黃欣 李欣怡 李成文（西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，瀘州646000）

Graves病（Graves disease，GD）又稱為毒性彌漫性甲狀腺腫，是碘充足國(guó)家甲狀腺功能亢進(jìn)的最常見原因，約占全部甲狀腺功能亢進(jìn)癥的80%以上，影響0.5%~2.0%的人口［1-2］。未矯正的甲狀腺功能亢進(jìn)癥患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加，心血管疾病發(fā)病率高，包括心律失常，中風(fēng)和心力衰竭［3］。甲狀腺相關(guān)自身抗體的異常分泌是該病最突出的免疫學(xué)特征。促甲狀腺素受體抗體（thyrotrophin receptor anti‐body，TRAb）是與GD最密切的甲狀腺相關(guān)自身抗體，幾乎在每個(gè)該病患者中都可檢測(cè)到，但TRAb異常分泌的免疫學(xué)調(diào)控機(jī)制仍未完全明確。目前GD治療方法主要包括131I治療，抗甲狀腺藥物治療等，131I治療有效率高，但易發(fā)生甲減副作用不可逆，抗甲狀腺藥物治療治愈率低、易復(fù)發(fā)［4-6］。

黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞（mucosal-associated invari‐ant T，MAIT）是最新發(fā)現(xiàn)的一種非傳統(tǒng)T淋巴細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道，MAIT促進(jìn)炎癥和腸道失調(diào)，導(dǎo)致肥胖期間的代謝功能障礙，促進(jìn)T1D的發(fā)展，也參與了自身免疫性肝病中肝臟纖維化和SLE的發(fā)?。?-10］。也有文獻(xiàn)報(bào)道MAIT參與了抗SARS-CoV-2和抗帶狀皰癥病毒的免疫應(yīng)答［11-13］。但目前尚無研究報(bào)道MAIT在GD中的免疫學(xué)作用。本研究初步探討了MAIT在GD中的免疫學(xué)作用，擬為GD的免疫治療提供新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料GD患者為2019年5月至2020年6月期間在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科和內(nèi)分泌科就診患者。收集30例GD初治患者為治療前組，男、女各15例，平均年齡44.62歲；其中19例131I治療3個(gè)月后的GD患者為治療后組，男10例，女9例，平均年齡47.58歲；收集25例該院健康體檢中心的健康體檢者為對(duì)照組，男11例，女14例，平均年齡39.80歲。19例131I治療3個(gè)月后的GD患者與治療前為同一批患者。治療后組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國(guó)甲狀腺疾病診治指南》GD疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)；自愿參加本試驗(yàn)，簽署知情同意書，能遵守研究要求的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤、傳染病、妊娠期甲亢、炎癥甲亢患者；T1D、SLE等自身免疫性疾病患者；近期內(nèi)用過抗甲狀腺藥物、放射性碘等治療患者；重要臟器嚴(yán)重受損者。該研究通過西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批并按要求執(zhí)行。3組臨床資料比較見表1。

表1 3組臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics among three groups

1.1.2 試劑APC-CY7-抗CD3、PE-抗CD161、PE-抗Human Invariant NKT（6B11）、APC-抗CD69、PECY7-抗IFN-γ、APC（AF647）-抗GrzB、Human BD Fc Block、Leukocyte Activation Cocktail、Human TGF-β、IFN-γ、IL-17A和IL-4 Flex set購自美國(guó)BD公司；LEGENDplexTMMul-Analyte Flow Assay Kit、percpcy5.5-抗TCR Vα7.2、PE-CY7-抗Annexin V、Zombie GreenTMFixable Viability Kit購自美國(guó)BioLegend公司；1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；Recombinant Hu‐man IL-12p70購 自Pepro Tech公 司；Recombinant Human IL-18購自R&D Systems公 司；Ficoll-plaque plus購 自GE healthcare公 司；總RNA提 取 試 劑RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本制備采集健康志愿者及患者EDTA抗凝血，先分離血漿用于測(cè)定細(xì)胞因子，再用Ficollplaque plus分離余下外周血單個(gè)核細(xì)胞后計(jì)數(shù)，部分細(xì)胞用于提取總RNA后測(cè)定mRNA，剩余細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多色流式細(xì)胞染色PBMCs復(fù)蘇后，按照抗體試劑盒使用說明書進(jìn)行多色流失細(xì)胞染色再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 檢測(cè)血漿細(xì)胞因子采用微量樣本多指標(biāo)蛋白定量技術(shù)（cytometric bead array，CBA）檢測(cè)IFN-γ、IL-4、IL-17A和TGF-β，多細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)（LEG‐ENDplex）檢測(cè)IL-12p70和IL-18，按照試劑說明書采用流式細(xì)胞儀快速測(cè)定待檢血漿細(xì)胞因子。

1.2.4 細(xì)胞因子mRNA檢測(cè)

1.2.4.1 總RNA的提取用氯仿提取總RNA，測(cè)量OD260/OD280和樣品濃度并用瓊脂糖電泳檢測(cè)18 S和28 S條帶的完整性。

1.2.4.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)PCR儀中42℃反應(yīng)2 min去除基因組DNA后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR反應(yīng)條件：37℃15 min；85℃5 s；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束，將cDNA瞬時(shí)離心后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3 qRT-PCR定量檢測(cè)mRNA反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃延伸30 s，循環(huán)40次。采用β-actin作內(nèi)參基因，以公式ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組均值）計(jì)算細(xì)胞因子基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 體外MAIT培養(yǎng)健康對(duì)照組和GD患者治療前組PBMCs分別為刺激組和未刺激組，刺激組均加入IL-12p70（10 ng/ml）和IL-18（100 ng/ml），培養(yǎng)24 h后各組均分別取部分細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子，剩余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)96 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理由GraphPad Prism 7.0（Graph‐Pad軟件）分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布、等方差的資料采用t檢驗(yàn)或one way ANOVA進(jìn)行組間比較；對(duì)于非正態(tài)分布的資料，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較，配對(duì)資料采用Wilcoxon配對(duì)符號(hào)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GD患者治療前、后組外周血MAIT頻率及表型和功能變化將CD3+TCR Vα7.2+CD161+的細(xì)胞認(rèn)定為MAIT，檢測(cè)3組外周血MAIT頻率，與對(duì)照組相比，GD患者治療前組MAIT頻率顯著降低（P<0.01）；治療后組也顯著降低（P<0.05）；與治療前組相比，治療后組MAIT頻率輕度升高（P>0.05，圖1）。

圖1 健康對(duì)照組和GD患者治療前、后組MAIT頻率Fig.1 Frequency of MAIT of healthy controls，GD pa?tients of before treatment and GD patients of after treatment

檢測(cè)3組外周血MAIT的表面標(biāo)志和胞內(nèi)細(xì)胞因子結(jié)果，與對(duì)照組相比，GD患者治療前組CD69水平顯著升高（P<0.000 1）；治療后組也顯著升高（P<0.001）；和治療前組相比，治療后組CD69輕度升高（P>0.05），圖2A。經(jīng)PMA和離子霉素刺激后，與對(duì)照組相比，GD患者治療前組MAIT胞內(nèi)IFN-γ水平顯著降低（P<0.000 1，圖2B），GrzB水平升高（P<0.05，圖2C）；治療后組MAIT胞內(nèi)IFN-γ水平顯著降低（P<0.001，圖2B），GrzB水平顯著升高（P<0.01，圖2C）。與治療前組相比，治療后組MAIT胞內(nèi)IFN-γ水平升高（P>0.05，圖2B），GrzB水平升高（P>0.05，圖2C）。

圖2 健康對(duì)照組和GD患者治療前、后組MAIT表面標(biāo)志和胞內(nèi)細(xì)胞因子頻率Fig.2 Frequency of MAIT and their surface markers and intracellular cytokines in healthy controls，GD pa?tients of before treatment and GD patients of after treatment

將未治療的GD患者外周血中FT3、FT4、TSH和TRAb的濃度與外周血中MAIT頻率、表面標(biāo)志、胞內(nèi)細(xì)胞因子頻率做相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)TRAb的濃度與表達(dá)CD69的MAIT頻率呈顯著正相關(guān)（r=0.709 7，P<0.01，圖3K），但其他指標(biāo)之間無相關(guān)性（P>0.05，圖3）。

圖3 未治療的GD患者外周血中甲狀腺素、TRAb的濃度與外周血中MAIT頻率、表面標(biāo)志、胞內(nèi)細(xì)胞因子頻率的相關(guān)性Fig.3 Correlation between concentrations of thyroxine and TRAb in peripheral blood and frequency of MAIT，surface markers and intracellular cytokines of untreated GD patients

2.2 甲狀腺中重度腫大患者外周血MAIT的頻率與功能變化依據(jù)GD患者甲狀腺的腫大程度，將甲狀腺一度腫大的未治療GD患者設(shè)為甲狀腺輕度腫大組，甲狀腺二度、三度腫大的未治療GD患者分為甲狀腺中重度腫大組，分析兩組間MAIT頻率、MAIT表面CD69的表達(dá)、胞內(nèi)IFN-γ和GrzB分泌的差異。與健康對(duì)照組相比，中重度組MAIT的頻率顯著降低（P<0.01，圖4A），CD69顯著升高（P<0.001，圖4B），IFN-γ水平顯著降低（P<0.001，圖4C），GrzB水平升高（P<0.05，圖4D）；輕度組MAIT頻率降低（P>0.05，圖4A），CD69水平顯著升高（P<0.01，圖4B），IFN-γ水平顯著降低（P<0.01，圖4C），GrzB水平有所提高（P>0.05，圖4D）。中重度組與輕度組相比，MAIT頻率降低（P<0.05，圖4A），CD69水平升高（P<0.05，圖4B），IFN-γ水平降低（P>0.05，圖4C），GrzB水平升高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖4D）。

圖4 健康對(duì)照組和GD患者不同病情程度中MAIT、表面標(biāo)志和胞內(nèi)細(xì)胞因子的頻率Fig.4 Frequency of MAIT and their surface markers and intracellular cytokines in healthy controls and patients with different degrees of disease in GD patients

2.3 GD患者存在Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡為探索MAIT在GD中的免疫作用，檢測(cè)了3組血漿細(xì)胞因子IL-4、IL-17A、IFN-γ、TGF-β含量。與對(duì)照組相比，GD患者治療前組血漿IFN-γ顯著升高（P<0.000 1，圖5A），IL-4顯著升高（P<0.01，圖5B），IL-17A顯著升高（P<0.000 1，圖5C），TGF-β降低（P>0.05，圖5D）；GD患者治療后組IFN-γ顯著升高（P<0.001，圖5A），IL-4升高（P>0.05，圖5B），IL-17A顯著升高（P<0.00 1，圖5C），TGF-β顯著升高（P<0.000 1，圖5D）。治療后和治療前組相比，治療后IL-17A顯著降低（P<0.01，圖5C），TGF-β顯著升高（P<0.000 1，圖5D），IFN-γ降低（P>0.05，圖5A），IL-4降低（P<0.05，圖5B）?；蛩綑z測(cè)了外周血單個(gè)核細(xì)胞中IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、IL-17A mRNA和TGF-β mRNA的相對(duì)表達(dá)，結(jié)果與3組血漿中各種細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平一致。見圖5E~H。

圖5 健康對(duì)照組和GD患者治療前、后組血漿中的IL-4、IL-17A、IFN-γ、TGF-β的 頻 率 和PBMCs中IL-4 mRNA、IL-17A mRNA、IFN-γ mRNA、TGF-β mRNA的相對(duì)表達(dá)Fig.5 Frequency of IL-4，IL-17A，IFN-γ，TGF-β in plas?ma and relative expression of IL-4 mRNA，IL-17A mRNA，IFN-γ mRNA，TGF-β mRNA in PBMCs in healthy controls，GD patients of before treatment and GD patients of after treatment

2.4 GD患者M(jìn)AIT的IL-12和IL-18激活途徑及基礎(chǔ)凋亡率檢測(cè)檢測(cè)三組血漿細(xì)胞因子IL-12p70和IL-18發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，GD患者治療前組IL-12p70升高（P<0.05，圖6A），IL-18顯著升高（P<0.01，圖6B）；GD患者治療后組IL-12p70升高（P<0.05，圖6A），IL-18顯著升高（P<0.000 1，圖6B）。治療后與治療前相比，IL-12p70和IL-18輕度升高（P>0.05，圖6A、6B）。基因水平檢測(cè)了外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-12p70 mRNA和IL-18 mRNA表達(dá)，結(jié)果與蛋白水平檢測(cè)結(jié)果一致，見圖6C、D。

圖6 健康對(duì)照組和GD患者治療前、后組血漿中IL-12p70、IL-18頻 率 和PBMCs中IL-12p70 mRNA、IL-18 mRNA的相對(duì)表達(dá)Fig.6 Frequency of IL-12p70，IL-18 in plasma and rela?tive expression of IL-12p70 mRNA，IL-18 mRNA in PBMCs in healthy controls，GD patients of be?fore treatment and GD patients of after treatment

GD患者治療前組與對(duì)照組的PBMCs分別加IL-12p70和IL-18重組蛋白體外培養(yǎng)24 h后，治療前組和健康人對(duì)照組MAIT表面CD69的表達(dá)，胞內(nèi)IFN-γ和GrzB的產(chǎn)生均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖7A~C）。提示GD患者M(jìn)AIT的IL-12和IL-18激活途徑正常。

圖7 健康對(duì)照組和GD患者M(jìn)AIT的凋亡Fig.7 Apoptosis of MAIT cells in healthy controls and GD patients

檢測(cè)治療前GD患者組和對(duì)照組的基礎(chǔ)凋亡率顯示，治療前GD患者凋亡率顯著高于健康人對(duì)照組（P<0.001，圖7D）。將GD患者治療前組分為GD患者刺激組和GD患者未刺激組，對(duì)照組分為刺激組和未刺激組，將各組的PBMCs分別加IL-12p70和IL-18重組蛋白體外培養(yǎng)5 d后，結(jié)果顯示對(duì)照刺激組凋亡率顯著高于其未刺激組（P<0.05，圖7E），GD患者刺激組凋亡率也顯著高于其未刺激組（P<0.05，圖7F），且對(duì)照刺激組培養(yǎng)5 d后，檢測(cè)到MAIT的CD69表達(dá)顯著高于未刺激組（P<0.01，圖7G）。結(jié)果提示IL-12和IL-18促進(jìn)了GD患者M(jìn)AIT的活化和活化后凋亡。

3 討論

研究報(bào)道表明MAIT既可致病也可治?。?-13］。目前尚無研究報(bào)道MAIT在GD中的免疫學(xué)作用。激活的MAIT主要通過分泌GrzB、IFN-γ和IL-17A發(fā)揮作用。文獻(xiàn)報(bào)道體外培養(yǎng)的T1D患者的MAIT可能通過產(chǎn)生GrzB直接殺死胰腺β細(xì)胞，MAIT分泌的GrzB在局部抗結(jié)核免疫中也發(fā)揮重要作用［8，14］。GrzB具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能，極低濃度的GrzB即可殺傷細(xì)胞［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)離子霉素和PMA刺激培養(yǎng)后，與對(duì)照組比較，GD中重度組患者M(jìn)AIT產(chǎn)生的GrzB顯著增多，輕度組有升高趨勢(shì)；GD治療前和治療后患者組MAIT產(chǎn)生的GrzB均顯著升高；治療后組與治療前組比較，GrzB有升高趨勢(shì)，圖2C、3D，以上結(jié)果提示MAIT可能通過分泌GrzB殺傷甲狀腺細(xì)胞發(fā)揮抗GD作用。

CD69是MAIT的活化標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)GD治療前組和治療后組外周血中MAIT表達(dá)的CD69都顯著高于健康人對(duì)照組；患者治療后組與治療前組比較，MAIT表達(dá)的CD69呈降低趨勢(shì)，提示治療有效。GD中重度組和輕度組患者M(jìn)AIT表達(dá)的CD69均顯著高于健康人對(duì)照組，且中重度組也顯著高于輕度組。結(jié)果表明GD患者的MAIT處于活化狀態(tài)，且甲狀腺腫大程度越大活化程度越高，圖2A、3B，提示MAIT可能參與了抗GD過程。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，未治療的GD患者外周血中表達(dá)CD69的MAIT頻率和TRAb濃度呈正相關(guān)。而TRAb濃度越大代表病情越重，即GD患者外周血中的TRAb濃度越大，病情越重，活化的MAIT越多，則會(huì)產(chǎn)生的更多的GrzB對(duì)甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，有利于減輕甲狀腺功能亢進(jìn)，進(jìn)一步提示MAIT參與抗GD。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，GD患者輕度組外周血MAIT頻率呈降低趨勢(shì)，中重度組外周血MAIT頻率顯著降低，提示MAIT參與了抗GD作用。GD患者治療后MAIT頻率略高于治療前，提示治療有效；但治療前和治療后組外周血均顯著低于對(duì)照組，可能由于一是GD患者外周血活化的MAIT分泌GrzB發(fā)揮抗GD作用后發(fā)生凋亡，因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)GD患者治療前組MAIT凋亡率高于對(duì)照組，且兩組MAIT都分別經(jīng)IL-12p70和IL-18刺激培養(yǎng)后，刺激組的凋亡率均高于未刺激組，而且對(duì)照組刺激后MAIT表面CD69顯著高于未刺激，提示高水平的IL-12p70和IL-18促進(jìn)了GD患者M(jìn)AIT的活化和活化后凋亡。二是GD患者外周血中MAIT可能遷徙到甲狀腺局部參加抗GD，因有研究報(bào)道，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者循環(huán)MAIT頻率的減少是由于募集到了具有炎癥的滑膜組織［16］。GD通常選用藥物治療或131I治療，選擇切除甲狀腺組織治療的患者很少，所以本研究未收集到GD患者甲狀腺組織樣本進(jìn)行分析，尚存在不足。進(jìn)一步研究可進(jìn)行小鼠GD造模，取小鼠外周血以及甲狀腺組織進(jìn)行分析。

MAIT主要通過TCR-MR1-核黃素代謝物的經(jīng)典激活途徑和IL-12、IL-18旁路激活途徑被激活［17］。未見研究報(bào)道GD患者體內(nèi)存在微生物群的變化，因此GD患者外周血MAIT的表型、功能變化及MAIT丟失可能與MAIT的IL-12和IL-18途徑激活有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)GD患者血漿IL-12和IL-18顯著升高，IL-12p70 mRNA和IL-18 mRNA水平也顯著升高，提示GD患者M(jìn)AIT存在IL-12和IL-18激活途徑。但將IL-12p70和IL-18刺激GD患者和健康志愿者外周血PBMC 24 h后，結(jié)果GD患者與健康對(duì)照組相比，MAIT表面CD69的表達(dá)以及胞內(nèi)IFN-γ和GrzB均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示GD患者M(jìn)AIT的IL-12和IL-18激活途徑正常。

IFN-γ是MAIT發(fā)揮作用的另一重要細(xì)胞因子。血漿中GD患者治療前、治療后組IFN-γ均顯著高于健康對(duì)照組，治療前升高是由于GD是自身免疫病，機(jī)體的免疫應(yīng)答過強(qiáng)所致，治療后升高可能是過強(qiáng)的免疫應(yīng)答還未恢復(fù)到正常，也可能是免疫應(yīng)答偏向Th1型，治療后與治療前相比，IL-4顯著降低。但經(jīng)離子霉素和PMA刺激培養(yǎng)后，GD中重度組和輕度組患者M(jìn)AIT分泌的IFN-γ均顯著低于健康對(duì)照組，且中重度組比輕度組有降低趨勢(shì)，這與IFN-γ分泌越低，免疫應(yīng)答越偏向于Th2型，病情越重相吻合；且刺激培養(yǎng)后治療前和治療后組MAIT分泌的IFN-γ均顯著低于健康對(duì)照組，結(jié)果表明GD患者M(jìn)AIT分泌IFN-γ功能受損，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，導(dǎo)致Th2型應(yīng)答增強(qiáng)［13，16］；而治療后組比治療前組的IFNγ分泌有升高趨勢(shì)，表明治療有效，免疫應(yīng)答偏向于Th1型。

本研究也發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，GD患者治療前組血漿中IFN-γ和IL-4均顯著升高，且IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA均顯著升高，提示GD患者體內(nèi)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答都顯著增強(qiáng)；GD患者治療后組IFN-γ顯著升高，IL-4升高無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且治療后組與治療前組比較，IFN-γ降低無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而IL-4顯著降低，這表明治療后Th2應(yīng)答減弱，偏向于Th1應(yīng)答，提示GD患者中存在Th1/Th2失衡。與健康對(duì)照組相比，GD患者治療前組血漿中IL-17顯著升高，TGF-β則呈下降趨勢(shì)，提示GD患者存在Th17/Treg失衡；治療后組與治療前比較，IL-17顯著降低，TGF-β顯著升高，提示Treg細(xì)胞抑制自身免疫和炎癥反應(yīng)，Th17/Treg趨向平衡，表明治療有效。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)GD患者治療前、后組外周血MAIT均顯著降低，活化標(biāo)志CD69表達(dá)均顯著升高，分泌的GrzB顯著升高，且病情越重，MAIT降低越多，以上結(jié)果均提示MAIT發(fā)揮抗GD作用，IL-12和IL-18可能促進(jìn)了MAIT的活化和凋亡。因此，檢測(cè)GD患者M(jìn)AIT的頻率和功能有助于判斷病情及為GD的免疫治療提供新靶點(diǎn)。