蒙明慮 許建國 陳高 馬迎教（右江民族醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，百色533000）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由多種細胞及細胞組分參與的慢性氣道炎癥、氣道壁重塑和氣道高反應(yīng)性疾病，是一種嚴重危害人類健康的身心疾病［1］。哮喘和焦慮、抑郁等精神性疾病的發(fā)病機制存在關(guān)聯(lián)，且與5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（5-HTT）基因多態(tài)性的功能作用有關(guān)［2-3］。以往研究發(fā)現(xiàn)哮喘的高氣道反應(yīng)主要是由免疫功能障礙引起，其中CD4+T淋巴細胞4個亞群：輔助性T細胞Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細胞Treg起著至關(guān)重要的作用，Th細胞因子的異常表達、Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡是哮喘發(fā)病的免疫學(xué)機制［4-5］。為探討廣西壯族哮喘人群的5-HTT基因rs3794808位點多態(tài)性是否通過影響CD4+T淋巴細胞因子的平衡進而影響哮喘的發(fā)病，本研究采用病例對照研究方法，觀察rs3794808位點多態(tài)性對CD4+T淋巴細胞因子平衡狀態(tài)的影響，為5-HTT基因參與哮喘發(fā)病機制的研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料將廣西西部地區(qū)三甲醫(yī)院收集的221例壯族哮喘患者作為病例組，以208例壯族健康體檢者作為對照組。全部調(diào)查對象均在廣西長期生活、三代均為壯族、未與其他民族通婚，均簽署知情同意書。本研究通過右江民族醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（倫理審查號2017030501）。哮喘診斷標準符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組制定的《中國支氣管哮喘防治指南》［6］，病例組排除標準：①上呼吸道功能不全，慢性阻塞性肺疾?。–OPD），氣管軟化等引起的喘息及合并其他呼吸系統(tǒng)疾?。虎趪乐匦难芗膊?、嚴重肝腎功能不全等其他系統(tǒng)的嚴重疾??；③合并自身免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等疾病。對照組是常規(guī)體檢的健康人，近1個月內(nèi)無急性上呼吸道感染、胸部X線檢查未見異常、無哮喘病史及典型過敏史、無自身免疫性疾病史。

共收集病例組221例，其中男性113例（51.1%），女性108例（48.9%），年齡24~85歲，平均年齡（53.21±13.88）歲；對照組208例，其中男性105例（50.5%），女性103例（49.5%），年齡20~89歲，平均年齡（53.13±15.91）歲，兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.018，P=0.893；t=0.058，P=0.954），資料具有可比性。

1.1.2 試劑及儀器基因分型在北京六合華大基因科技有限公司完成；細胞因子檢測試劑購自TaKaRa公司；基因擴增儀ETC811購自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；DNA測序儀購自Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 標本收集抽取外周靜脈血5 ml，經(jīng)乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）抗凝，其中1 ml血標本用于提取DNA，4 ml血標本用于血清細胞因子水平的檢測。

1.2.2 基因組DNA提取1 ml抗凝血全用于提取DNA，使用TaKaRa公司人全血基因組DNA試劑盒提取DNA，嚴格按照說明書步驟提取DNA，分裝置于-80℃冰箱保存待用。

1.2.3 基因分型采用SNP的PCR重測序法對rs3794808位點進行基因分型。PCR擴增上游引物：5'-CTAACCCAGGCTCCTCA-3'，下 游 引 物：5'-TC‐GCTTTACCCTCATCT-3'。PCR擴增反應(yīng)體系：DNA模板1 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，BGI 2×Su‐per PCR Mix 15 μl；RNase-free H2O 12 μl（總反應(yīng)體積30 μl），配好反應(yīng)體系后基因擴增儀上執(zhí)行以下反應(yīng)程序：96℃預(yù)變性5 min；96℃變性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，共10個循環(huán)；96℃變性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)；72℃延伸5 min，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)物4℃保存。將DNA擴增產(chǎn)物用于測序。測序反應(yīng)體系為：2 μl Mix（Big‐dye3.1、5×sequencing buffer、H2O），2 μl純 化 后 的PCR產(chǎn)物，1 μl引物（5 mmol/L）。測序反應(yīng)程序為：循環(huán)條件為：95℃15 s→（95℃15 s→50℃5 s→60℃90 s）×35個循環(huán)，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)物4℃保存，用ABI 3730XL型DNA測序儀進行測序，部分測序結(jié)果，見圖1。

1.2.4 細胞因子水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17水平，所有試劑均購于TaKaRa公司，整個過程嚴格按照說明書步驟操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗分析；符合正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s表示，兩獨立樣本t檢驗進行兩組間均數(shù)比較，以單因素方差分析進行多組間均數(shù)比較，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組人群SNP位點基因分型及等位基因頻率病例組及對照組的基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律檢驗（χ2=1.067，P=0.893；χ2=0.002，P=0.967），說明兩組人群均具有代表性；病例組和對照組在rs3794808的基因型頻率和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；如圖1、表1。

表1 兩組人群5-HTT基因rs379808位點基因型及等位基因頻率的比較［頻數(shù)（%）］Tab.1 Comparison of polymorphism distribution of locus rs3794808 of 5-HTT gene in two groups［Frequen?cy（%）］

圖1 5-HTT基因rs3794808位點5-3′UTR測序結(jié)果Fig.1 Direct sequencing graph of locus rs3794808 at 5-3'UTR of 5-HTT gene

2.2 5-HTT基因多態(tài)性與哮喘的關(guān)聯(lián)性分析5-HTT基因rs379808位點CT基因型與TT基因型差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），CC基因型、CT+CC基因型與TT基因型差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），CC基因型發(fā)生哮喘的危險度是TT基因型的3.090倍（95%CI：1.084~8.808），C等位基因患哮喘的風(fēng)險是T等位基因的1.608倍（95%CI：1.136~2.276）。見表2。

表2 5-HTT基因rs379808位點基因型的相對危險度分析Tab.2 Relative risk analysis of locus rs3794808 of 5-HTT gene

2.3 兩組人群細胞因子水平比較病例組血清中的IFN-γ和IL-10水平低于對照組，而IL-4和IL-17水平明顯高于對照組；與對照組相比，病例組的IFN-γ/IL-4較低，而IL-17/IL-10較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。見表3。

表3 兩組人群血清細胞因子水平的比較（±s）Tab.3 Comparison of serum cytokine levels between two groups（±s）

表3 兩組人群血清細胞因子水平的比較（±s）Tab.3 Comparison of serum cytokine levels between two groups（±s）

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2.4 病例組中不同基因型哮喘患者細胞因子水平的比較攜帶不同基因型的哮喘患者血清中各細胞因子水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意（P<0.001）；多重比較顯示，與攜帶TT基因型哮喘患者相比，CC基因型哮喘患者血清中IFN-γ和IL-10的濃度較低，而IL-4和IL-17的濃度較高，IFN-γ/IL-4較低，而IL-17/IL-10較高；CT基因型哮喘患者與TT基因型哮喘患者相比較，血清中IL-17較低，IL-17/IL-10較高。見表4、圖2。

圖2 不同基因型哮喘患者血清細胞因子水平的比較Fig.2 Comparison of serum cytokine levels in patients with asthma of different genotypes

表4 病例組中不同基因型哮喘患者血清細胞因子水平的比較（±s）Tab.4 Comparison of serum cytokine levels in patients with asthma of different genotypes in case group（±s）

表4 病例組中不同基因型哮喘患者血清細胞因子水平的比較（±s）Tab.4 Comparison of serum cytokine levels in patients with asthma of different genotypes in case group（±s）

Note：Multiple comparisons，there were significant differences between CC and TT，CT and TT genotypes，1）P<0.001.

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3 討論

哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，由于無法完全治愈、反復(fù)發(fā)作且普遍存在焦慮、抑郁等精神問題，哮喘患者患精神性疾病的風(fēng)險更高［7-8］。哮喘和焦慮、抑郁等精神性疾病之間存在共同的遺傳易感性，重度抑郁的多基因風(fēng)險評分（PRS）與兒童哮喘風(fēng)險升高有關(guān)［9-10］，以往研究表明，體內(nèi)5-HTT基因表達減少會增加哮喘和抑郁的風(fēng)險［3］，5-HTT基因Stin2多態(tài)性與臺州地區(qū)漢族人群哮 喘 的發(fā) 生 呈顯 著 相關(guān)［11］，雖 然5-HTT基 因rs3794808位點與哮喘的關(guān)系鮮有報道，但有研究證實該位點與抑郁等精神性疾患有關(guān)聯(lián)［12］，而哮喘又是一個典型的心身疾病，因而該位點與哮喘的關(guān)系值得探討和研究。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，5-HTT基因rs3794808位點多態(tài)性可能是壯族人群哮喘發(fā)病的潛在遺傳易感性標志，5-HTT作為免疫調(diào)節(jié)劑，參與了炎癥反應(yīng)過程，與哮喘發(fā)作有關(guān)［13］。為了探討5-HTT基因rs3794808位點與哮喘的關(guān)系是否通過調(diào)節(jié)細胞因子網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，本研究進行了病例對照研究，發(fā)現(xiàn)5-HTT基因rs3794808位點CC基因型和C等位基因是壯族人群哮喘發(fā)病的危險因素，與前期研究結(jié)果一致［13］，在此基礎(chǔ)上，通過檢測CD4+T淋巴細胞因子進一步了解5-HTT基因rs3794808位點多態(tài)性與Th1/Th2、Th17/Treg平衡的關(guān)系。

哮喘的慢性氣道炎癥由多種細胞免疫參與反應(yīng)，Th1/Th2細胞及其細胞因子失衡是哮喘發(fā)病的基礎(chǔ)［14］。在正常機體中，IFN-γ和IL-4互相拮抗，維持Th1/Th2平衡，當機體受變應(yīng)原刺激時，Th1/Th2失衡，Th2占優(yōu)勢，分泌大量IL-4，抑制IFN-γ活性，促進炎癥介質(zhì)釋放，使杯狀細胞增生，氣道黏液分泌增多，氣管增厚，導(dǎo)致氣道狹窄而促使哮喘發(fā)作［15-16］。Th2細胞分泌的IL-4是慢性炎癥和氣道高反應(yīng)性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，哮喘患者血清的IL-4高于正常對照組，Th1分泌的IFN-γ可抑制輕度和中度哮喘的發(fā)作，IFN-γ與哮喘的嚴重程度呈負相關(guān)［17］。LIANG等［18］對哮喘小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照小鼠比較，哮喘小鼠的IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，體內(nèi)Th1/Th2免疫失衡。有報道糖皮質(zhì)激素通過抑制Notch1信號傳導(dǎo)，調(diào)整小鼠哮喘過敏性氣道炎癥中涉及的Th1/Th2平衡從而達到抗炎的目的［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，壯族哮喘人群的IFN-γ水平降低而IL-4水平升高，IFN-γ/IL-4較低，說明Th1/Th2細胞因子免疫失衡參與了壯族人群哮喘炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

以往對哮喘的研究主要集中在Th1/Th2細胞免疫失衡，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Th1/Th2細胞免疫失衡不足以說明哮喘的炎癥反應(yīng)，哮喘還與Th17和Treg失衡有關(guān)［20］。Th17細胞經(jīng)過活化后誘導(dǎo)生成IL-17，IL-17會募集中性粒細胞，促進炎癥細胞因子在氣道內(nèi)的大量表達［21］，導(dǎo)致組織破壞和炎性細胞浸潤，打破體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)平衡，進一步加劇哮喘的發(fā)作。Treg細胞分泌TGF-β、IL-10等細胞因子，抑制嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞的活化，減輕Th2細胞因子IL-4的分泌，從而抑制氣道炎癥反應(yīng)，抑制哮喘的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)哮喘患兒的Th17細胞頻率升高、Th17/Treg升高，而且與氣道高反應(yīng)性相關(guān)，在對兒童及成人哮喘的研究中都觀察到了Th17/Treg細胞因子的失衡，并與成人哮喘病情的嚴重程度有關(guān)［22-24］。本次研究發(fā)現(xiàn)壯族哮喘人群的IL-10水平比較低，IL-17水平明顯高于對照組，IL-17/IL-10增高，提示Th17/Treg細胞因子在壯族哮喘人群中比例失衡。為哮喘的靶點治療提供理論依據(jù)。

本研究顯示5-HTT基因rs3794808位點CC基因型發(fā)生哮喘的危險性是TT基因型的3.090倍（95%CI：1.084~8.808），為了解5-HTT基因型的差異是否影響Th細胞因子平衡，對不同基因型哮喘患者的細胞因子水平的比較顯示，與攜帶TT基因型哮喘患者相比，CC基因型哮喘患者血清中的IFN-γ和IL-10表達下降，IL-4和IL-17表達升高，IFN-γ/IL-4降低及IL-17/IL-10增高，提示5-HTT基因多態(tài)性可能與CD4+T淋巴細胞因子的表達有關(guān)，有可能通過影響Th1/Th2、Th17/Treg平衡從而影響哮喘的發(fā)病，此結(jié)果從另一個角度為哮喘機制研究提供了切入點和線索，但其中的復(fù)雜機制還有待進一步的研究證實。