鄒麗絹 李磊 肖政 許美霞 許濤

（武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院，武漢430033）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，AR‐DS）是一種以肺部炎癥迅速發(fā)作為特征的呼吸衰竭，是常見的臨床急癥［1］。ALI/ARDS的臨床特征主要有肺泡毛細(xì)血管屏障損傷、白細(xì)胞聚集、肺水腫、炎癥和肺泡出血等［2-3］。ALI/ARDS的發(fā)病率和死亡率都很高，雖然對(duì)這些疾病的病理生理學(xué)有較為深入的了解，但仍無有效藥物用于提高ALI/ARDS患者的生存率，而抑制肺部劇烈的炎癥反應(yīng)是防治ALI/ARDS的潛在策略［4］。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有自我更新、分化和分泌細(xì)胞因子等功能，研究發(fā)現(xiàn)骨髓、脂肪、肺組織MSC移植可減輕脂多糖（lipo‐polysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的ARDS大鼠肺損傷，改善肺功能，且骨髓、脂肪、肺組織MSC與LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子［5］。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesen‐chymal stem cells，BMSCs）移植處理ALI大鼠后，多種miRNA的表達(dá)出現(xiàn)異常，其中miR-142-3p表達(dá)水平顯著低于ALI模型組［6］。但BMSCs調(diào)控miR-142-3p在ALI/ARDS中的具體作用尚未明確，本研究采用LPS誘導(dǎo)大鼠肺上皮細(xì)胞RLE-6TN制備肺上皮細(xì)胞損傷模型，與不同比例BMSCs共培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子及凋亡水平，以期為BMSCs治療ALI/ARDS提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠肺上皮細(xì)胞RLE-6TN來源于美國ATCC細(xì)胞庫；大鼠BMSCs來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。RPMI1640、DMEM/F12購自美國Hyclone；胎牛血清購自美國Gibco；LPS購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TRIzol購自美國Ambion；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；抗熒光衰減封片劑（含DAPI）、封閉液、Triton X-100、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜和化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Milli‐pore；兔抗鼠NF-κB p65抗體、山羊抗兔二抗（免疫組化）、兔抗鼠Bcl-2抗體、兔抗鼠caspase-3抗體、兔抗鼠GAPDH、山羊抗兔IgG購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將凍存的RLE-6TN細(xì)胞從液氮罐中取出，37℃水浴至凍存液溶解，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，400 g離心3 min。棄上清，加入1 ml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入4 ml含10%胎牛血清的RPMI1640，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。大鼠BMSCs采用DMEM/F12，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 CCK8法篩選LPS誘導(dǎo)時(shí)間及濃度收集對(duì)數(shù)期的RLE-6TN細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度并分布于96孔板中，每孔180 μl，約5×103個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml LPS干預(yù)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h。每孔加入10 μl CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm處吸光值。

1.2.3 qPCR檢測(cè)細(xì)胞miR-142-3p表達(dá)水平TRIzol裂解細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，miR-142-3p引物合成由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成，引物序列：miR-142-3p-F 5'-GGGTGTAGTGTTTCCTAC-3'，miR-142-3p-R 5'-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；U6-F 5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，U6-R 5'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'。反 應(yīng) 程 序：95℃3 min；95℃5 s；56℃10 s；72℃25 s；40個(gè)循環(huán)。以2-??Ct法計(jì)算miR-142-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組與共培養(yǎng)處理將RLE-6TN細(xì)胞分為6組：對(duì)照組、LPS組、BMSCs培養(yǎng)液（DMEM/F12）組、RLE-6TN+BMSCs 1組（RLE-6TN∶BMSCs=10∶2）、RLE-6TN+BMSCs 2組（RLE-6TN∶BMSCs=10∶3）和RLE-6TN+BMSCs 3組（RLE-6TN∶BMSCs=10∶4）。RLE-6TN+BMSCs組均將RLE-6TN與BM‐SCs共培養(yǎng)，具體步驟如下：收集經(jīng)2 μg/ml LPS處理48 h后的RLE-6TN細(xì)胞，更換為新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，分布于6孔Transwell小室下層，每孔2 ml，約3×105個(gè)細(xì)胞。Transwell小室上層分別加入相應(yīng)比例BMSCs，共培養(yǎng)24 h后，取出下室中的RLE-6TN細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.5 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集1.2.4中的各組RLE-6TN細(xì)胞，取約1×106個(gè)細(xì)胞，400 g離心5 min，棄上清液。向細(xì)胞沉淀中加入1 ml預(yù)冷PBS，混勻，400 g離心5 min，棄上清液。加入200 μl預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞沉淀，依此加入10 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，混勻，避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡水平。

1.2.6 qPCR檢測(cè)細(xì)胞miR-142-3p、IL-6及TNF-α mRNA表達(dá)水平收集1.2.4中的各組RLE-6TN細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)操作同1.2.3節(jié)，引物如下：IL-6-F 5'-CCTTCTTGGGACTGATGT-3'，IL-6-R 5'-ACTGGTCTGTTGTGGGTG-3'；TNF-α-F 5'-CCACGCTCTTCTGTCTACTG-3'，TNF-α-R 5'-GCTACGGGCTTGTCACTC-3'。

1.2.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)水平收集1.2.4中的各組RLE-6TN細(xì)胞，約1×106個(gè)細(xì)胞，加入200 μl RIPA裂解液于4℃裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定所提蛋白濃度，取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉2 h后，加入一抗（Bcl-2、caspase-3、GAPDH，稀釋比1∶1 000）孵育1 h，洗膜，二抗（稀釋比1∶20 000）孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑，曝光顯影，記錄灰度值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有檢測(cè)均進(jìn)行3次重復(fù)，采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)時(shí)間及濃度篩選結(jié)果結(jié)果顯示，隨著LPS誘導(dǎo)時(shí)間延長及濃度的升高，對(duì)RLE-6TN細(xì)胞增殖活性的抑制作用越明顯，見圖1。因此，基于本研究檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)和濃度中，選擇對(duì)細(xì)胞損傷最為明顯的2 μg/ml LPS處理48 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中LPS的處理濃度與時(shí)間。

圖1 CCK8檢測(cè)RLE-6TN細(xì)胞增殖活性Fig.1 Proliferation activity of RLE-6TN cells was detected by CCK8

2.2 LPS誘導(dǎo)對(duì)RLE-6TN細(xì)胞miR-142-3p表達(dá)的影響結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS誘導(dǎo)組RLE-6TN細(xì)胞中miR-142-3p表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），見圖2。

圖2 qPCR檢測(cè)RLE-6TN細(xì)胞中miR-142-3p表達(dá)水平Fig.2 Expression level of miR-142-3p in RLE-6TN cells was detected by qPCR

2.3 BMSCs共培養(yǎng)抑制RLE-6TN細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS組RLE-6TN細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05）。與LPS組比較，BMSCs培養(yǎng)液組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而BMSCs共培養(yǎng)組的RLE-6TN細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05），且隨著共培養(yǎng)BMSCs比例的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸降低（P<0.05）。見圖3。

圖3 流式檢測(cè)RLE-6TN細(xì)胞凋亡Fig.3 Apoptosis of RLE-6TN cells was detected by flow cytometry

2.4 BMSCs共培養(yǎng)抑制RLE-6TN細(xì)胞miR-142-3p、IL-6及TNF-α mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS組RLE-6TN細(xì)胞miR-142-3p、IL-6及TNF-α mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。與LPS組比較，BMSCs培養(yǎng)液組細(xì)胞miR-142-3p、IL-6及TNF-α mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而BMSCs共 培 養(yǎng)組 的RLE-6TN細(xì)胞miR-142-3p、IL-6及TNF-α mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），且隨著共培養(yǎng)BMSCs比例的增加，表達(dá)水平逐漸降低（P<0.05）。見圖4。

圖4 qPCR檢 測(cè)RLE-6TN細(xì) 胞 中miR-142-3p、IL-6及TNF-α mRNA表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of miR-142-3p，IL-6 and TNF-α mRNA were detected by qPCR

2.5 BMSCs共培養(yǎng)影響RLE-6TN細(xì)胞Bcl-2和cas‐pase-3蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS組RLE-6TN細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與LPS組比較，BMSCs培養(yǎng)液組細(xì)胞Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而BMSCs共培養(yǎng)組的RLE-6TN細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），且隨著共培養(yǎng)BMSCs比例的增加，Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)變化越顯著（P<0.05）。見圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)RLE-6TN細(xì)胞Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)水平Fig.5 Protein expression levels of Bcl-2 and caspase-3 were detected by Western blot

3 討論

ALI/ARDS屬于高度難治性疾病，其在肺上皮細(xì)胞中的復(fù)雜病理機(jī)制尚不完全明確。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和炎癥因子的過度釋放是肺泡毛細(xì)血管膜損傷的關(guān)鍵，而肺泡毛細(xì)血管膜損傷則是內(nèi)毒素性肺損傷的典型特征［7］。LPS可直接或間接引起ALI/ARDS，常用于體內(nèi)外復(fù)制ALI/ARDS模型［8］。肺內(nèi)炎癥細(xì)胞失控性地釋放炎癥因子，是引發(fā)ALI的根本原因［9］。ALI/ARDS患者血清中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著高于健康人群，采用LPS誘導(dǎo)小鼠和A549細(xì)胞，也可檢測(cè)到高表達(dá)的促炎細(xì)胞因子［10］。miRNA參與了多種細(xì)胞生理病理過程的調(diào)節(jié)，包括內(nèi)皮細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞HPMECs，可介導(dǎo)miR-92a表達(dá)上調(diào)，而抑制miR-92a可改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，減少促炎因子IL-6和TNF-α的釋放［11］。miR-142因其在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面的典型作用而受到廣泛關(guān)注［12］，本研究采用LPS誘導(dǎo)大鼠肺上皮細(xì)胞RLE-6TN，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中miR-142-3p表達(dá)上調(diào)，提示miR-142-3p異常表達(dá)可能與ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展存在一定聯(lián)系。

目前，對(duì)于ALI/ARDS尚無有效的特異性治療方法，而MSC在ALI/ARDS患者中具有良好的治療潛力，基礎(chǔ)研究結(jié)果也顯示BMSCs對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI可發(fā)揮較好的保護(hù)作用［13］。各類MSC治療ALI/ARDS的效果以及作用機(jī)制不盡相同，其作用機(jī)制大致可分為兩大類：一是直接通過遷移歸巢和定向分化在損傷部位發(fā)揮作用；二是通過旁分泌方式調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥因子水平，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［14］。LPS誘導(dǎo)ALI大鼠，導(dǎo)致部分miRNA（包括miR-142-3p）表達(dá)異常，在BMSCs治療后，miRNA表達(dá)得到恢復(fù)，而失調(diào)的miRNA參與了BMSCs介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)過程［6］。miR-142-3p為MSCs通過旁分泌信號(hào)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵性miRNA之一［15］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)BMSCs共培養(yǎng)處理的RLE-6TN細(xì)胞中，LPS誘導(dǎo)致使表達(dá)上調(diào)的miR-142-3p、促炎因子IL-6和TNF-α均表達(dá)減少，提示BMSCs可能通過抑制miR-142-3p表達(dá)緩解RLE-6TN細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

肺上皮細(xì)胞凋亡可加速ALI/ARDS進(jìn)展，是ALI/ARDS患者死亡的主要原因之一，LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡［16］。對(duì)肺上皮細(xì)胞凋亡途徑進(jìn)行調(diào)控，減少細(xì)胞凋亡，是ALI/ARDS治療的主要方向之一［17］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p對(duì)腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡均具有調(diào)控作用［18-19］。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)RLE-6TN細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，而凋亡執(zhí)行因子caspase-3表達(dá)升高，經(jīng)過BMSCs共培養(yǎng)的RLE-6TN細(xì)胞，凋亡率下降，Bcl-2表達(dá)升高，caspase-3表達(dá)降低，且共培養(yǎng)的BMSCs比例越高，效果越明顯。

綜上所述，LPS誘導(dǎo)大鼠肺上皮細(xì)胞RLE-6TN，可介導(dǎo)miR-142-3p、細(xì)胞促炎因子表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡增加，而RLE-6TN細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)后，緩解炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制miR-142-3p的表達(dá)有關(guān)。