郭婉怡 袁蓓 張鈮雪 孔祥英 蘇曉 慧林娜（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700）

關(guān)節(jié)周圍的軟骨破壞和骨質(zhì)侵蝕是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的主要病理特征，也是RA患者致殘的主要原因［1］。約75% RA患者在發(fā)病的頭兩年即發(fā)生骨質(zhì)破壞，60%患者5年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)畸形及骨質(zhì)侵蝕。一旦骨質(zhì)遭到破壞，則意味著其病理改變進(jìn)入不可逆期。因此，延緩甚至阻斷骨質(zhì)破壞是RA治療的重要策略之一。

現(xiàn)代研究證明氧化應(yīng)激在RA病情進(jìn)展中具有重要作用，其中活性氧（reactive oxygen species，ROS）作為氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，大量存在于RA患者的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，通過臨床試驗(yàn)證實(shí)ROS可作為RA患者病情進(jìn)展的一個(gè)潛在標(biāo)記物［2-3］。當(dāng)RA關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)加速，產(chǎn)生ROS超過生理承受能力時(shí)，其不僅可以損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等，而且還能作為重要的內(nèi)源性信號(hào)調(diào)節(jié)因子，擴(kuò)大滑膜炎癥反應(yīng)［4-7］。以往研究證實(shí)，ROS對(duì)于RA滑膜成纖維細(xì)胞的增殖以及炎癥因子的產(chǎn)生有很明顯的促進(jìn)作用，抑制ROS可以顯著下調(diào)RA滑膜成纖維細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-1、IL-6和IL-33等［8-9］。然而，ROS與RA骨破壞的關(guān)系如何，ROS能否調(diào)控破骨細(xì)胞的形成和分化等相關(guān)問題尚待明確。本文擬通過建立CIA大鼠模型檢測(cè)ROS的水平及體外破骨細(xì)胞分化體系考察ROS的變化規(guī)律，來揭示ROS與RA骨破壞的關(guān)系，為抗RA骨破壞藥物研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，6~8周齡；SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重（150±20）g。動(dòng)物均購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司［許可證號(hào)SYXK（京）2015-0041］，飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，日光燈照明，空調(diào)控溫，實(shí)驗(yàn)操作符合中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)2018-066。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與儀器N-乙酰半胱氨酸（N-acetyll-cysteine，NAC）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；α-MEM培養(yǎng)基（貨號(hào)：SH30265.01）和優(yōu)質(zhì)胎牛血清（貨號(hào)：ST30-3302）購(gòu)自Gibco公司；Trizol試劑（批號(hào)：15596018）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：K1622）購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司；CTSK（組織蛋白酶K）、MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶9）、TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）、GAPDH（磷酸甘油醛脫氫酶）引物序列由Life Technologies公司合成；RANKL、M-CSF（批號(hào)分別為315-11、315-02）購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；2 mg/ml牛Ⅱ型膠原溶液和不完全弗氏佐劑（IFA）（貨號(hào)分別為20022、7002）購(gòu)自Chondrex公司；蘇木精、伊紅染色液（貨號(hào)分別為ZLI-9610、ZLI-9613）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Masson三色染色液（貨號(hào)：DC0032）購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。全自動(dòng)酶標(biāo)儀（型號(hào)：MK3型）、二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)371型）和熒光定量PCR儀（型號(hào)：ABI7500型）購(gòu)自Thermofishe公司；低速臺(tái)式離心機(jī)（型號(hào)：TD5A-WS型）購(gòu)自長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡（型號(hào)：CKX31型）、正置顯微鏡（型號(hào)：BX50）購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠CIA模型的建立將16只SD大鼠隨機(jī)平分為空白組、CIA模型組，每組8只。建立模型：取適量牛Ⅱ型膠原溶液與等體積的不完全弗氏佐劑（IFA）充分混合乳化，制得濃度為l mg/ml的牛Ⅱ型膠原乳劑；每只大鼠尾根部皮內(nèi)注射0.2 ml。初次免疫7 d后，進(jìn)行二次免疫，每只大鼠尾根部皮內(nèi)注射0.1 ml。二次免疫后每48 h觀察1次并記錄大鼠四肢發(fā)病狀況?？瞻捉M在相同部位皮內(nèi)注射等量生理鹽水。

1.2.2 動(dòng)物取材及組織病理切片檢測(cè)一免后第30天進(jìn)行取材，右后肢放在組織固定液中固定72 h，用10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）脫鈣液脫鈣處理1個(gè)月，常規(guī)脫水，石蠟包埋并切片，將切片脫蠟至水，進(jìn)行HE染色、Masson染色和TRAP染色。鏡下觀察大鼠關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、軟骨和骨基質(zhì)破壞及TRAP陽(yáng)性細(xì)胞形成等情況，采集圖像，進(jìn)行分析。

1.2.3 關(guān)節(jié)組織中ROS生成的檢測(cè)將切片常規(guī)脫蠟，經(jīng)抗原修復(fù)、0.1%Triton X-100破膜、0.3%H2O2甲醇溶液抑制內(nèi)源性過氧化物酶處理后，加入DHE-ROS熒光探針，最后DAPI染核3 min并進(jìn)行封片，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 體外破骨細(xì)胞分化模型的建立小鼠脫頸法處死，置于75%酒精中消毒，無菌分離雙側(cè)后肢股骨與脛骨，于超凈臺(tái)內(nèi)用PBS洗滌3次，再使骨髓腔充分暴露，用裝有無血清α-MEM培養(yǎng)基的5 ml注射器反復(fù)吹洗骨髓腔至發(fā)白，吹散細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行過濾，后將其吸入15 ml離心管，1 500 r/min離心5 min，棄上清；加入紅細(xì)胞裂解液混勻，靜置2 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清；無菌PBS清洗1次，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后用含20 ng/ml M-CSF的 培 養(yǎng) 基 稀 釋 細(xì) 胞2.5×105個(gè)/ml接 種 于24孔板中，每孔1 ml。培養(yǎng)72 h后Control組繼續(xù)使用M-CSF誘導(dǎo)，而RANKL組和給藥組在含M-CSF的基礎(chǔ)上加入RANKL誘導(dǎo)，細(xì)胞隔天換液，誘導(dǎo)時(shí)間分別為48 h、96 h。

1.2.5 TRAP染色細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的同時(shí)給予NAC（給藥劑量1、2.5、5 mmol/L）干預(yù)48 h、96 h后，將貼有細(xì)胞的玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定液室溫固定10 min，去離子水洗3次；玻片浸入預(yù)熱到37℃的TRAP染色液，避光溫育1 h；去離子水洗3次；再用蘇木素染色1 min，PBS洗3次；自然干燥，中性樹膠封片；光鏡下觀察拍照，以TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞（細(xì)胞核≥3）為破骨細(xì)胞。

1.2.6 鬼筆環(huán)肽染色細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的同時(shí)給予NAC（給藥劑量1、2.5、5 mmol/L）干預(yù)48 h、96 h后，將貼有細(xì)胞的玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定液室溫固定10 min，PBS洗3次，用0.1%Triton X-100細(xì) 胞 穿 孔15 min，5%BSA封 閉1 h，PBS洗3次；羅丹明-鬼筆環(huán)肽避光染色30 min，PBS洗3次；再用DAPI染色3 min，PBS洗3次，吸去多余水分，用抗熒光淬滅封片液封片后于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h、96 h后，PBS漂洗3次，Trizol法提取細(xì)胞總mRNA，核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA濃度。然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；隨后94℃15 s及60℃30 s，40個(gè)循環(huán)，按2-ΔΔCt計(jì)算TRAP、MMP-9、CTSK基因相對(duì)GAPDH的表達(dá)。

1.2.8 免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h、96 h后，將貼有細(xì)胞的玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定液室溫固定10 min，PBS洗3次，用0.1% Triton X-100細(xì)胞穿孔15 min，PBS洗3次，加入相應(yīng)濃度的一抗MMP-9、CTSK，4℃避光孵育過夜；次日PBS洗3次，加入二抗避光孵育1 h，PBS洗3次；羅丹明-鬼筆環(huán)肽避光染色30 min，PBS洗3次；再用DAPI染色3 min，PBS洗3次，吸去多余水分，用抗熒光淬滅封片液封片后于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.9 體外破骨細(xì)胞分化中ROS的檢測(cè)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h、96 h后，將貼有細(xì)胞的玻片取出，PBS洗3次，在37℃下加入熒光探針DCFH-DA避光孵育30 min，PBS洗3次后抗熒光淬滅封片液封片，于激光掃描共聚焦顯微鏡下拍照，每張玻片隨機(jī)取10個(gè)位置視野，采用Image J進(jìn)行熒光陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)，3個(gè)復(fù)孔取均值，結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度/視野表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理Image J軟件對(duì)采集圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIA模型大鼠炎癥關(guān)節(jié)骨破壞情況如圖1A所示，CIA大鼠關(guān)節(jié)紅腫明顯，病程后期紅腫處甚至發(fā)生變形。此外，Masson、HE和TRAP染色結(jié)果顯示，空白組（Control）大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)良好，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，軟骨和軟骨下骨邊界清晰，TRAP陽(yáng)性染色較淺；而CIA大鼠的Masson染色可見關(guān)節(jié)腔內(nèi)侵入大量纖維化組織，潮線附近有大量火焰狀突起的紅染，軟骨和軟骨下骨邊界不清晰；HE染色可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞異常增生，軟骨和骨小梁大面積被侵襲；TRAP染色可見軟骨和骨小梁交界處TRAP陽(yáng)性染色明顯，破骨細(xì)胞數(shù)目明顯增多，結(jié)果如圖1B~D。

圖1 CIA模型大鼠炎癥關(guān)節(jié)骨破壞情況Fig.1 Situation about bone destruction of inflammatory joints in CIA model rats

2.2 CIA大鼠關(guān)節(jié)組織中ROS的表達(dá)結(jié)果如圖2所示，ROS熒光染色后細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)染，胞中ROS呈現(xiàn)紅染?？瞻捉M關(guān)節(jié)組織ROS熒光強(qiáng)度比較弱，CIA造模后，關(guān)節(jié)骨破壞處表現(xiàn)強(qiáng)ROS陽(yáng)性染色，即ROS在CIA大鼠關(guān)節(jié)中大量表達(dá)。

圖2 DHE熒光探針檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)組織ROS的表達(dá)（×400）Fig.2 Detection of ROS expression in rat joint by DHE fluorescence probe（×400）

2.3 RANKL誘導(dǎo)48 h和96 h后BMMs向破骨細(xì)胞分化情況與單獨(dú)M-CSF誘導(dǎo)組相比RANKL誘導(dǎo)組均可見TRAP陽(yáng)性細(xì)胞，其中以96 h組誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化最成熟，細(xì)胞體積最大、胞內(nèi)細(xì)胞核多，TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量也多；48 h組誘導(dǎo)的次之，結(jié)果見圖3A。此外，對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行鬼筆環(huán)肽染色，M-CSF組未見偽足生成，其余兩組均可見明顯的偽足和褶皺區(qū)，其中以96 h組形成的肌動(dòng)蛋白環(huán)最明顯，且可見細(xì)胞內(nèi)的大量細(xì)胞核，結(jié)果見圖3B。

圖3 RANKL體外誘導(dǎo)BMMs向破骨細(xì)胞分化形成情況（×200）Fig.3 Induce BMMs into osteoclasts with RANKL in vitro（×200）

2.4 RANKL誘導(dǎo)48 h和96 h后溶骨相關(guān)基因的表達(dá)情況如圖4A所示，與M-CSF組相比，48 h、96 h組的TRAP、MMP-9、CTSK mRNA表達(dá)均顯著升高，且隨著RANKL誘導(dǎo)時(shí)間持續(xù)增強(qiáng)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果也表明MMP-9、CTSK蛋白在破骨細(xì)胞中大量表達(dá)，見圖4B。

圖4 體外破骨細(xì)胞分化中溶骨相關(guān)活性基因的表達(dá)情況Fig.4 Expression of osteoclast specific genes in osteoclast differentiation in vitro

2.5 RANKL誘導(dǎo)48 h和96 h后破骨細(xì)胞分化體系中ROS的變化利用DCFH-DA熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)原位ROS的表達(dá)，如圖5所示。ROS多聚積于肌動(dòng)蛋白環(huán)處，RANKL誘導(dǎo)48 h、96 h后細(xì)胞內(nèi)ROS熒光密度值顯著高于M-CSF組，且呈時(shí)間依賴性持續(xù)增強(qiáng)，說明在破骨細(xì)胞體外分化過程中ROS表達(dá)水平呈逐漸遞增趨勢(shì)。

圖5 破骨細(xì)胞分化中ROS的變化（×200）Fig.5 Detection of ROS expression in osteoclasts（×200）

2.6 ROS抑制劑NAC對(duì)體外RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的影響在RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的同時(shí)，給予不同濃度的NAC干預(yù)96 h，結(jié)果顯示RANKL組出現(xiàn)大量TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞（核≥3個(gè)），鬼筆環(huán)肽染色后RANKL組可見明顯肌動(dòng)蛋白環(huán)形成，且觀察到細(xì)胞內(nèi)的大量細(xì)胞核。而給予NAC干預(yù)后明顯抑制了破骨細(xì)胞的形成，且中高劑量組未見典型的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞形成，與RANKL組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖6。說明ROS介導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化，抑制ROS產(chǎn)生可明顯抑制破骨細(xì)胞分化。

圖6 TRAP和免疫熒光染色法觀察體外破骨細(xì)胞分化情況Fig.6 Osteoclast differentiation in vitro was observed by TRAP and immunofluorescence staining

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)骨破壞為典型病理特征的慢性、炎癥性、免疫系統(tǒng)性疾病，而破骨細(xì)胞的增殖、活化被認(rèn)為是導(dǎo)致RA骨損傷和骨代謝紊亂的關(guān)鍵因素［10-11］。最近研究表明在RA的發(fā)病和治療過程中，骨破壞與氧化應(yīng)激之間存在密切的相關(guān)性，其中作為氧化損傷重要產(chǎn)物的ROS可能是促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的重要物質(zhì)［12］。ROS泛指氧來源的自由基和非自由基，包含了超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH-）、臭氧（O3）和單線態(tài)氧（1O2）等，由于它們含有不成對(duì)的電子，因而具有很高的化學(xué)反應(yīng)活性［13］。正常情況下，生理水平的ROS能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖分化、凋亡等生理活動(dòng)，而高水平的ROS則破壞氧化還原平衡，可致氧化損傷、功能障礙、疾病甚至細(xì)胞死亡［14-15］。也有大量研究表明各種急、慢性炎癥疾病的病理過程都和過量的ROS刺激息息相關(guān)［16-19］。為進(jìn)一步探索ROS與RA骨破壞的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)首先通過建立CIA大鼠模型，制作病理切片，采用DHE熒光探針檢測(cè)關(guān)節(jié)組織中ROS的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)骨破壞嚴(yán)重的炎癥關(guān)節(jié)中的ROS表達(dá)顯著上調(diào)，這提示ROS可能參與破骨細(xì)胞的分化形成過程。Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，與野生型小鼠相比Nrf2敲除小鼠顯示骨組織中破骨細(xì)胞數(shù)顯著增加，ROS等氧化產(chǎn)物表達(dá)增加，抗氧化酶水平降低［20］，這間接反映了ROS參與破骨細(xì)胞的形成。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，采用RANKL誘導(dǎo)BMMs向破骨細(xì)胞分化建立體外破骨細(xì)胞分化模型，免疫熒光染色檢測(cè)其分化不同階段（即48 h和96 h）中ROS的變化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROS在這兩個(gè)階段中的生成呈趨勢(shì)性顯著升高，組間差異顯著，這和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。TRAP主要反映了破骨細(xì)胞的活性及骨吸收能力，是破骨細(xì)胞的典型標(biāo)志物；CTSK是一種降解Ⅰ型膠原蛋白的半胱氨酸蛋白酶，參與骨基質(zhì)溶解，與骨量的調(diào)節(jié)密切相關(guān)；MMP-9主要功能是降解或重建細(xì)胞外基質(zhì)，參與骨質(zhì)和礦物質(zhì)的降解，是主要的骨溶解性蛋白酶之一。本實(shí)驗(yàn)通過RTPCR法檢測(cè)破骨細(xì)胞分化中溶骨相關(guān)標(biāo)志性基因TRAP、MMP-9和CTSK，發(fā)現(xiàn)隨著ROS的表達(dá)增加，TRAP、MMP-9和CTSK的表達(dá)也是逐步增加，兩者的變化趨勢(shì)高度吻合，ROS可能貫穿破骨細(xì)胞分化的始終。此外，文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)ROS的清除劑諸如脂聯(lián)素、番茄紅素等能明顯抑制ROS等氧化產(chǎn)物的表達(dá)來影響破骨細(xì)胞骨吸收能力［21-22］。本實(shí)驗(yàn)在RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的同時(shí)，加入ROS經(jīng)典抑制劑NAC干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)NAC以劑量依賴性抑制破骨細(xì)胞的形成和分化。因此，ROS可能是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化引發(fā)骨破壞的潛在“催化劑”。

綜上所述，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧ROS在破骨細(xì)胞形成和分化過程中起到了不可替代的作用，通過抑制ROS從而抑制破骨細(xì)胞的形成和活化為抗RA藥物研發(fā)提供了一個(gè)嶄新的方向。本研究結(jié)果有助于將抗氧化應(yīng)激藥物應(yīng)用于RA骨破壞的治療，為擴(kuò)大抗氧化藥物的適應(yīng)癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。