董國(guó)霞 張華捷 晁哲 田霖 侯啟明 譚亞軍 馬霄（中國(guó)食品藥品檢定研究院百白破疫苗和毒素室，衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102629）

破傷風(fēng)疫苗是預(yù)防破傷風(fēng)的有效途徑，破傷風(fēng)類毒素是破傷風(fēng)疫苗的主要有效組分，破傷風(fēng)疫苗效價(jià)檢測(cè)是疫苗有效的重要指標(biāo)。本研究擬通過抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體的制備為破傷風(fēng)疫苗效價(jià)檢測(cè)新方法的建立、低含量破傷風(fēng)類毒素測(cè)定、吸附度測(cè)定等奠定基礎(chǔ)，以提升我國(guó)破傷風(fēng)疫苗質(zhì)量控制水平。

1 材料與方法

1.1 材料破傷風(fēng)類毒素由本室提供；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗為Invitrogen產(chǎn)品；石蠟油為MP Bio‐medical產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清為Gibco產(chǎn)品；G蛋白柱為GE Healthcare產(chǎn)品；超濾管為Milli‐pore產(chǎn)品；96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板為Greiner Bio-One GmbH產(chǎn)品；抗體亞類鑒定試劑盒為Proteintech產(chǎn)品；其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由本室保存；BALB/c小鼠、昆明小鼠由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)與供應(yīng)室提供。3K30高速冷凍離心機(jī)為Sigma產(chǎn)品；5810R低速離心機(jī)為Eppendorf產(chǎn)品；AKTA層析系統(tǒng)為Amer‐sham pharmacia biotech產(chǎn) 品；Biacore T200為GE Healthcare產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為Bio-Tek產(chǎn)品；電泳儀為Bio-Rad產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體的制備及純化［1-2］選擇純度較好的破傷風(fēng)類毒素抗原對(duì)BALB/c雌性小鼠進(jìn)行免疫，按常規(guī)方法將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，把篩選后獲得的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)種、保存。取BALB/c雌性小鼠，每只腹腔注射0.5 ml石蠟油，10 d后每只小鼠腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射1周后收集腹水，3 000 r/min離心20 min，收集中間層，-20℃凍存。用AKTA層析系統(tǒng)和Protein G柱對(duì)收集的中間層進(jìn)行純化。

1.2.2 單克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)［3］用破傷風(fēng)類毒素包被96孔酶標(biāo)板，4℃孵育過夜，洗板后第一行加入稀釋的單克隆抗體，倍比稀釋至第8行，37℃孵育1 h，洗板后加入過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，洗板后加入OPD顯色液，孵育10 min，在波長(zhǎng)490 nm/630 nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)其OD值。以P/N≥2.1的抗體最大稀釋度作為其抗體效價(jià)。

1.2.3 單克隆抗體的亞類鑒定用Proteintech抗體亞類鑒定試劑盒按其說明書操作步驟對(duì)單克隆抗體進(jìn)行亞類檢測(cè)。

1.2.4 單克隆抗體的親和力測(cè)定利用Biacore T200檢測(cè)單克隆抗體與破傷風(fēng)抗原的親和力數(shù)據(jù)。按Mouse Antibody Capture Kit說明書通過氨基偶聯(lián)法固定鼠源抗體至CM5芯片上，加入合適濃度的破傷風(fēng)抗原，分別與不同單克隆抗體進(jìn)行結(jié)合再解離，所得傳感圖利用其分析軟件進(jìn)行擬合，獲得抗體與抗原的親和力數(shù)據(jù)。

1.2.5 單克隆抗體的蛋白濃度測(cè)定用NanoDrop 2000分光光度計(jì)的Protein A280進(jìn)行單克隆抗體的蛋白濃度檢測(cè)。

1.2.6 單克隆抗體的純度分析［4］將純化的單克隆抗體用SDS-PAGE電泳進(jìn)行純度分析。

1.2.7 單克隆抗體的特異性分析［5-6］用破傷風(fēng)類毒素（T）、白喉類毒素（D）、百日咳毒素（PT）、百日咳絲狀血凝素（FHA）和百日咳黏附素（PRN）分別包被酶標(biāo)板，4℃孵育過夜，洗板后各包被抗原分別加入T1、T2、T3、T4、T5單克隆抗體，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，之后同1.2.2中操作。

1.2.8 單克隆抗體的中和活性分析［7］按2015版藥典破傷風(fēng)抗毒素效價(jià)測(cè)定法測(cè)定單克隆抗體的中和活性。試驗(yàn)分別設(shè)樣品組、標(biāo)準(zhǔn)組、毒素組和空白組；樣品組中昆明小鼠注射T1、T2、T3、T4、T5單克隆抗體各稀釋度與毒素中和后的溶液及T1、T2、T3、T4、T5單克隆抗體混合后各稀釋度與毒素中和后的溶液（分別為T1樣品組、T2樣品組、T3樣品組、T4樣品組、T5樣品組和T6樣品組），樣品組分為3個(gè)不同的稀釋度；標(biāo)準(zhǔn)組中昆明小鼠注射破傷風(fēng)抗毒素標(biāo)準(zhǔn)品與毒素中和后的溶液；毒素組中昆明小鼠只注射稀釋后的毒素溶液；空白組中昆明小鼠只注射緩沖液；注射后連續(xù)5 d觀察小鼠存活情況。

1.2.9 雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性檢測(cè)T1、T2、T3、T4、T5雜交瘤細(xì)胞株在液氮罐凍存2個(gè)月及13個(gè)月后各復(fù)蘇1次，檢測(cè)復(fù)蘇后細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)；并在13個(gè)月解凍后連續(xù)培養(yǎng)傳至20代，每5代檢測(cè)1次細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)，以檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 制備及純化抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體通過制備、純化獲得T1、T2、T3、T4、T5共5個(gè)抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體。

2.2 效價(jià)檢測(cè)檢測(cè)T1、T2、T3、T4、T5單克隆抗體的腹水效價(jià)為1∶1.60×106～1∶1.28×107，純化后其效價(jià)為1∶3.20×106～1∶1.28×107，見表1。

表1 腹水及純化單克隆抗體效價(jià)（McAbs）Tab.1 Titer of ascites and purified monoclonal antibodies（McAbs）

2.3 抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體的亞類鑒定用抗體亞類鑒定試劑盒對(duì)5株單抗進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明5株單抗分別為IgG1、IgG2b亞類，輕鏈均為к型，如表2所示。

表2 抗體亞類鑒定Tab.2 Identification of antibody subclass

2.4 單克隆抗體的親和力測(cè)定通過Biacore檢測(cè)單克隆抗體與破傷風(fēng)類毒素的親和力，見圖1～5，T1、T2、T3、T4、T5單克隆抗體與破傷風(fēng)類毒素的親和力數(shù)據(jù)分別為5.455E-9 M、2.074E-8 M、2.050E-9 M、2.021E-9 M和1.295E-9 M。

圖1 T1單抗結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Binding dynamics curve of T1 McAb

2.5單克隆抗體的蛋白濃度測(cè)定通過NanoDrop 2000分光光度計(jì)Protein A280檢測(cè)抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體T1、T2、T3、T4、T5的蛋白濃度分別為：15.126 mg/ml、5.772 mg/ml、12.278 mg/ml、12.58 mg/ml和16.301 mg/ml。

圖2 T2單抗結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Binding dynamics curve of T2 McAb

圖3 T3單抗結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Binding dynamics curve of T3 McAb

2.6 單克隆抗體的純度分析將純化的單克隆抗體用SDS-PAGE電泳進(jìn)行純度分析，電泳結(jié)果顯示各單克隆抗體具有較好的純度，分子量在預(yù)期范圍內(nèi)，見圖6。

圖4 T4單抗結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Binding dynamics curve of T4 McAb

圖5 T5單抗結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5 Binding dynamics curve of T5 McAb

圖6 單克隆抗體的SDS-PAGE電泳Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis of McAbs

2.7 單克隆抗體的特異性分析采用ELISA法對(duì)T1、T2、T3、T4、T5單克隆抗體的特異性進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果見表3，從表中可以看出T1、T2、T3、T4、T5單克隆抗體與T抗原具有較好的反應(yīng)，而與百白破疫苗中的D抗原、PT抗原、FHA抗原和PRN抗原無交叉反應(yīng)，說明T1、T2、T3、T4、T5單克隆抗體均具有較好的特異性。

表3 ELISA法對(duì)單抗的特異性分析Tab.3 Specific analysis of monoclonal antibodies by ELISA

2.8 單克隆抗體的中和活性分析注射后小鼠存活情況如表4（表中T1-1為低稀釋度，T1-2為中稀釋度，T1-3為高稀釋度，下同）。標(biāo)準(zhǔn)組小鼠在注射后24 h均存活，無發(fā)病癥狀，24 h之后開始發(fā)病，第5天時(shí)全部死亡?？瞻捉M和T6樣品組各稀釋度小鼠在注射后5 d內(nèi)均存活，且無癥狀。毒素組和T2樣品組小鼠在注射后16 h全部死亡。T1、T3、T4、T5樣品組在注射16 h后均有小鼠存活，T1-1有1只小鼠存活，T1-2、T1-3小鼠均死亡，由于T1-1僅有1只小鼠存活，不能確定其是否為中和性抗體；T3-1組的3只小鼠均存活，T3-2、T3-3小鼠均死亡，判斷其為中和性抗體；T4樣品組低、中稀釋度無小鼠存活，而高稀釋度有1只小鼠存活，但發(fā)病癥狀明顯；T5樣品組各稀釋度均有小鼠存活，T5-1、T5-2、T5-3的小鼠分別存活3只、2只、1只，隨稀釋度由低到高小鼠存活呈一定梯度，24 h時(shí)T5-1的3只小鼠仍存活，T5-2、T5-3的小鼠均死亡，判斷其為中和性抗體。

表4 各組小鼠存活情況Tab.4 Survival numbers of mice in each group

2.9 雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性檢測(cè)穩(wěn)定性檢測(cè)如表5，結(jié)果顯示雜交瘤細(xì)胞株在凍存2個(gè)月、13個(gè)月后復(fù)蘇及連續(xù)培養(yǎng)20代后，細(xì)胞上清效價(jià)未見明顯變化，表明其均能分泌特異性抗體，且分泌能力基本保持不變。

表5 雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體穩(wěn)定性檢測(cè)Tab.5 Stability test of antibodies secretion by hybridoma cell strains

3 討論

辛酸-硫酸銨鹽析和G蛋白親和層析是純化單克隆抗體時(shí)常用的兩種方法，本課題組曾用兩種方法分別對(duì)單克隆抗體進(jìn)行純化，辛酸-硫酸銨鹽析法成本低，一次可進(jìn)行大量樣品的純化，但回收率遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道的39%～90%［2，8-10］，可能與不同抗體類型及不同來源的樣品有關(guān)，G蛋白親和層析法純化后單克隆抗體的回收率和純度均較好，因此本研究采用G蛋白親和層析柱進(jìn)行純化。

本研究純化的T3、T5單克隆抗體對(duì)破傷風(fēng)毒素具有中和作用，當(dāng)把5個(gè)單克隆抗體混合后顯示了更強(qiáng)的毒素中和作用，其與破傷風(fēng)毒素的作用有待進(jìn)一步研究。

破傷風(fēng)疫苗效價(jià)是保證疫苗能有效預(yù)防疾病的重要指標(biāo)，當(dāng)前我國(guó)吸附破傷風(fēng)疫苗效價(jià)檢測(cè)采用的是小鼠和豚鼠攻毒法［7］，所用動(dòng)物量較大，檢測(cè)結(jié)果易受動(dòng)物個(gè)體差異影響，且檢測(cè)成本高、工作量大、有接觸毒素的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，不符合“減少、替代、優(yōu)化”的3R動(dòng)物使用原則。針對(duì)當(dāng)前效價(jià)檢測(cè)方法的不足，本研究擬通過破傷風(fēng)單克隆抗體的制備，將其用于破傷風(fēng)抗體體外結(jié)合ELISA檢測(cè)方法中，為建立破傷風(fēng)疫苗效價(jià)檢測(cè)新方法奠定基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)用同一批動(dòng)物血清同時(shí)檢測(cè)破傷風(fēng)、白喉等多種抗體，尤其是隨著越來越多多聯(lián)多價(jià)聯(lián)合疫苗的出現(xiàn)，將大大減少動(dòng)物的使用量、工作量和實(shí)驗(yàn)成本，提升我國(guó)吸附破傷風(fēng)疫苗效價(jià)檢測(cè)水平。本研究成功制備了5個(gè)破傷風(fēng)單克隆抗體，其可用于破傷風(fēng)疫苗效價(jià)檢測(cè)新方法的建立、破傷風(fēng)類毒素含量測(cè)定和吸附度測(cè)定等。