周飛 李小鳳 梁媛 李潔 姜波 單斌 宋貴波

摘要：目的 研究耐碳青霉烯類抗生素銅綠假單胞菌分子流行病學(xué)規(guī)律及耐藥機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療銅綠假單胞菌的感染提供理論依據(jù)。方法 對(duì)多中心收集的耐碳青霉烯類抗生素銅綠假單胞菌（carbapenems-resistant Pseudomonas aeruginosa， CRPA）開(kāi)展多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing， MLST）和遺傳信息研究，并對(duì)碳青霉烯酶基因與外膜孔蛋白OprD編碼基因進(jìn)行序列分析。結(jié)果 多位點(diǎn)序列分型方法將81株CRPA分為36個(gè)ST型，總體以ST3390（41.98%，34/81）為主，其中有5種為新發(fā)現(xiàn)的ST型別；CRPA菌株中碳青霉烯酶基因的檢出率較高（65.43%，53/81），尿液標(biāo)本檢出率最高（80.00%，28/35），其中IMP、VIM和NDM型碳青霉烯酶基因檢出率分別為37.04%、27.16%和1.23%，未檢測(cè)到KPC、GES、SPM和OXA-40型碳青霉烯酶基因；oprD基因的序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，高達(dá)96.29%（78/81）CRPA臨床分離株發(fā)生了各種類型的突變，以單個(gè)或者多個(gè)堿基的插入或缺失為主（76.54%，62/81）。結(jié)論 81株CRPA主要的耐藥機(jī)制為膜孔蛋白基因突變和產(chǎn)碳青霉烯酶；存在ST3390克隆株的局部流行，應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)院感染防控措施，防止暴發(fā)流行。

關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌；分子流行病學(xué)；多位點(diǎn)序列分型；碳青霉烯類抗生素；耐藥機(jī)制

中圖分類號(hào)：R378.99+1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Molecular epidemiological and drug resistance characteristics of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in Kunming

Zhou Fei1，2，3， Li Xiao-feng1，2，3， Liang Yuan1，2，3， Li Jie1，2，3， Jiang Bo1，2，3， Shan Bin1，2，3， and Song Gui-Bo1，2，3

（1 Department of Clinical Laboratory of the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650032;

2 Yunnan Key Laboratory of Laboratory Medicine， Kunming 650032; 3 Yunnan Province Clinical Research Center

for Laboratory Medicine， Kunming 650032）

Abstract Objective To explore the molecular epidemiology and drug resistance mechanism of carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa （CRPA）， and to provide theoretical basis for clinical prevention and treatment of Pseudomonas aeruginosa infection. Methods Multilocus sequence typing （Multilocus Sequence Typing， MLST） and genetic information of carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa collected from multiple centers were studied， and the sequences of carbapenemase gene and outer membrane porin OprD coding gene were analyzed. Results ? ?81 strains of CRPA were divided into 36 ST types by multilocus sequence typing. The ST3390 （41.98%， 34/81） was the main type， and five ST types were newly discovered. The carbapenemase gene in CRPA strains was higher （65.43%， 53/81）， especially in urine samples （80.00%， 28/35）， of which IMP， VIM， and NDM carbapenemase enzyme genes were 37.04%， 27.16%， and 1.23%， respectively， and KPC， GES， SPM， and OXA-40 carbapenemase genes were not detected. Up to 96.29% （78/81） of the CRPA clinical isolates had various types of mutations in the gene oprD， which were dominated by single or multiple base insertions or deletions （76.54%， 62/81）. Conclusion The main drug resistance mechanisms of 81 strains of CRPA are porin gene mutation and carbapenemase production. There is a local epidemic of ST3390 clone， prevention and control measures should be strengthened to prevent outbreaks.

Key words Pseudomonas aeruginosa; Molecular epidemiology; MLST; Carbapenem antibiotics; Drug resistance mechanism

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa， PA）廣泛分布于自然界以及健康人的皮膚、腸道和呼吸道，是一類重要的革蘭陰性條件致病菌[1]。它是引發(fā)院內(nèi)感染的重要病原體，也是導(dǎo)致免疫功能低下患者高死亡率的重要原因[2]。近年來(lái)由于亞胺培南和美羅培南等碳青霉烯類藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致耐碳青霉烯類抗生素銅綠假單胞菌（carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa， CRPA）在世界范圍內(nèi)廣泛流行[3]。據(jù)CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)（（http：//www.chinets.com）顯示，2021年全國(guó)24035株銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為23.0%和18.9%，耐藥形勢(shì)不容樂(lè)觀。

CRPA通常只對(duì)黏菌素有效，加大了感染后臨床治療的難度[4]。流行病學(xué)研究確定了耐碳青霉烯類抗生素銅綠假單胞菌感染的相關(guān)危險(xiǎn)因素和多種耐藥機(jī)制，如醫(yī)療設(shè)備的使用、抗生素濫用、碳青霉烯酶的產(chǎn)生、多藥外排泵的過(guò)度表達(dá)、膜孔蛋白的丟失和生物膜形成等[5-6]。而碳青霉烯酶的產(chǎn)生是銅綠假單胞菌獲得碳青霉烯類耐藥性的最重要機(jī)制之一，它可以水解碳青霉烯類在內(nèi)的大部分抗生素，并可以通過(guò)各種遺傳元件水平獲得各種耐藥基因，使其可在同種或不同種屬菌株之間克隆傳播[7]。然而，銅綠假單胞菌可以通過(guò)獲得編碼碳青霉烯酶的可轉(zhuǎn)移基因獲得對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥性，而其高克隆多樣性通常會(huì)導(dǎo)致酶型攜帶的差異，如ST111分離株就被發(fā)現(xiàn)有很高的IMP-9和VIM-2流行率[8]，表明銅綠假單胞菌存在克隆株的地區(qū)分布差異和遺傳背景差異，因此有必要詳細(xì)的分析CRPA在各個(gè)地區(qū)的流行病學(xué)規(guī)律、分子特點(diǎn)和遺傳特征，才能更好的為銅綠假單胞菌的臨床預(yù)防策略和精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。本研究選取昆明地區(qū)兩家三甲醫(yī)院收集的CRPA菌株，從MLST分型、耐藥基因分析到種群結(jié)構(gòu)分析，以全面揭示該地區(qū)CRPA菌株的分子耐藥特征和遺傳特征。

1 材料與方法

1.1 菌株收集與藥敏分析

收集2017年1月—2021年2月期間分別從昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和第二附屬醫(yī)院臨床標(biāo)本中部分檢出并分離的耐碳青霉烯類抗生素銅綠假單胞菌（carbapenems-resistant Pseudomonas aeruginosa，CRPA）共81株。菌株納入標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)亞胺培南、美羅培南中至少一種耐藥，剔除同一患者相同部位檢出的重復(fù)菌株。銅綠假單胞菌ATCC27853作為質(zhì)控菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存。參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作程序》，使用全自動(dòng)微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)和VITEK2 Compact微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)鑒定及藥敏分析，采用多黏菌素藥物敏感性檢測(cè)及臨床解讀專家共識(shí)[9]判讀多黏菌素B的藥敏結(jié)果，其余的12種抗生素藥敏結(jié)果采用CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀。本研究已通過(guò)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理研究委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：L-20/2021）。

1.2 MLST分型

參照Curran等[10]在前人的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出的用于銅綠假單胞菌的MLST方案，其方案是通過(guò)擴(kuò)增銅綠假單胞菌內(nèi)部的7個(gè)管家基因（acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE），然后通過(guò)測(cè)序后的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分配出相應(yīng)的7個(gè)等位基因號(hào)，上傳等位基因號(hào)后輸出對(duì)應(yīng)的序列型別（sequence type， STs）。本研究中將陽(yáng)性擴(kuò)增子送到北京博邁德基因技術(shù)有限公司運(yùn)用Sanger法進(jìn)行雙向測(cè)序，將測(cè)序所得的等位基因譜（acsA-aroE-guaA-mutL-nuoD-ppsA-trpE）上傳至PubMLST管家基因數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubmlst.org/organisms/），從而確定序列型別（ST）。

1.3 PCR檢測(cè)碳青霉烯酶基因及膜孔蛋白基因oprD

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根，北京）提取細(xì)菌DNA。合成特異性引物并分別對(duì)碳青霉烯酶基因（A類：blaKPC和blaGES；B類：blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaNDM；D類blaOXA-40）以及外膜孔蛋白基因oprD進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s（外膜孔蛋白OprD退火溫度為61 ℃），72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀拍照并記錄結(jié)果。PCR陽(yáng)性擴(kuò)增子送到北京博邁德基因技術(shù)有限公司運(yùn)用Sanger法進(jìn)行雙向測(cè)序，對(duì)碳青霉烯酶基因及膜孔蛋白基因oprD測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，確定碳青霉烯酶基因亞型和膜孔蛋白o(hù)prD突變情況。

1.4 MLST種群結(jié)構(gòu)分析

將所有菌株的ST型別信息導(dǎo)入BioNumerics軟件，分析各ST型之間的克隆關(guān)系，并生成最小生成樹(shù)（minimum spanning tree， MST）?？寺?fù)合體（clone complex，CC）被定義為含有兩個(gè)及兩個(gè)以上STs且7個(gè)等位基因中有6個(gè)等位基因相同的所有STs型別的一個(gè)集合[8]。

2 結(jié)果

2.1 CRPA菌株的臨床特征及藥物敏感性分析

本研究共收集到來(lái)自臨床住院患者的81株CRPA，標(biāo)本類型包括尿液43.21% （35/81）、分泌物18.52%（15/81）、血液16.05%（13/81）、引流液11.11%（9/81）、肺泡灌洗液4.94%（4/81）、腦脊液2.47%（2/81）、膽汁2.47%（2/81）和腹水1.23%（1/81）（圖1）；科室分布主要以燒傷科和急診科為主，分別占比16.05%（13/81）、13.58%（11/81）（圖2）。藥敏結(jié)果顯示71.60%（58/81）CRPA為多重耐藥菌，未發(fā)現(xiàn)對(duì)多黏菌素B（PB）耐藥菌株，8類共13種抗菌藥物的藥敏結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.2 CRPA菌株MLST分型及種群結(jié)構(gòu)分析

81株CRPA總共檢出36種不同的STs型別，以ST3390最為常見(jiàn)（41.98%，34/81），其中發(fā)現(xiàn)5種新的STs型別：ST3645、ST3646、ST3647、ST3648、ST3649（圖4）。本研究中，ST3390除對(duì)多黏菌素B表現(xiàn)為敏感外，對(duì)其余抗生素表現(xiàn)為高度耐藥（圖5）。遺傳進(jìn)化結(jié)果顯示，81株CRPA由兩個(gè)克隆分化而來(lái)，最大的克隆群由ST3649，ST3647和ST3390組成，其中ST3390為該克隆群的核心；另一個(gè)克隆復(fù)合體由ST234和ST3282組成（圖6）。

2.3 碳青霉烯酶基因攜帶情況

81株CRPA分離株檢出IMP型、VIM型和NDM型基因，其中碳青霉烯酶基因的檢出率為65.43%（53/81），其中，IMP-9型檢出率為37.04%（30/81），VIM-2型檢出率為27.16%（22/81），NDM-1型檢出率為1.23%（1/81）。

2.4 外膜蛋白OprD基因的突變分析

78株（96.29%，78/81）CRPA發(fā)生了不同形式的突變。oprD基因序列發(fā)生突變的菌株有73株（90.12%， 73/81），其中62株因單個(gè)或多個(gè)堿基的缺失或插入導(dǎo)致其發(fā)生框移突變，6株因堿基突變致終止密碼子提前出現(xiàn)，5株發(fā)生氨基酸替換；另外5株可能為大片段缺失導(dǎo)致PCR結(jié)果為陰性（表1）。

3 討論

本次研究的81株菌株被分為36種不同的序列型別，這表明本地區(qū)STs型別豐富多樣，銅綠假單胞菌的感染來(lái)源和途徑多樣化，提示需要進(jìn)一步做好感染控制和感控傳播各個(gè)環(huán)節(jié)的工作。36種STs中，ST3390是優(yōu)勢(shì)型別，占41.98%。檢測(cè)到全球范圍內(nèi)廣泛傳播的ST244和ST357菌株，其形成的克隆復(fù)合體的傳播是全球多起感染暴發(fā)流行的重要型別之一[11]。結(jié)合藥敏結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CRPA除了對(duì)多黏菌素敏感外，對(duì)臨床上常用的抗假單胞菌藥物的耐藥率普遍較高（>50%），特別是優(yōu)勢(shì)型別ST3390有著極高的耐藥率，表明本地區(qū)銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的耐藥情況非常嚴(yán)峻，應(yīng)高度重視抗生素治療失敗或者效果不理想造成的抗生素選擇下ST3390菌株克隆傳播和暴發(fā)流行。

碳青霉烯酶的產(chǎn)生是銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素高水平耐藥的重要原因，因其可以水解碳青霉烯類在內(nèi)的大部分抗生素類別。目前，銅綠假單胞菌中檢出的有KPC、GES、IMP、VIM、SPM、NDM、SIM 和OXA類等10余種碳青霉烯酶，其中IMP和VIM型是B類酶型中最常見(jiàn)的類型[12-13]。本研究CRPA菌株中碳青霉烯酶的檢出率較高（65.43%， 53/81），其中高達(dá)84.62%（11/13）血液分離的CRPA菌株檢測(cè)到IMP-9或者VIM-2，高達(dá)88.24%（30/34）ST3390菌株中攜帶有VIM-2或者IMP-9酶基因，這可能是導(dǎo)致這些菌株對(duì)除多黏菌素B之外的其它抗生素均表現(xiàn)高水平耐藥的重要原因之一。值得注意的是，尿液標(biāo)本中的碳青霉烯酶VIM-2或IMP-9基因，檢出率更高達(dá)80.00%（28/35），表明尿液中分離的銅綠假單胞菌耐藥情況較為嚴(yán)重，需要進(jìn)一步的研究和引起臨床重視。

此外，銅綠假單胞菌外膜蛋白OprD表達(dá)下調(diào)或缺失是造成對(duì)亞胺培南耐藥的重要原因[14]。本研究中，高達(dá)96.29%（78/81）CRPA分離株存在不同類型的oprD基因突變，甚至高于Yin等[8]報(bào)道中國(guó)西南醫(yī)院燒傷病房對(duì)碳青霉烯類非敏感的銅綠假單胞菌中89%的菌株存在oprD基因突變的結(jié)果。本次研究中突變類型最多的是單個(gè)或多個(gè)堿基的插入或缺失（76.54%，62/81），其中兩種氨基酸替換組合為T103S，K115T，F(xiàn)170L和T103S，K115T，F(xiàn)170L，E185Q，P186G，V189T，R310E，A315G，G425A。結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的研究一致，loop L2（T103S、K115T和V127L），loop L3（F170L、E185Q、P186G和V189T）和loop L6（R310E、A315G）是OprD蛋白最常見(jiàn)的氨基酸點(diǎn)突變類型[15-16]。研究還發(fā)現(xiàn)[14]nt1116-1118缺失堿基GTC將導(dǎo)致loop L7上第372-383之間的氨基酸發(fā)生由“MSDNNVGYKNYG”到“VDSSSSYAGL”，由此會(huì)產(chǎn)生截短2個(gè)氨基酸序列的突變，本研究中有13株CRPA菌株也發(fā)生了此改變，其中6株對(duì)亞胺培南耐藥，美羅培南中介耐藥。此外，3株分離菌（CRPA40、CRPA57和CRPA63）未發(fā)生任何形式的突變，表明其對(duì)碳青霉烯類耐藥可能是由其它機(jī)制介導(dǎo)的。34株ST3390菌株均發(fā)生109位置堿基A的缺失，表明某一特定型別的菌株可能在OprD的突變中具有某種特定的突變模式，需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究從CRPA菌株的分子分型、碳青霉烯酶分型及膜孔蛋白基因的突變情況3個(gè)方面初步探討了耐碳青霉烯類抗生素銅綠假單胞菌的分子流行病學(xué)特點(diǎn)及耐藥機(jī)制，有助于研究者進(jìn)行流行病學(xué)分析，以便加強(qiáng)抗菌藥物的合理使用及新型藥物的研發(fā)。同時(shí)，臨床應(yīng)加強(qiáng)對(duì)細(xì)菌的耐藥性監(jiān)測(cè)，定期開(kāi)展分子流行病學(xué)研究，以便更好地監(jiān)測(cè)及預(yù)防耐藥菌株的暴發(fā)流行。

參 考 文 獻(xiàn)

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