNDM和blaOXA-48基因的擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)目的片段大小的電泳條帶為陽性。陽性PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對確定基因分型。

1.5 異質(zhì)性耐藥菌譜分析（population analysis profile， PAP）

對慶大霉素出現(xiàn)異質(zhì)性耐藥的菌株進行異質(zhì)性耐藥菌譜分析，具體操作參考文獻[7]進行，具體參數(shù)按操作的微生物與藥物略有改動。配置0.5、1、2、4、8、16、32、64、128和256 ?g/mL慶大霉素抗性MH平板。配置菌液濃度至0.5×108 CFU/mL，并依次稀釋10～105倍，取100 ?L菌株涂布抗性MH平板置于35 ℃溫箱培養(yǎng)48 h，取菌落數(shù)在30～300 CFU平板進行計數(shù)并乘以菌液稀釋倍數(shù)計算實際菌落形成單位。以抗生素濃度做橫坐標(biāo)，實際菌落形成單位對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制PAP曲線。

1.6 慶大霉素和亞胺培南適應(yīng)性耐藥

對慶大霉素出現(xiàn)異質(zhì)性耐藥的菌株進行亞抑菌濃度慶大霉素誘導(dǎo)實驗。將臨床分離的初代細(xì)菌取單個菌落置于含有1 ?g/mL慶大霉素營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)，35 ℃溫箱大氣環(huán)境培養(yǎng)24 h后，離心棄上清，用0.45%生理鹽水重新懸濁配置0.75×

108 CFU/mL菌液，取1 ?L菌液再置于1 mL含有1 ?g/mL慶大霉素營養(yǎng)肉湯中進行誘導(dǎo)，其他菌液分別采用K-B法和微涼肉湯稀釋法（MIC）檢測慶大霉素與亞胺培南耐藥性。按上述方法循環(huán)誘導(dǎo)直至慶大霉素由異質(zhì)性耐藥轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆退帯?/p>

2 結(jié)果

2.1 菌株資料與鑒定結(jié)果

2016—2021年，一共收集到4株碳青霉烯類異質(zhì)性耐藥普羅威登斯菌，編號分別為TS2016023，TS2018019，TS2018121，TS2021057，菌株分離于臨床微生物檢驗標(biāo)本，經(jīng)VITEK 2 Compact鑒定為雷氏普羅威登斯菌，16S rRNA基因測序結(jié)果顯示與雷氏普羅威登斯菌模式菌株參考序列（DQ885263）相似度分別為99.6%，99.9%，99.9%和100%。菌株均來源于呼吸道標(biāo)本，其中1株（ST2021057）分離自神經(jīng)外科住院患者，其他3株分離自ICU住院患者。

2.2 菌株體外藥物敏感性實驗結(jié)果

VITEK 2 Compact體外藥敏試驗結(jié)果顯示所有菌株均表現(xiàn)對第一、二、三代頭孢菌素、氨曲南、復(fù)方磺胺甲惡唑和喹諾酮類藥物耐藥。TS2016023，TS2018019和TS2018121對亞胺培南、美羅培南耐藥。ST2021057對第四代頭孢（頭孢吡肟）表現(xiàn)為劑量依賴性敏感（susceptible-dose dependent， SDD），對氨基糖苷類藥物敏感性不定，其中慶大霉素為中介，妥布霉素耐藥，阿米卡星敏感。亞胺培南與美羅培南均為耐藥。MicroScan WalkAway 96體外藥敏試驗結(jié)果顯示亞胺培南中介，美羅培南為敏感。體外藥敏結(jié)果與具體MIC值見表2。K-B法體外藥敏結(jié)果顯示，ST2021057對慶大霉素、妥布霉素和阿米卡星均表現(xiàn)為異質(zhì)性耐藥，其在抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)針尖樣菌落，見圖1。

2.3 碳青霉烯類耐藥表型與耐藥基因檢測

3株碳青霉烯類異質(zhì)性耐藥普羅威登斯菌mCIM試驗與eCIM試驗同為陽性，提示其攜帶金屬碳青霉烯酶，ST2021057菌株mCIM試驗與eCIM試驗結(jié)果無法判定，見圖2。耐藥基因檢測結(jié)果顯示，3株雷氏普羅威登斯菌只檢出blaNDM-1基因，未發(fā)現(xiàn)其他碳青霉烯酶基因。測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，blaNDM基因同屬NDM-1型。ST2021057菌株未檢出任何碳青霉烯酶。

2.4 異質(zhì)性耐藥菌譜分析結(jié)果

ST2021057雷氏普羅威登斯菌慶大霉素PAP曲線如圖3所示，敏感對照菌大腸埃希菌（ATCC9922）在低抑菌濃度范圍內(nèi)被迅速殺滅，完全耐藥菌TS2016023可在較高濃度下保持穩(wěn)定生長。ST2021057曲線在敏感對照株和耐藥株之間，且曲線折點倍數(shù)大于8倍，可判斷為異質(zhì)性耐藥菌株。

2.5 慶大霉素和碳青霉烯類藥物適應(yīng)性耐藥結(jié)果

對ST2021057雷氏普羅威登斯菌經(jīng)過8輪亞抑菌濃度慶大霉素誘導(dǎo)實驗，該菌慶大霉素抑菌圈外環(huán)由

18 mm縮小至10 mm，亞胺培南抑菌圈由22 mm縮小至20 mm，并在抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)針尖樣異質(zhì)性耐藥菌落，見圖4。微量肉湯稀釋法結(jié)果顯示，ST2021057初代菌株慶大霉素MIC值為8 ?g/mL，亞胺培南MIC值為

2 ?g/mL，經(jīng)過8輪亞抑菌濃度慶大霉素誘導(dǎo)后，慶大霉素和亞胺培南MIC值分別為64 ?g/mL和8 ?g/mL，見圖5。

3 討論

耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（CRE），因其傳播速度快，感染治療周期長，抗菌藥物選擇有限，已經(jīng)成為臨床抗感染治療和院感防控的重大挑戰(zhàn)[8]。CRE主要以攜帶碳青霉烯酶基因水解碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥性[9]，該基因通常位于可結(jié)合質(zhì)粒上并與氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類等其他抗生素耐藥基因一同組成基因盒，從而形成快速水平傳播的能力[10]。攜帶blaNDM-1的大腸埃希菌最早在2008年發(fā)現(xiàn)于1名來自印度的瑞典患者，時至今日已在全球范圍內(nèi)形成大范圍流行，并迅速擴散至臨床常見感染菌株，如肺炎克雷伯、陰溝腸桿菌和銅綠假單胞菌等[11]。普羅威登斯菌是臨床常見院內(nèi)感染細(xì)菌，根據(jù)ABX指南，該菌在院內(nèi)獲得和長時間住院的感染比社區(qū)感染更為常見。特別是雷極普羅威登斯菌和斯氏普羅威登斯菌常引起嚴(yán)重的尿路感染與菌血癥[12]。攜帶blaNDM-1的雷極普羅威登斯菌國內(nèi)鮮有報道[13]。本文檢出3株攜帶blaNDM-1的雷極普羅威登斯菌，對β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類和磺胺類抗生素菌表現(xiàn)為耐藥，此外，普羅威登斯菌還對四環(huán)素、呋喃妥因、替加環(huán)素、多黏菌素呈天然耐藥，該類型普羅威登斯菌的出現(xiàn)將對臨床抗感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)。

細(xì)菌的異質(zhì)性耐藥（heteroresistance）通常是指某個單一分離菌株，在其培養(yǎng)的群體中存在著對某種藥物敏感性不同的亞群[14]。本研究檢出1株雷極普羅威登斯菌（TS2021057）對氨基糖苷類藥物存在異質(zhì)性耐藥，具體表現(xiàn)為其在氨基糖苷類藥物K-B法抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)針尖樣菌落，并且MicroScan WalkAway 96體外藥敏結(jié)果（微量肉湯稀釋法）和VITEK 2 Compact體外藥敏結(jié)果不一致。由于VITEK 2 Compact系統(tǒng)采用的是動態(tài)監(jiān)測讀數(shù)，將每15 min菌株在抗生素孔中的生長率比對數(shù)據(jù)庫，通過計算轉(zhuǎn)化生成對應(yīng)MIC值，該方法可能漏檢異質(zhì)性耐藥亞群導(dǎo)致儀器結(jié)果與K-B法和微量肉湯稀釋法不符[15]。異質(zhì)性耐藥是微生物在亞抑菌濃度抗生素選擇壓力下的一種適應(yīng)性策略。本研究觀察到1株雷極普羅威登斯菌（TS2021057）在亞抑菌濃度慶大霉素誘導(dǎo)下同時出現(xiàn)慶大霉素與亞胺培南體外敏感性下降。由于收集的菌株數(shù)量僅有1株，不能推斷該現(xiàn)象是否在普羅威登斯菌中普遍存在，其具體機制也尚不清楚。根據(jù)Dupont等[16]的研究報道，腸桿菌科細(xì)菌在接觸β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類等抗生素后出現(xiàn)一種應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為膜孔蛋白OmpF的低表達和OmpX的高表達，使細(xì)胞膜通透性改變。通過膜孔蛋白擴散的藥物主要有β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、四環(huán)素、氯霉素和氨基糖苷類等。在腸桿菌科細(xì)菌中OmpF的表達下調(diào)或缺失會影響細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素的攝取，并可導(dǎo)致細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素發(fā)生不同程度的耐藥[17]。根據(jù)Mariam等[18]的報道，普羅威登斯菌中也存在相似功能的孔膜蛋白Omp-Pst1和Omp-Pst2，其中Omp-Pst1被證實與β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類藥物的主動運輸有關(guān)[19]。細(xì)菌的異質(zhì)性耐藥為藥物對致病細(xì)菌的治療效果的評估帶來了很大困難，使自動化體外藥敏儀器數(shù)據(jù)的可靠性降低，不能為臨床提供準(zhǔn)確的用藥指導(dǎo)。不規(guī)范的臨床治療又導(dǎo)致異質(zhì)性耐藥菌株在亞抑菌抗生素濃度下篩選進化出適應(yīng)性耐藥菌株。因此，針對普羅威登斯菌的感染，除面對多重耐藥菌株帶來的挑戰(zhàn)，及早發(fā)現(xiàn)、正確處理異質(zhì)性耐藥也尤為重要。

普羅威登斯菌對黏菌素和替加環(huán)素具有天然耐藥性。攜帶blaNDM-1的普羅威登斯菌可對所有頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素均表現(xiàn)耐藥。此外異質(zhì)性耐藥可使氨基糖苷類抗生素敏感性迅速下降。這使得臨床治療與根除多重耐藥的普羅威登斯菌感染十分困難。微生物檢驗部門需有效監(jiān)測碳青霉烯酶基因，及早發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性耐藥菌株，臨床科室合理使用抗生素，做好院感防控措施，多部門聯(lián)合協(xié)作對預(yù)防和控制多重耐藥的普羅威登斯菌至關(guān)重要。

參 考 文 獻

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