［摘 要］ 溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒oHSV2是對Ⅱ型單純皰疹病毒HSV-2進行基因改造后得到的新型溶瘤病毒。UL19基因編碼的VP5蛋白為oHSV2主要衣殼蛋白之一。在前期已經(jīng)通過GST pull-down與質(zhì)譜檢測分析確定了oHSV2的VP5蛋白為人類白細胞抗原E（HLA-E）的相互作用蛋白的基礎(chǔ)上，將HLA-E作為NK與CTL等免疫細胞表面CD94/NKG2A的強效抑制性配體，當它與CD94/NKG2A結(jié)合后，NK與CTL細胞的免疫功能會受到一定程度的抑制。前期研究已證實oHSV2會在體外上調(diào)部分腫瘤細胞系表面HLA-E表達，為探究oHSV2是否通過VP5蛋白上調(diào)腫瘤細胞系表面HLA-E的表達，進而影響HLA-E和CD94/NKG2A的結(jié)合，最終改變NK細胞的抗腫瘤能力，通過PiggyBac 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達VP5蛋白的人胃腺癌細胞BGC823-VP5細胞系。所構(gòu)建的細胞系經(jīng)流式檢測單克隆細胞陽性率在99%以上；Western Blot檢測到VP5蛋白在細胞內(nèi)表達；實時無標記動態(tài)細胞分析技術(shù)（RTCA Real Time Cell AnaIysis）檢測表明BGC823-VP5細胞系與親本細胞BGC823細胞生長活性一致。穩(wěn)定表達VP5蛋白的人胃癌細胞BGC823-VP5細胞系的構(gòu)建，為進一步研究oHSV2上VP5蛋白在人胃癌BGC823細胞內(nèi)影響HLA-E的表達，進而影響免疫細胞的抗腫瘤能力奠定了基礎(chǔ)。

［關(guān)鍵詞］ 溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒； VP5蛋白； BGC823細胞

［中圖分類號］ R735.2" ［文獻標識碼］ A

溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒oHSV2是由Ⅱ型單純皰疹病毒（HSV-2）基因改造而來的新型溶瘤病毒，具體改造步驟是在Ⅱ型單純皰疹病毒（HSV-2）標準毒株HG52的基因組上敲除了ICP34.5和ICP47，同時在病毒基因組上插入了編碼人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（human granulocyte macrophage colony stimulating factor，hGM-CSF）的基因序列[1]。溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒oHSV2上VP5蛋白是由UL19基因編碼的病毒主要衣殼蛋白，屬于病毒晚期（leaky-late）表達蛋白[2]，在病毒基因組復(fù)制開始后表達，在感染復(fù)制周期中晚期最高表達[3]。

病毒感染腫瘤細胞引起HLA-E表達上調(diào)的現(xiàn)象已有文獻報道[4]。本團隊前期實驗已經(jīng)證實oHSV2會在體外上調(diào)部分腫瘤細胞系表面HLA-E的表達，且已經(jīng)通過GST pull-down與質(zhì)譜分析確定了oHSV2上由UL19基因編碼的VP5蛋白為人類白細胞抗原E（HLA-E）的相互作用蛋白。這提示了oHSV2可能通過VP5蛋白上調(diào)部分腫瘤細胞系表面HLA-E的表達，而HLA-E作為CTL細胞與NK細胞表面CD94/NKG2A的強效抑制性配體在腫瘤細胞表面表達會影響到CTL細胞與NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性[5]。

胃癌作為最常見的消化道癌之一，其死亡率高居消化道癌癥第一位[6]。人胃癌BGC823細胞系作為經(jīng)典的腫瘤研究細胞模型，在胃癌研究中極具代表性[7]。本研究擬在人胃癌BGC823細胞系基礎(chǔ)上構(gòu)建穩(wěn)定表達VP5蛋白的人胃癌細胞系，以利于進一步探究VP5蛋白影響腫瘤細胞表面HLA-E表達進而影響CTL細胞與NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性的機制。

目前用于真核蛋白穩(wěn)定表達細胞系構(gòu)建的常用載體有轉(zhuǎn)座子載體與慢病毒載體[8]，本研究選擇的是轉(zhuǎn)座子載體，采用了PiggyBac 轉(zhuǎn)座質(zhì)粒系統(tǒng)。作為DNA型轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，PiggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒系統(tǒng)憑借其轉(zhuǎn)座效率高、宿主范圍廣等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于哺乳動物細胞真核蛋白穩(wěn)定表達細胞系構(gòu)建中[9]。PiggyBac 轉(zhuǎn)座質(zhì)粒系統(tǒng)需要轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒共同發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)座酶質(zhì)?？删幋a由594個氨基酸組成的PiggyBac轉(zhuǎn)座酶，轉(zhuǎn)座酶在細胞內(nèi)表達后可在轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座過程中切斷DNA使轉(zhuǎn)座子從質(zhì)粒載體中釋放出來，同時也可將宿主細胞內(nèi)目標染色體的特定位點剪切為粘性末端雙鏈斷口[10]。在DNA連接酶的作用下，載體質(zhì)粒會重新連接起來，連接宿主細胞染色體粘性末端雙鏈斷口，從而整合到宿主細胞染色體上[11]。本研究使用已插入UL19基因（oHSV2上VP5蛋白的編碼基因）與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein ，GFP）基因的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒和表達轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BGC823細胞，使GFP與UL19基因整合到BGC823細胞染色體上，從而在BGC823細胞中穩(wěn)定表達VP5蛋白。其中GFP 作為熒光標簽蛋白，可作為細胞系篩選過程中的重要指標[12]。

1 實驗材料

1.1 實驗材料和試劑

本實驗使用來源于協(xié)和醫(yī)院（北京）的人胃癌細胞株；細胞培養(yǎng)使用DMEM/F12（南京森貝伽生物科技）、FBS（浙江天杭生物）；PiggyBac Dual Promoter-VP5 重組質(zhì)粒及菌種由本實驗室前期構(gòu)建并保存；Super PiggyBac Transposase（pSPBT）轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒由本實驗室前期改造并保存；質(zhì)粒提取使用江蘇康為世紀生物科技有限公司無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；細胞篩選用嘌呤霉素（Puro）購自白鯊生物；PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%）購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；Anti-VP5抗體購自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔二抗購自proteintech。

1.2 主要實驗儀器

二級生物安全柜 （北京東聯(lián)哈爾）， CO2培養(yǎng)箱 （Panasonic）， 體視熒光顯微鏡 （Nikon），細胞計數(shù)儀 （Thermo Fisher Scientific）， 流式細胞檢測儀 （BD）， 多功能實時無標記細胞分析儀 （ACEA Biosciences Inc）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

50 mL FBS加入450 mL DMEM/F12內(nèi)混勻即為BGC823細胞培養(yǎng)用完全培養(yǎng)基；BGC823細胞于37℃，5%" CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.2 質(zhì)粒提取

從超低溫保存箱中取出前期保存的pPBDP-VP5與pSPBT質(zhì)粒菌種，冰上化凍后在超凈工作臺內(nèi)取15 μL質(zhì)粒菌種接種于15 mL的LB培養(yǎng)基中，加入 15 μL 抗生素，37℃，200 r/min 搖菌 14 h。質(zhì)粒提取操作按照試劑盒相應(yīng)說明書完成。提取完成后及時測定所提質(zhì)粒DNA濃度，于-20℃冰箱保存。

2.3 細胞對嘌呤霉素敏感性實驗

取BGC823細胞，消化并終止后計數(shù)，以完全培養(yǎng)基稀釋細胞，稀釋至細胞濃度為3×105 個/mL，以每孔0.5 mL置于24孔板中培養(yǎng)。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d待BGC823細胞匯合度達到80%后，取出24孔板，在生物安全柜內(nèi)棄掉孔板中舊培養(yǎng)基，各培養(yǎng)孔中各換入1 mL完全培養(yǎng)基，在各孔內(nèi)分別加入1、2、3、4、5、6、7、8、9 、10 μL嘌呤霉素（1 μg/μL），每個濃度3次重復(fù)。輕輕搖晃孔板，將孔板內(nèi)抗生素與培養(yǎng)基搖晃均勻后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，期間每日觀察記錄細胞生長狀態(tài)與存活細胞比例，每2日對24孔板中培養(yǎng)基進行更換并加入對應(yīng)體積嘌呤霉素。最后于加入嘌呤霉素后第6天確定細胞系篩選過程中的嘌呤霉素最合適濃度。

2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

取BGC823細胞，消化終止后計數(shù)，將細胞以每孔1.5×105個鋪于24孔板中。細胞放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h待孔板內(nèi)細胞匯合度達到80%后，取出24孔板，在生物安全柜內(nèi)棄掉24孔板內(nèi)舊培養(yǎng)基，每孔換入新培養(yǎng)基。將pPBDP-VP5質(zhì)粒與pSPBT按質(zhì)量比為5∶1轉(zhuǎn)染BGC823細胞。轉(zhuǎn)染完成后，輕輕晃動孔板使轉(zhuǎn)染體系與培養(yǎng)基混合均勻，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)細胞。轉(zhuǎn)染48 h后在體視熒光顯微鏡下觀察細胞發(fā)光率。

2.5 嘌呤霉素篩選

轉(zhuǎn)染48 h后，取出BGC823細胞，在生物安全柜內(nèi)棄去24孔板內(nèi)舊培養(yǎng)基，每孔換入1 mL新培養(yǎng)基，并按照BGC823細胞對嘌呤霉素敏感性實驗所確定的最合適嘌呤霉素濃度加入嘌呤霉素。放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，期間每日觀察細胞生長狀態(tài)與細胞發(fā)光率，每2 日更換24孔板內(nèi)培養(yǎng)基與嘌呤霉素。嘌呤霉素篩選至24孔板內(nèi)細胞發(fā)光率達到50%后在生物安全柜內(nèi)消化細胞，終止消化后吹勻細胞，計數(shù)，使用完全培養(yǎng)基稀釋至10 個/mL。將稀釋后細胞轉(zhuǎn)入96孔板中（每孔100 μL），放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后取出96孔板，在顯微鏡下觀察96孔板內(nèi)細胞并記錄只生長有單個細胞的培養(yǎng)孔。繼續(xù)培養(yǎng)至單個細胞增殖為細胞團后，體視顯微鏡挑選發(fā)光單克隆細胞團，并將單克隆細胞轉(zhuǎn)移至24孔板內(nèi)，放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。待24孔板中細胞匯合度達到80%后消化細胞，終止消化后轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。

2.6 流式細胞儀檢測細胞GFP表達

取BGC823-VP5細胞與BGC823細胞消化并終止后離心，用PBS重懸并稀釋細胞至2×105個/mL。以BGC823細胞為對照，使用流式細胞儀檢測BGC823-VP5細胞GFP的表達率。

2.7 Western Blot檢測細胞VP5表達

取BGC823-VP5細胞與BGC823細胞分別鋪于6孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 d后取出，棄去孔板內(nèi)培養(yǎng)基，使用RIPA（強）裂解液4℃裂解細胞，4℃離心裂解后細胞收獲總蛋白，使用蛋白上樣緩沖液100℃變性蛋白。變性后蛋白通過蛋白膠電泳分離，使用半干轉(zhuǎn)印槽將SDS-PAGE內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜（電壓15 V，20 min）。采用含有5% 脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，一抗室溫孵育1 h，二抗室溫孵育1 h。使用ECL顯色液顯色。

2.8 實時無標記細胞分析儀（RTCA）檢測細胞生長與增殖活性

選擇GFP陽性率在99%以上的BGC823-VP5-3細胞系進行細胞生長活性檢測。分別取BGC823-VP5-3細胞與BGC823細胞消化終止后計數(shù)，使用培養(yǎng)基分別稀釋細胞密度至1×105個/mL，以100 μL每孔鋪于RTCA專用16孔板，將RTCA放入培養(yǎng)箱內(nèi)以每5 min一次的頻率監(jiān)測細胞生長狀態(tài)，共監(jiān)測72 h[13]。

3 實驗結(jié)果

3.1 BGC823細胞對嘌呤霉素敏感性實驗

以1～10 μg/μL為嘌呤霉素濃度范圍刺激BGC823細胞，觀察細胞存活率并制作細胞生存曲線。由圖1可知，嘌呤霉素刺激細胞后6 d內(nèi)細胞全部死亡的最低嘌呤霉素濃度為5 μg/μL，故采用5 μg/μL的嘌呤霉素濃度作為細胞系篩選濃度。

3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

在體視熒光顯微鏡下觀察BGC823細胞轉(zhuǎn)染pPBDP-VP5質(zhì)粒與pSPBT質(zhì)粒48 h后細胞GFP表達水平。如圖2所示，在顯微鏡下可觀察到大量綠色細胞團，表明轉(zhuǎn)染成功，外源基因在BGC823細胞內(nèi)表達。

3.3 單克隆細胞挑選擴培

轉(zhuǎn)染后細胞經(jīng)濃度為5 μg/μL的嘌呤霉素篩選3 周后，稀釋挑選單克隆細胞于96孔板中培養(yǎng)。細胞在96孔板中培養(yǎng)72 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)與GFP表達，培養(yǎng)7 d后在熒光顯微鏡下可觀察到明顯單克隆細胞團。圖3為熒光顯微鏡下單克隆細胞及由單克隆細胞生長所得單克隆細胞團。

3.4 流式細胞儀檢測BGC823-VP5細胞GFP表達

選擇3株BGC823-VP5（BGC823-VP5-1、BGC823-VP5-2、BGC823-VP5-3）單克隆細胞系將細胞以PBS稀釋至2×105個/mL后，以BGC823為對照流式檢測BGC823-VP5單克隆細胞純度與GFP表達。流式結(jié)果顯示，3株BGC823-VP5細胞系GFP陽性率均達到99.9%，表明GFP在BGC823-VP5細胞系內(nèi)穩(wěn)定表達（圖4）。

3.5 Western Blot檢測BGC823-VP5細胞VP5蛋白表達

BGC823-VP5與BGC823細胞全細胞裂解產(chǎn)物中加入蛋白上樣緩沖液后，經(jīng)高溫變性，PAGE膠電泳分離蛋白。Western Blot結(jié)果顯示：在BGC823-VP5細胞中存在VP5蛋白，在BGC823細胞中未檢到VP5蛋白（圖5）。

3.6 實時無標記動態(tài)細胞分析技術(shù)（RTCA）檢測BGC823-VP5細胞生長活性

RTCA檢測BGC823-VP5與BGC823細胞的生長活性。結(jié)果顯示，在72 h內(nèi)，BGC823-VP5細胞的細胞指數(shù)（cell index）均高于BGC823細胞，表明外源基因的插入并未降低BGC823細胞生長活性（圖6）。

4 結(jié)束語

根據(jù)抗原性差異，單純皰疹病毒可分為Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型主要感染口、唇的皮膚粘膜及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而Ⅱ型主要與外生殖器感染和新生兒感染有關(guān)。目前以Ⅰ型單純皰疹病毒為載體的溶瘤病毒產(chǎn)品T-Vec已在2015年上市，而以Ⅱ型單純皰疹病毒為載體的溶瘤病毒產(chǎn)品也已進入臨床試驗階段。

NKG2A作為自然殺傷細胞受體家族2中的抑制性受體，是NK細胞表面優(yōu)先表達的跨膜蛋白之一，主要表達在NK細胞表面和部分T細胞表面。在免疫細胞表面， NKG2A與CD94分子（NK細胞表面膜蛋白）以二硫鍵連接形式形成的異質(zhì)二聚體復(fù)合物NKG2A/CD94。

人類白細胞抗原E（HLA-E）作為NK細胞表面抑制性受體CD94/NKG2A分子的唯一配體，廣泛表達于各類癌細胞表面，并通過結(jié)合CD94/NKG2A受體抑制NK細胞的激活[14]。本團隊前期實驗已經(jīng)證實oHSV2會在體外上調(diào)人胃癌BGC823細胞表面HLA-E的表達，并通過GST pull-down與質(zhì)譜技術(shù)證實了oHSV2上VP5蛋白為HLA-E的相互作用蛋白。

目前已有研究表明，人巨細胞病毒（HCMV）在感染腫瘤細胞后可上調(diào)腫瘤細胞表面HLA-E表達，其主要作用機制是通過病毒糖蛋白UL40所產(chǎn)生的肽段與HLA-E結(jié)合[15]。oHSV2在體外上調(diào)腫瘤細胞表面HLA-E表達的機制尚未明確，為研究oHSV2是否通過VP5蛋白上調(diào)人胃癌BGC823細胞表面HLA-E表達，使用PiggyBac 轉(zhuǎn)座質(zhì)粒系統(tǒng)與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將UL19基因插入BGC823細胞染色體上，通過嘌呤霉素篩選獲得成功表達GFP與VP5蛋白的單克隆細胞系。使用Western Blot與流式分別驗證GFP與VP5蛋白在BGC823-VP5中表達。使用RTCA技術(shù)證實BGC823-VP5與BGC823細胞生長活性一致。

本研究所構(gòu)建穩(wěn)定表達VP5蛋白的BGC823-VP5細胞系為研究oHSV2在體外上調(diào)腫瘤細胞表面HLA-E表達的機制提供了合適的細胞模型，同時此細胞系穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白，為后續(xù)探究VP5蛋白在小鼠動物模型內(nèi)影響HLA-E表達及NK細胞抗腫瘤能力奠定了基礎(chǔ)。

［ 參 考 文 獻 ］

［1］ ZHANG W， ZENG B， HU X， et al. Oncolytic herpes simplex virus type 2 can effectively inhibit colorectal cancer liver metastasis by modulating the immune status in the tumor microenvironment and inducing specific antitumor immunity [J]. Human gene therapy， 2021， 32（3-4）： 203-215.

[2] YUAN S， WANG J， ZHU D， et al. Cryo-EM structure of a herpesvirus capsid at 3.1 [J]. Science （New York， NY）， 2018， 360（6384）：eaao7283.

[3] LIEU P T， WAGNER E K. Two leaky-late HSV-1 promoters differ significantly in structural architecture [J]. Virology， 2000， 272（01）： 191-203.

[4] NATTERMANN J， NISCHALKE H D， HOFMEISTER V， et al. The HLA-A2 restricted T cell epitope HCV core 35-44 stabilizes HLA-E expression and inhibits cytolysis mediated by natural killer cells [J]. The American journal of pathology， 2005， 166（02）： 443-453.

[5] PETRIE E J， CLEMENTS C S， LIN J， et al. CD94-NKG2A recognition of human leukocyte antigen （HLA）-E bound to an HLA class I leader sequence [J]. The Journal of experimental medicine， 2008， 205（03）： 725-735.

[6] 曹毛毛， 李賀， 孫殿欽， 等. 2000—2019年中國胃癌流行病學(xué)趨勢分析[J]. 中華消化外科雜志， 2021， 20（01）： 102-109.

[7] FU X， TAO L， ZHANG X. An oncolytic virus derived from type 2 herpes simplex virus has potent therapeutic effect against metastatic ovarian cancer [J]. Cancer gene therapy， 2007， 14（05）： 480-487.

[8] 盧加琪， 韋薇， 白玉， 等. 細胞治療產(chǎn)品的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及審評要點 [J]. 中國新藥雜志，2020（01）： 27-32.

[9] SAHA S， WOODARD L E， CHARRON E M， et al. Evaluating the potential for undesired genomic effects of the piggyBac transposon system in human cells [J]. Nucleic acids research， 2015， 43（03）： 1770-1782.

[10] SARKAR A， SIM C， HONG Y S， et al. Molecular evolutionary analysis of the widespread piggyBac transposon family and related \"domesticated\" sequences [J]. Molecular genetics and genomics ： MGG， 2003， 270（02）： 173-180.

[11] LOBO N F， FRASER T S， ADAMS J A， et al. Interplasmid transposition demonstrates piggyBac mobility in vertebrate species [J]. Genetica， 2006， 128（1-3）： 347-357.

[12] PDELACQ J D， CABANTOUS S， TRAN T， et al. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein [J]. Nature biotechnology， 2006， 24（01）： 79-88.

[13] MARTINEZ-SERRA J， GUTIERREZ A， MUOZ-CAP S， et al. xCELLigence system for real-time label-free monitoring of growth and viability of cell lines from hematological malignancies [J]. OncoTargets and therapy， 2014， 7： 985-994.

[14] ZHEN Z J， LING J Y， CAI Y， et al. Impact of HLA-E gene polymorphism on HLA-E expression in tumor cells and prognosis in patients with stage Ⅲ colorectal cancer [J]. Medical oncology （Northwood， London， England）， 2013， 30（01）： 482.

[15] ULBRECHT M， MARTINOZZI S， GRZESCHIK M， et al. Cutting edge： the human cytomegalovirus UL40 gene product contains a ligand for HLA-E and prevents NK cell-mediated lysis [J]. Journal of immunology （Baltimore， Md ： 1950）， 2000， 164（10）： 5019-5022.

Construction of BGC823 Cell Line Stably Expressing VP5Protein of Herpes Simplex Virus Type Ⅱ

XIAO Xiong， ZHAO Xiaotong，LI Le， ZHOU Qin， WANG Yang， HU Han， LIU Binlei

（School of Food and Biological Engin.， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China）

Abstract： Oncolytic herpes simplex virus type Ⅱ oHSV2 is a new type of oncolytic virus obtained by genetic modification on the basis of herpes simplex virus type Ⅱ HSV-2. VP5 protein encoded by UL19 gene is one of the main capsid proteins of oHSV2. Our team has determined that VP5 protein of oHSV2 is the interaction protein of human leukocyte antigen E （HLA-E） through GST pull down and mass spectrometry detection and analysis in the early stage. HLA-E is a potent inhibitory ligand of CD94/NKG2A on the surface of CTL cells and NK cells. When it binds with CD94/NKG2A， the immune function of CTL cells and NK cells will be inhibited. On the basis of previous studies that have confirmed that oHSV2 can up regulate the expression of HLA-E on the surface of some tumor cell lines in vitro， in order to explore whether oHSV2 can up regulate the expression of HLA-E on the surface of tumor cell lines through VP5 protein， thereby affecting the binding of HLA-E and CD94/NKG2A， and ultimately changing the anti-tumor ability of NK cells， a human gastric adenocarcinoma cell line BGC823-VP5 stably expressing VP5 was constructed through PiggyBac transposition system. The positive rate of monoclonal cells in the constructed cell line was more than 99% by flow cytometry; Western Blot detected VP5 protein expression in cells; RTCA Real Time Cell AnaIysis showed that the growth activity of BGC823-VP5 cell line was consistent with that of its parent cell BGC823. The construction of a human gastric cancer cell line BGC823-VP5 stably expressing VP5 lays a foundation for exploring the effect of VP5 protein on oHSV2 on the expression of HLA-E in tumor cells and thus on the anti-tumor activity of NK cells.

Keywords： oncolytic herpes simplex virus type Ⅱ; VP5 protein; BGC823 cells

［責任編校： 張 眾］