李婷 王愛平 王紅玲 劉適 郭文濤（三亞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科一區(qū)，海南572000）

胃癌是胃黏膜癌變的一種惡性腫瘤。目前胃癌已經(jīng)是全球癌癥相關(guān)死亡率第三的惡性癌癥，2013年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，約有98.4萬(wàn)胃癌新發(fā)病例和84.1萬(wàn)死亡病例，且近年來(lái)數(shù)字進(jìn)一步增長(zhǎng)［1］。由于早期患者缺乏具體的疾病表現(xiàn)，大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已經(jīng)疾病晚期階段，預(yù)后較差［2］。

溶瘤病毒可以在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制，并能夠摧毀癌細(xì)胞，進(jìn)一步將腫瘤抗原暴露至抗原提呈細(xì)胞中［3］。一些研究表明，其可以通過(guò)局部免疫激活、免疫原性溶瘤細(xì)胞死亡、新抗原釋放和呈遞，以及改變免疫抑制的腫瘤微環(huán)境來(lái)激活T細(xì)胞反應(yīng)，從而進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。值得注意的是，近年來(lái)，具有腫瘤選擇性的溶瘤病毒被證明可作為一種載體，攜帶一些免疫調(diào)節(jié)因子進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，從而改變腫瘤微環(huán)境。用攜帶致炎細(xì)胞因子編碼基因的腫瘤選擇性溶瘤病毒治療有望增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫反應(yīng)，一些溶瘤病毒已經(jīng)在幾種癌癥中進(jìn)行評(píng)估［4-6］。Talimogene laherparepvec（T-VEC）于2015年在美國(guó)被批準(zhǔn)為治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的一類溶瘤病毒，是一種工程化的單純皰疹病毒，插入編碼粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的基因作為免疫佐劑來(lái)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境［7-8］。Pexastimogene devacirepvec（PexA-VEC，JX-594）也攜帶編碼GM-CSF的基因，目前已經(jīng)在晚期肝細(xì)胞癌患者的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行活性評(píng)估［9-10］。

有研究表明，溶瘤病毒感染后腫瘤微環(huán)境中PD-L1表達(dá)會(huì)上調(diào)，導(dǎo)致腫瘤對(duì)溶瘤免疫治療產(chǎn)生抵抗，這一問(wèn)題應(yīng)當(dāng)在溶瘤病毒治療過(guò)程中予以克服［11］。本研究中，構(gòu)建了一種共表達(dá)PD-L1抑制劑和GM-CSF的工程溶瘤痘苗病毒。發(fā)現(xiàn)這種工程化溶瘤病毒能夠有效裂解腫瘤細(xì)胞并表達(dá)PD-L1抑制劑，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明其可以增強(qiáng)溶瘤病毒的抗腫瘤活性，激活腫瘤特異性T細(xì)胞。結(jié)果表明，這種工程化的溶瘤病毒對(duì)胃癌的治療提供了一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞人胃癌細(xì)胞MGC803及人胃癌細(xì)胞AGS由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供；鼠胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞及HUTK-143B細(xì)胞由美國(guó)模式菌種保藏庫(kù)提供。以上所有細(xì)胞均在DMEM完全培養(yǎng)基（額外添加10%FBS）37℃、5%CO2條件下生長(zhǎng)。

1.1.2 試劑MTT及二甲基亞砜購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，anti-CD8、anti-IFN-γ及anti-TNF-α流式抗體購(gòu)自Biolegend（美國(guó)），anti-PD-L1抗體購(gòu)自R&D（美國(guó)）。GAPDH購(gòu)自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。Fix/Perm溶液及Perm/Wash溶液購(gòu)自BD Biosciences（美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 重組病毒的構(gòu)建PD-L1抑制劑由PD-1受體胞外結(jié)合域與IgG1 Fc片段組成。穿梭載體pSel-DsRed2N1中插入PSE/l啟動(dòng)子控制的iPDL1或/和p7.5啟動(dòng)子控制下的GM-CSF。為獲得重組溶瘤痘病毒（OV），以VGF基因缺失的vSC20為親本病毒進(jìn)行同源重組。將vSC20以MOI值為0.1感染HUTK-143B細(xì)胞2 h，然后將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUTK-143B細(xì)胞。挑選3個(gè)RFP陽(yáng)性斑塊進(jìn)行分離并使其懸浮，進(jìn)一步感染HUTK-143B細(xì)胞，重復(fù)3個(gè)周期的空斑選擇，直到所有斑塊均為RFP陽(yáng)性。1 000 r/min離心5 min去掉上清液收獲細(xì)胞。再懸浮于冰浴的10 mmol/L Tris緩沖液（pH=9.0）中，超聲1 min，干冰/乙醇交替浴凍融3次。將細(xì)胞裂解液小心預(yù)置于2 ml 40%蔗糖溶液中，在4℃、20 000 r/min離心2 h。將超速離心后試管底部的白色顆粒重懸在200 ml 10 mmol/L Tris緩沖液中，保存于-80℃。病毒滴定通過(guò)HuTK-143B細(xì)胞（2×105個(gè)）接種于12孔板中，在細(xì)胞單層上加入10倍梯度稀釋的病毒溶液。搖床上孵育1 h后，加入2 ml培養(yǎng)基，孵育24~48 h，洗滌并固定于0.1%結(jié)晶紫的乙醇溶液中。在顯微鏡下對(duì)斑塊進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 Western blot用MOI值為1的溶瘤病毒感染MFC細(xì)胞，孵育48 h后收集上清液，10 000 r/min離心2 min。細(xì)胞在1×RIPA緩沖液和1×蛋白酶抑制劑中冰浴15 min，10 000 r/min離心2 min。用12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在含有5%脫脂牛奶的TBS緩沖液中室溫下封閉60 min。使用抗PD-1一抗（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，用TBST清洗后與羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h后，用奧德賽成像儀進(jìn)行曝光。GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞毒作用將腫瘤細(xì)胞以1×104個(gè)/孔 接種 于96孔 板中，并 以不 同MOI值（0.1、0.5、1、5）的溶瘤病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染。腫瘤細(xì)胞活力測(cè)定采用MTT法。在VersaMax酶標(biāo)儀上以490 nm波長(zhǎng)讀取光密度。細(xì)胞裂解率（%）=［1-OD570（實(shí)驗(yàn)組）/OD570（對(duì)照組）］×100%

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)溶瘤病毒感染后，離心收集細(xì)胞，洗滌3次后用抗PD-L1的抗體避光孵育30 min，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

腫瘤組織經(jīng)過(guò)消化及過(guò)濾獲得單細(xì)胞懸液，細(xì)胞表面染色通過(guò)anti-CD8抗體避光孵育30 min，之后利用PBS洗滌3次，然后進(jìn)行胞內(nèi)抗原染色，用于檢測(cè)IFN-γ和TNF-α的表達(dá)量。細(xì)胞在Fix/Perm溶液中固定后，用Perm/Wash Buffer洗滌，然后使用抗體細(xì)胞內(nèi)染色30 min，Perm/Wash Buffer洗滌后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。所有樣本在LSRⅡ細(xì)胞儀（BD）上進(jìn)行操作，并用FACS DIVA軟件v8.0（BD Biosciences）進(jìn)行分析。

1.2.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將5~7周齡的雌性裸鼠飼養(yǎng)在武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌室中飼養(yǎng)，每日監(jiān)測(cè)。在小鼠皮下注射MFC細(xì)胞建立異種移植模型。接種后第7天，通過(guò)瘤周注射PBS，OV-GM，OV-GM/iPD-L1（5×107PFU/只）監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)狀況。每2~3 d檢查1次瘤體積和小鼠體重。對(duì)表現(xiàn)出垂死狀態(tài)的小鼠實(shí)施安樂死。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)腫瘤進(jìn)行剝離，拍照稱重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，組間樣本比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 工程化溶瘤病毒的構(gòu)建及驗(yàn)證本研究中構(gòu)建了3種溶瘤病毒，分別為OV，編碼GM-CSF的溶瘤痘病毒（OV-GM）以及同時(shí)編碼GM-CSF和PD-L1抑制劑的溶瘤痘病毒（OV-GM/iPD-L1），如圖1A所示。將3種溶瘤病毒分別感染鼠胃癌細(xì)胞MFC，檢測(cè)其分泌PD-L1抑制劑的能力。Western blot結(jié)果表明，只有感染OV-GM/iPD-L1可以分泌PD-L1抑制劑，感染其他病毒的細(xì)胞不能分泌PD-L1抑制劑（圖1B、C）。以上結(jié)果說(shuō)明所構(gòu)建的溶瘤病毒可以有效感染腫瘤細(xì)胞并表達(dá)相應(yīng)的目的蛋白。

圖1 重組溶瘤病毒的產(chǎn)生和鑒定Fig.1 Generation and characterization of recombinant oncolytic virus

2.2 溶瘤病毒對(duì)靶細(xì)胞的裂解能力如圖2所示，分別選取了小鼠胃癌細(xì)胞MFC、人胃癌細(xì)胞MGC803及人胃癌細(xì)胞ASG作為靶細(xì)胞，將不同的溶瘤病毒以不同的MOI值分別感染腫瘤細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)靶細(xì)胞的裂解能力。結(jié)果表明，3種溶瘤病毒都可以有效的感染并裂解腫瘤細(xì)胞，并且3種溶瘤病毒的溶瘤能力隨著MOI值的升高而增強(qiáng)。以上結(jié)果表明，這3種OV病毒可以以劑量依賴的方式裂解腫瘤細(xì)胞。

圖2 重組溶瘤病毒在不同MOI下對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig.2 Cytotoxicity of recombinant oncolytic virus to tar?get cells in different MOI

2.3 OV-GM/iPD-L1中和靶細(xì)胞PD-L1的表達(dá)用OV-GM和OV-GM/iPD-L1溶瘤病毒分別感染MFC細(xì)胞后，檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)的影響（圖3）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與OV-GM感染相比，感染OV-GM/iPD-L1的腫瘤細(xì)胞表面PDL1的表達(dá)量明顯降低，（t=22.98，P<0.000 1，圖3）。以上結(jié)果表明，OV-GM/iPD-L1分泌的PD-L1抑制劑可以中和腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)。

圖3 感染細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的分析Fig.3 Analysis of PD-L1 expression in infected cells

2.4 OV-GM/iPD-L1的體內(nèi)抗腫瘤活性首先建立了小鼠胃癌細(xì)胞的皮下移植瘤模型，瘤周注射PBS、OV-GM及OV-GM/iPD-L1，監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明，OV-GM和OV-GM/iPD-L1治療較對(duì)照組而言可以顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而OV-GM/iPD-L1的抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力較OV-GM更強(qiáng)（t=13.32，P<0.05，圖4A）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分析腫瘤重量，結(jié)果表明OV-GM/iPD-L1治療組的腫瘤質(zhì)量比OV-GM治療組更輕（t=3.641，P<0.05，圖4B、C）。并且在整個(gè)治療過(guò)程中，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的小鼠體重?zé)o顯著性差異，說(shuō)明并沒有產(chǎn)生明顯的毒性（圖4D）。以上結(jié)果說(shuō)明，OV-GM/iPD-L1可以顯著抑制小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)。

圖4 重組溶瘤病毒對(duì)小鼠胃移植瘤的抗腫瘤效果Fig.4 Antitumor efficacy of recombinant oncolytic virus against xenografts derived from gastric tumor cell lines in mice

2.5 OV-GM/iPD-L1對(duì)浸潤(rùn)T細(xì)胞的抗腫瘤活性的影響對(duì)各個(gè)治療組小鼠的腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞的抗腫瘤活性進(jìn)行了分析（圖5）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，OV-GM/iPD-L1治療組的腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞中，IFN-γ+（t=9.214，P<0.01，圖5A、B）及TNF-α+（t=3.207，P<0.05，圖5A、C）的T細(xì)胞比OV-GM治療后的腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞明顯增多，說(shuō)明OV-GM/iPD-L1顯著增強(qiáng)了小鼠自身T細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)?？傊陨蠈?shí)驗(yàn)說(shuō)明OV-GM/iPD-L1可以通過(guò)抑制PD-1/PD-L1通路增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能，從而協(xié)同增強(qiáng)抑制腫瘤的能力。

圖5 腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞免疫活性的流式細(xì)胞術(shù)分析Fig.5 Flow analysis of immune activity of tumor infiltrat?ing lymphocytes

3 討論

胃癌是全球發(fā)病率第四的癌癥，同時(shí)也是全球第三大病死率的癌癥。目前來(lái)看，早期的胃癌患者和可以通過(guò)化療及靶向治療藥物獲得較好的治療效果，但是一些晚期以及一些復(fù)發(fā)的患者沒有很好的治療手段，因此急需開發(fā)有效的藥物來(lái)應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)［12］。

溶瘤病毒具有選擇性感染腫瘤細(xì)胞的能力，而對(duì)正常細(xì)胞的感染能力有限。由于溶瘤病毒在腫瘤治療領(lǐng)域的潛力，現(xiàn)在已經(jīng)有越來(lái)越多的臨床前研究探索其在實(shí)體瘤中的應(yīng)用［13-14］。本研究結(jié)果表明，共表達(dá)OV-GM/iPDL1能夠產(chǎn)生PD-L1抑制劑，并能夠中和腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)。瘤內(nèi)注射OVGM/iPDL1可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，并增強(qiáng)自身的T細(xì)胞的抗腫瘤活性，從而更有效地阻斷腫瘤生長(zhǎng)。

在一些早期研究中，溶瘤病毒被工程化改造，使其可以表達(dá)免疫刺激因子，如熱休克蛋白、趨化因子和細(xì)胞因子，以激活抗腫瘤免疫反應(yīng)［15-16］。然而，到目前為止，溶瘤病毒療法對(duì)癌癥患者的療效有限。最近的一些研究報(bào)道了表達(dá)PD-1/PD-L1抑制劑的武裝溶瘤病毒，可以激活抗腫瘤免疫反應(yīng)［17］。一種表達(dá)抗人PD-L1抗體的“武裝”溶瘤腺病毒被證明能增強(qiáng)人腫瘤異種移植模型中的溶瘤活性［18］。表達(dá)PD-1單鏈抗體的溶瘤單純皰疹病毒（HSV）在臨床前的腦膠質(zhì)瘤小鼠模型中被發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)持續(xù)的抗腫瘤反應(yīng)［19］。一種表達(dá)PD-1胞外區(qū)的重組黏液瘤病毒（VPD1）被發(fā)現(xiàn)能抑制PD-1/PDL1信號(hào)通路，并激活抗腫瘤免疫［20］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染后腫瘤微環(huán)境中PD-L1表達(dá)的反應(yīng)性上調(diào)導(dǎo)致腫瘤對(duì)溶瘤免疫治療產(chǎn)生抵抗［21］。本研究證明，“武裝”溶瘤病毒分泌的PD-L1抑制劑、GMCSF產(chǎn)生了較傳統(tǒng)的溶瘤病毒更好的抑瘤活性，這一方面歸因于PD-L1抑制劑與腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)的PD-L1結(jié)合，解除了免疫抑制活性，同時(shí)GM-CSF作為一種免疫刺激因子，進(jìn)一步激活了機(jī)體的免疫反應(yīng)，在本項(xiàng)研究中，這種協(xié)同增效的作用充分反應(yīng)在經(jīng)過(guò)“武裝”溶瘤病毒治療后，腫瘤浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞的炎癥細(xì)胞因子分泌能力顯著增強(qiáng)，因此這種經(jīng)過(guò)改造的溶瘤病毒代表了一種有效的、個(gè)體化的腫瘤特異性溶瘤免疫療法。

綜上所述，這種經(jīng)過(guò)改造的溶瘤病毒能夠通過(guò)發(fā)揮溶瘤活性，并通過(guò)表達(dá)GM-CSF和PD-L1抑制劑產(chǎn)生協(xié)同作用來(lái)激活T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)，從而提供了一種有效的、特異性的腫瘤免疫療法，該療法可單獨(dú)或與免疫檢查點(diǎn)抑制劑、靶向治療和化療聯(lián)合用于胃癌患者，為胃癌的治療提供新的思路。