［摘 要］ 通過比較不同刺激物、細胞培養(yǎng)時間、細胞接種濃度、免疫途徑，建立檢測新型減毒HSV-2疫苗細胞免疫水平的IFN-γ ELISpot方法。 對C57BL/6小鼠進行減毒HSV-2疫苗免疫，第14天加強免疫，第21天分離小鼠脾臟淋巴細胞，采用IFN-γ ELISpot檢測該疫苗的細胞免疫水平。結(jié)果表明：最佳實驗孔刺激物為紫外滅活30 min、原滴度為108CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒，最佳細胞培養(yǎng)時間為24～48 h，最佳細胞接種濃度為3×106cells/mL，最佳免疫途徑是皮下注射。實驗建立了針對該疫苗的IFN-γ ELISpot方法，為該疫苗提供了一種檢測細胞免疫水平的方法。

［關鍵詞］ 酶聯(lián)免疫斑點試驗； 細胞免疫； 干擾素γ

［中圖分類號］ R392" ［文獻標識碼］ A

2型單純皰疹病毒（herpes simplex virus 2，HSV-2）是引起生殖器皰疹的主要病原體。生殖器皰疹是一種性傳播疾病，具有慢性、復發(fā)性和難以治愈的特點，臨床主要表現(xiàn)為生殖器及肛周部位皮膚粘膜出現(xiàn)皰疹或潰爛。WHO關于生殖器皰疹最新報道顯示，全球15～49歲人口中約有13%感染了HSV-2[1]，且HSV-2病毒感染者在面臨人類免疫缺陷病毒１型（human immunodeficiency virus 1，HIV-1）時，相比未感染者感染HIV-1的概率增加３～4倍[2-3]。目前臨床治療多以抗病毒藥物為主，如阿昔洛韋、泛昔洛韋和伐昔洛韋等[4-5]。這些藥物雖能降低癥狀的嚴重程度和復發(fā)頻率，但無法根治感染。

酶聯(lián)免疫斑點試驗（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT assay）初次報道于1983年[6]，是一種能從單細胞水平反映細胞免疫的技術，具有特異性強、靈敏度高等特點[7]。IFN-γ是Th1細胞產(chǎn)生的一種豐富的細胞因子，能夠活化巨噬細胞、NK細胞，通常被認為其內(nèi)源性水平高低能夠反映機體的細胞免疫應答情況[8]。因此通過ELISpot檢測IFN-γ是目前評估細胞免疫水平最常見的方法[9]。但是該技術尚未完全標準化，研究人員需要針對不同的研究對象，對刺激物、細胞濃度、培養(yǎng)時間、免疫途徑進行摸索，才能建立穩(wěn)定的檢測體系。本課題組前期為預防HSV-2感染，基于II型單純皰疹病毒野生毒株HG52開發(fā)了一種減毒疫苗（attenuated vaccine），本文旨在建立檢測該減毒疫苗誘導特異性細胞免疫的IFN-γ ELISpot方法，為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠，7周齡，雌性，SPF級，購于湖北省疾控中心。

1.1.2 試劑和儀器 Mouse IFN-γ precoated ELISpot Kit（內(nèi)包含預包被的PVDF板、生物素標記的抗體、酶聯(lián)親和素、AEC顯色液、Washing buffer、Dilution buffer）、PMA+Ionomycin，購于達科為生物技術有限公司；胎牛血清，購于浙江天杭生物有限公司；PRMI-1640培養(yǎng)基，購于Gibco公司；紅細胞裂解液，購于蘭杰柯科技有限公司；短肽，由金斯瑞生物科技股份有限公司合成；減毒疫苗、疫苗稀釋液IS buffer，由本實驗室制備。酶聯(lián)免疫斑點分析儀，購自德國AID公司。

1.2 方法

1.2.1 動物免疫 將C57BL/6小鼠隨機分為實驗組和對照組。實驗組注射減毒疫苗，滴度為107CCID50/mL，注射量為100 μL/只；對照組注射疫苗稀釋液IS buffer，注射量為100 μL/只。間隔14 d，加強免疫一次。

1.2.2 分離脾臟淋巴細胞 在加強免疫7 d后，頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，無菌摘取脾臟組織，置于含有PRMI-1640培養(yǎng)基的六孔板中。將脾臟研磨成單個細胞懸液，轉(zhuǎn)移細胞懸液經(jīng)70 μm細胞篩至50 mL離心管中，300×g離心7 min，棄上清，加入2 mL紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解2 min，離心棄紅色上清，無菌PBS溶液清洗細胞2次。用含有10％胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至實驗所需濃度。

1.2.3 ELISpot試驗步驟 活化預包被的PVDF板，加入PRMI-1640培養(yǎng)基，200 μL/孔，室溫靜置10 min后，傾倒培養(yǎng)基；加入調(diào)整好濃度的脾臟淋巴細胞懸液，100 μL/孔；實驗孔加入實驗組刺激物，陽性對照孔加入PMA+Ionomycin，陰性對照孔加入含有10％胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基，10 μL/孔；將ELISpot板放入37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時間；傾倒孔內(nèi)細胞及培養(yǎng)基，加入預冷的去離子水，200 μL/孔，4 ℃放置10 min低滲裂解細胞；用Washing buffer洗板6次，1 min/次；加入生物素標記的抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；用Washing buffer洗板6次，1 min/次；加入酶標親和素，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；用Washing buffer洗板6次，1 min/次；加入AEC顯色液，100 μL/孔，37℃避光顯色12-20 min；加入去離子水終止顯色，傾倒液體，將板置于室溫陰涼處晾干；使用酶聯(lián)免疫斑點分析儀進行計數(shù)。

1.2.4 ELISpot試驗結(jié)果分析 圖1中的一個斑點對應一個分泌IFN-γ 的T淋巴細胞（spot forming cell，SFC），斑點數(shù)的多少反映著機體的細胞免疫水平。參考文獻[10]并結(jié)合本疫苗的實際情況，設定陽性標準為實驗組刺激孔的斑點數(shù)大于55個/106cells，且大于4倍的陰性對照孔的斑點數(shù)。

對于計數(shù)結(jié)果應用GraphPad Prism 8.4軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準誤（Mean±SEM）表示，組間比較采用t檢驗，以*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005，****p＜0.0001作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。

1.3 ELISpot方法的建立

1.3.1 刺激物的選擇 隨機抽取實驗組小鼠5只，比較短肽池和紫外滅活的疫苗全病毒顆粒作為實驗孔刺激物的效果。操作步驟參考1.2進行。其中，動物免疫途徑為皮下注射，接種細胞濃度為3×106cells/mL，培養(yǎng)時間為24 h。

1）短肽池 短肽合成是從已知HSV-2開放閱讀框中選擇的[11]（表1）。將單個短肽按1、10 μg/mL等量混合，制成短肽池作為實驗孔刺激物。

2）紫外滅活的疫苗全病毒顆粒 將滴度為108CCID50/mL和107CCID50/mL的減毒疫苗于254 nm波長的紫外線下滅活30 min，簡寫為UV-VX，作為實驗孔刺激物。

1.3.2 細胞培養(yǎng)時間的選擇 從實驗組小鼠和對照組小鼠中隨機抽取5只，將培養(yǎng)時間調(diào)整為24、48、72 h。操作步驟參考1.2進行。其中，免疫途徑為皮下注射，接種細胞濃度為3×106 cells/mL；實驗孔刺激物為紫外滅活30 min、原滴度為108CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒。

1.3.3 細胞接種濃度的選擇 從實驗組和對照組小鼠中隨機抽取5只，將接種細胞濃度調(diào)整為1×106、2×106、3×106、4×106和5×106 cells/mL。操作步驟參考1.2進行。免疫途徑為皮下注射，實驗孔刺激物為紫外滅活30 min、原滴度為108 CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒，培養(yǎng)時間為24 h。

1.3.4 免疫途徑的選擇 隨機抽取實驗組小鼠10只，分為2組，比較皮下注射（subcutaneous，SC）、肌肉注射（intramuscular，IM）兩種免疫途徑。操作步驟參考1.2進行。其中，接種細胞濃度為3×106 cells/mL，實驗孔刺激物為紫外滅活30 min、原滴度為108 CCID50/mL的疫苗顆粒，培養(yǎng)時間為24 h。

2 結(jié)果

2.1 刺激物的確定

由圖2可知，當短肽池作為實驗孔刺激物時，實驗組小鼠產(chǎn)生的特異性斑點數(shù)較少，未產(chǎn)生較好的刺激效果；當紫外滅活的疫苗全病毒顆粒作為實驗孔刺激物時，實驗組小鼠產(chǎn)生的特異性斑點數(shù)較多，即原滴度為108 CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒刺激產(chǎn)生的特異性斑點數(shù)為217.2±36.26個，原滴度為107CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒刺激產(chǎn)生的特異性斑點數(shù)22.2±2.94個，二者呈顯著性差異（p＜0.0001）。從數(shù)據(jù)來看，選擇紫外滅活30 min、原滴度為108CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒作為實驗孔刺激物可產(chǎn)生較好的刺激效果。

2.2 細胞培養(yǎng)時間的確定

由圖3可知，在刺激物作用下，實驗組小鼠產(chǎn)生的特異性斑點數(shù)隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，但是對照組小鼠產(chǎn)生的非特異性斑點數(shù)也隨之增加。在培養(yǎng)72 h檢測時，對照組有的孔非特異斑點高達56個。在無刺激物作用時，實驗組小鼠分泌IFN-γ的脾臟淋巴細胞隨著培養(yǎng)時間的增加呈現(xiàn)一定的遞增趨勢，但幅度很小，斑點數(shù)最多僅24個。從數(shù)據(jù)來看，為避免對照組在刺激物作用下產(chǎn)生較多的非特異性斑點，細胞培養(yǎng)時間控制在24～48 h范圍內(nèi)比較合適。

2.3 細胞接種濃度的確定

由圖4可知，實驗組斑點數(shù)隨著脾臟淋巴細胞接種濃度的增加而增加，對照組斑點數(shù)也呈現(xiàn)一定的遞增趨勢，但幅度很小。當接種濃度為3×106 cells/mL，即每孔細胞接種數(shù)為3×105cells時，實驗組小鼠產(chǎn)生的特異性斑點數(shù)為192.1±29.65個，對照組平均斑點數(shù)為3.9±0.48個，本底干擾小。當接種濃度大于3×106 cells/mL時，有的實驗孔斑點數(shù)大于500個，如圖5所示出現(xiàn)斑點連片。這種現(xiàn)象會導致計數(shù)不準，增大實驗誤差。從數(shù)據(jù)來看，細胞接種最佳濃度為3×106 cells/mL。

2.4 免疫途徑的確定

由圖6可知，在疫苗免疫滴度為107 CCID50/mL時，皮下注射產(chǎn)生的特異性斑點數(shù)為247.9±37.11，肌肉注射產(chǎn)生的特異性斑點數(shù)為234.1±37.36。經(jīng)t檢驗分析，這兩種免疫途徑產(chǎn)生的斑點數(shù)無顯著性差異（p＞0.05）。從數(shù)據(jù)來看，皮下注射產(chǎn)生的斑點數(shù)略高于肌肉注射產(chǎn)生的斑點數(shù)。故選擇皮下注射作為該疫苗的免疫途徑。

3 討論與結(jié)論

有效的疫苗接種不僅誘導機體的體液免疫應答，細胞介導的免疫應答也同等重要。在特異性細胞免疫應答的常用檢測方法中，相比MHC肽五聚體染色法、胞內(nèi)細胞因子染色法，ELISpot試驗操作簡單，具有特異性強、靈敏度高等特點[12]。這些優(yōu)點使得ELISpot試驗成為現(xiàn)階段評估疫苗引起細胞免疫效應的“金標準”。但該技術尚未完全標準化。影響檢測體系的因素較多，研究人員需要針對不同的研究對象進行摸索才能建立穩(wěn)定的檢測體系。

刺激物選擇是ELISpot技術的關鍵因素之一。本研究對比短肽池和紫外滅活的疫苗全病毒顆粒兩種實驗孔刺激物，選擇經(jīng)紫外滅活30 min、原滴度為108CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒作為實驗孔刺激物。合適的細胞培養(yǎng)時間要排除非特異性斑點對實驗結(jié)果的干擾。通過比較，本研究選擇的細胞培養(yǎng)時間為24～48 h。細胞接種濃度也是影響實驗結(jié)果的關鍵因素，接種濃度過低斑點產(chǎn)生較少，接種濃度過高會出現(xiàn)斑點連片現(xiàn)象。綜合考慮下，本研究選擇細胞接種濃度為3×106 cells/mL。不同的免疫途徑產(chǎn)生的細胞免疫應答效果不同。本研究通過比較皮下注射和肌肉注射兩種免疫途徑，選擇皮下注射作為該疫苗的免疫途徑。本文通過對刺激物、細胞培養(yǎng)時間、細胞接種濃度、免疫途徑的摸索，建立了檢測該新型減毒HSV-2疫苗細胞免疫水平的IFN-γ ELISpot方法，為后續(xù)研究該疫苗的免疫效果奠定了基礎。

［ 參 考 文 獻 ］

［1］ JAMES C， HARFOUCHE M， WELTON N J， et al. Herpes simplex virus： global infection prevalence and incidence estimates， 2016 [J]. Bulletin of the World Health Organization， 2020， 98（05）： 315-29.

[2] FREEMAN E E， WEISS H A， GLYNN J R， et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women： systematic review and meta-analysis of longitudinal studies [J]. Aids， 2006， 20（01）： 73-83.

[3] ARORA P， NAGELKERKE N J D， JHA P. A systematic review and meta-analysis of risk factors for sexual transmission of HIV in India [J]. Plos One， 2012， 7（08）：e44094.

[4] KOELLE D M， COREY L. Herpes simplex： Insights on pathogenesis and possible vaccines [J]. Annual Review of Medicine， 2008， 59： 381-95.

[5] KIMBERLIN D W， WHITLEY R J， WAN W， et al. Oral Acyclovir Suppression and Neurodevelopment after Neonatal Herpes [J]. New England Journal of Medicine， 2011， 365（14）： 1284-1292.

[6] CZERKINSKY C C， NILSSON L A， NYGREN H， et al. A solid-phase enzyme-linked immunospot （ELISpot） assay for enumeration of specific antibody-secreting cells [J]. Journal of Immunological Methods， 1983， 65（1-2）： 109-21.

[7] LEE J Y. Comparison of two commercial interferon-γ assays for diagnosing Mycobacterium tuberculosis infection [J]. European Respiratory Journal， 2006， 28（01）： 24-30.

[8] 李靖， 董文學， 楊美盼， 等. IFN-γ研究進展與臨床應用 [J]. 衛(wèi)生職業(yè)教育， 2019， 37（23）： 3.

[9] SIOTA M， LIM J B， DANG Y， et al. ELISpot for measuring human immune responses to vaccines [J]. Expert Review of Vaccines， 2011， 10（03）： 299-306.

[10] MOODIE Z， HUANG Y D， GU L， et al. Statistical positivity criteria for the analysis of ELISpot assay data in HIV-1 vaccine trials [J]. Journal of Immunological Methods， 2006， 315（1-2）： 121-32.

[11] POSAVAD C M， MAGARET A S， ZHAO L， et al. Development of an interferon-gamma ELISPOT assay to detect human T cell responses to HSV-2 [J]. Vaccine， 2011， 29（40）： 7058-66.

[12] 張春濤， 劉春雨， 吳瑜， 等. ELISPOT，MHC肽五聚體和ICCD三種檢測特異性細胞免疫應答方法的比較研究 [J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志， 2006， 20： 3.

Establishment of IFN-γ ELISpot Assay for a NewAttenuated HSV-2 Vaccine

XU Yiyan1， HE Qian2， CAI Linkang2， LIU Binlei1

（1 School of Bioengineering and Food， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068，China；2 Wuhan Binhui Biotechnology Co.， Ltd， Wuhan 430073，China）

Abstract： The IFN-γ ELISpot method was established to detect the cellular immune level of a novel attenuated HSV-2 vaccine by comparing the experimental conditions such as different stimulators， cell culture time， cell inoculation concentration， and immune pathway. C57BL/6 mice were immunized with the novel attenuated HSV-2 vaccine， and strengthened on the 14th day. Spleen lymphocytes were isolated on the 21st day. The cellular immune level of the vaccine was detected by IFN-γ ELISPOT assay. The results show that the optimal stimulator of experimental hole is Ultraviolet inactivation HSV-2 particles （1×108CCID50/mL）， the optimal cell culture time is 24-48 h， the optimal cell concentration is 3×106cells/mL， the optimal immune route is subcutaneous injection. The IFN-γ ELISpot assay for the vaccine was established， which provides a method for detecting the cellular immune level of the vaccine.

Keywords： ELISpot； cellular immunity； IFN-γ

［責任編校： 張 眾］