章平衡 李春燕 劉永源 王明 劉錦鴻 梁東輝（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣州510282）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）易損斑塊是急性心血管疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡和炎癥在AS易損斑塊進展過程中起關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞是AS易損斑塊形成的重要推動者［1-2］。AS斑塊中包含大量泡沫化的巨噬細(xì)胞，在疾病發(fā)展過程中，膽固醇被巨噬細(xì)胞吞噬并在細(xì)胞中沉積，形成泡沫化細(xì)胞，同時促進巨噬細(xì)胞分泌大量炎癥細(xì)胞因子，如IL-2、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，加重局部炎癥反應(yīng)，進而促進巨噬細(xì)胞焦亡，從而釋放大量炎癥細(xì)胞因子，如IL-1、IL-18等，加重AS易損斑塊炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致斑塊進一步損傷和破裂，促進急性心血管疾病發(fā)生發(fā)展［3-5］。

目前，臨床治療AS及穩(wěn)定斑塊的藥物主要為他汀類藥物，雖然可有效降低血脂水平，抑制脂蛋白和膽固醇合成和分泌，穩(wěn)定易損斑塊，但作用靶點單一，具有多種副作用，如肝功能受損、肌肉酸痛、皮疹等，臨床應(yīng)用受限，無法滿足所有患者需求［4］。近年藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，中藥葛根的有效成分葛根素具有抗炎、調(diào)脂降壓、保護心肌細(xì)胞、抗血小板聚集、調(diào)節(jié)免疫、增強心肌收縮力、擴張冠狀動脈等功效［5-6］。新近研究表明，葛根素具有抗AS、降低AS炎癥因子作用，但具體機制尚未闡明［7］。因此，本研究通過觀察葛根素對體外ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化的影響，以NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡信號通路為靶點，探討葛根素穩(wěn)定AS易損斑塊、抗AS和預(yù)防急性心血管疾病的潛在分子機制，為臨床穩(wěn)定AS易損斑塊和防治急性心血管疾病提供新思路和治療藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑THP-1細(xì)胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；葛根素（C21H20O9，分子量416.38）購自北京索萊寶生物科技有限公司（0.1 g）；RP‐MI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司；佛波酯（PMA）、氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自北京全式金公司；NLRP3（貨號：SH-bs-10021R）、Caspase-1（貨號：22915-1-AP）、cleaved-Caspase-1（貨號：4199S）抗體購自美國Abcam公司；GAPDH購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；DAB顯色液購自廣州賽國生物公司；聚合HRP標(biāo)記IgG（抗鼠貨號：RM3001，抗兔貨號：RM3002）二抗購自武漢博士德公司；RIPA裂解液購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；細(xì)胞總RNA抽提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.1.2 主要儀器熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；制冰機購自意大利Scotsman公司；恒溫浴箱購自上海躍進醫(yī)療器械一廠；超純水機購自美國Mil Upore公司；高皮滅菌鍋購自英國Astell公司；離心機、移液槍、微量移液器購自德國Eppendorf公司；實時熒光定量PCR儀、-80℃冰箱購自德國Thermo公司；-20℃冰箱、4℃冰箱購自德國Siemens公司；細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司；核酸微量分光光度計購自美國NanoVue公司；電泳儀購自美國Bio-Rad公司；超凈工作臺購自蘇州安泰。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組采用RPMI1640培養(yǎng)液（含5%胎牛血清、50 U/ml青霉素、50 μg/ml鏈霉素）培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞以1×106個/孔接種于6孔板，加入PMA，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，進行后續(xù)實驗。實驗分為5組：對照組（僅加入RPMI1640培養(yǎng)液）、ox-LDL組（加入RP‐MI1640培養(yǎng)液和100 μg/ml ox-LDL）、葛根素低、中、高劑量組［加入RPMI1640培養(yǎng)液和100 μg/ml ox-LDL的同時分別加入100、250、500 μg/ml葛根素（CCK-8實驗確定）］，培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率將處理好的巨噬細(xì)胞以1×105個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，分別加入100 μg/ml ox-LDL及葛根素（50、100、250、500、1 000 μg/ml），各組設(shè)3個復(fù)孔。對照組僅加入100 μg/ml ox-LDL，培養(yǎng)48 h，分別加入CCK-8試劑（10 μl/孔），避光混勻，放置4 h，采用酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處OD值，確定葛根素有效的高、中、低劑量進行后續(xù)實驗。

1.2.3 油紅O染色將巨噬細(xì)胞以1×105個/孔接種于24孔板，分別采用100 μg/ml ox-LDL和高、中、低劑量葛根素進行處理，培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10 min，蒸餾水洗滌2次，60%異丙醇浸泡5 min，加入新配制的油紅O染液浸染30 min，棄染色液，蒸餾水洗滌3次。加入蘇木染液復(fù)染細(xì)胞核1~2 min，棄染色液，清洗3次，油鏡下觀察脂質(zhì)情況，300 μl異丙醇（1 000 ml/L）脫色10 min，520 nm處測定吸光度（A）值進行脂質(zhì)定量。

1.2.4 RT-qPCR檢測巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α mRNA水平收集處理后的各組巨噬細(xì)胞，按說明書提取巨噬細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時熒光定量PCR進 行 目 的 基 因 擴 增。PCR擴 增 體 系：2×TB Green 10.0 μl，引物各0.4 μl（引物序列見表1），50×ROX ReferenceDyeⅡ0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 7.2 μl，總體系20 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃退火5 s，60℃延伸34 s，共40個循環(huán)，95℃延伸15 s。以actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt計算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 免疫熒光檢測炎癥小體NLRP3水平將巨噬細(xì)胞以1×105個/孔接種于24孔板，給予相應(yīng)藥物處理，取各組細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛（500 μl/孔）固定30 min，PBS清洗3次，5 min/次，0.5% Triton X-100（500 μl/孔）透膜30 min，5%BSA封閉30 min，加入NLRP3稀釋液（1∶200，250 μl/孔）4℃過夜，PBS清洗3次，5 min/次，加入cy3標(biāo)記的二抗（1∶500，250 μl/孔）室溫避光孵育2 h，PBS清洗3次，5 min/次，加入250 μl含10 μg/ml DAPI的PBS染核30 min，PBS清洗3次，5 min/次，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 Western blot檢測細(xì)胞焦亡蛋白NLRP3、Caspase-1、cleaved-Caspase-1水平收集各組巨噬細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解30 min，4℃離心，取上清。BCA法測定蛋白濃度，取10 μg總蛋白，進行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶于0.5%TBST配制封閉液，室溫作用2 h，加入NLRP3一抗（1∶1 000）、Caspase-1一抗（1∶1 000）、cleaved-Caspase-1一抗（1∶1 000）和GAPDH一抗（1∶2 000）4℃孵育過夜，TBST漂洗濾膜3次，5 min/次，加入山羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，5 min/次，ECL法顯影曝光，AlphaEase FC軟件分析顯影帶，目的蛋白表達=OD目的蛋白/ODGAPDH。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）及LSD檢測，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PMA誘導(dǎo)分化的THP-1巨噬細(xì)胞光學(xué)顯微鏡下可觀察到未經(jīng)過PMA誘導(dǎo)分化THP-1單核細(xì)胞呈透亮圓形和類圓形狀態(tài)，加入PMA誘導(dǎo)分化24 h后則分化為巨噬細(xì)胞，多呈不規(guī)則、梭形或有偽足狀態(tài)（圖1）。

圖1 THP-1單核/巨噬細(xì)胞形態(tài)（×100）Fig.1 Morphology of THP-1 monocytes/macrophages（×100）

2.2 不同濃度葛根素對巨噬細(xì)胞存活率的影響不同濃度葛根素（50、100、250、500、1 000 μg/ml）對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞均有不同程度保護作用。48 h時，葛根素濃度為100、250、500 μg/ml時巨噬細(xì)胞存活率最高（P<0.01），且保護效果呈劑量依賴性（圖2）。因此，后續(xù)實驗確定100、250、500 μg/ml為葛根素低、中、高干預(yù)劑量。

圖2 葛根素對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of puerarin on survival rate of macrophages induced by ox-LDL

2.3 葛根素對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的影響采用高、中、低劑量葛根素對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞進行干預(yù)，油紅O染色結(jié)果顯示，未經(jīng)ox-LDL處理的巨噬細(xì)胞內(nèi)幾乎無脂質(zhì)沉積或僅有微量脂質(zhì)（圖3紅色部分），經(jīng)ox-LDL處理的巨噬細(xì)胞內(nèi)可見大量脂質(zhì)沉積，簇集成環(huán)狀，幾乎充滿整個胞漿，細(xì)胞體積明顯增大，呈泡沫樣改變，葛根素處理ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)明顯減少，且呈劑量依賴性，細(xì)胞體積相對縮?。▓D3）。

圖3 葛根素對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的影響（×400）Fig.3 Effect of puerarin on lipid accumulation in macro?phages induced by ox-LDL（×400）

2.4 葛根素對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子的影響RT-qPCR檢測葛根素對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α水平明顯升高（P<0.01），與ox-LDL組相比，葛根素處理后巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α水平明顯降低（P<0.01），且呈劑量依賴性（圖4）。

圖4 葛根素對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子的影響Fig.4 Effect of puerarin on inflammatory cytokines of macrophages induced by ox-LDL

2.5 葛根素對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡蛋白的影響免疫熒光檢測葛根素對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥小體NLRP3表達，Western blot檢測焦亡蛋白NLRP3、Caspase-1、cleaved-Caspase-1水平，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中焦亡蛋白NLRP3、cleaved-Caspase-1水平明顯升高（P<0.05），與ox-LDL組相比，葛根素處理后巨噬細(xì)胞中焦亡蛋白NLRP3、cleaved-Caspase-1水平明顯降低（P<0.05，P<0.01），且呈劑量依賴性（圖5、6）。

圖5 葛根素對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的影響Fig.5 Effect of puerarin on pyroptosis related proteins in macrophages induced by ox-LDL

圖6 巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3熒光強度（×200）Fig.6 Fluorescence intensity of NLRP3 in macrophages（×200）

3 討論

AS是心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，而AS易損斑塊則是急性心血管疾病發(fā)生的重要因素，亦是導(dǎo)致患者高死亡率的原因之一。巨噬細(xì)胞則是AS易損斑塊形成和發(fā)展的重要參與者［8］。炎癥刺激作用下，趨化血液中的單核細(xì)胞聚集并浸潤至血管內(nèi)膜下，在其所處的炎癥微環(huán)境作用下進一步分化為巨噬細(xì)胞［9-10］。高脂環(huán)境中，巨噬細(xì)胞吞噬其微環(huán)境中的ox-LDL和膽固醇結(jié)晶，加上機體自身清除能力有限，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量沉積，進而發(fā)生泡沫化，細(xì)胞體積增大，在血管局部形成脂質(zhì)池，促進AS斑塊形成［11-12］。本研究在體外采用PMA誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞建立細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在ox-LDL作用下細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量明顯增加，細(xì)胞體積明顯增大，大量細(xì)胞發(fā)生泡沫化改變，而采用葛根素干預(yù)后，巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)含量明顯下降，細(xì)胞體積縮小，泡沫化細(xì)胞數(shù)明顯減少，且呈劑量依賴性改變。體外細(xì)胞實驗研究表明，葛根素可抑制巨噬細(xì)胞活化，清除巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)，減少巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌［13-14］。

AS易損斑塊形成除受巨噬細(xì)胞泡沫化改變的影響外，還與其局部活躍的炎癥密切相關(guān)。但巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量聚集情況下，這些不能被及時清除的脂質(zhì)又可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞焦亡信號通路活化，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞焦亡，進而釋放大量炎癥細(xì)胞因子，在局部促進易損斑塊形成。研究證明，ox-LDL可上調(diào)巨噬細(xì)胞中Caspase-1和炎癥小體NLRP3水平，并通過激活Caspase-1信號通路促進巨噬細(xì)胞中IL-1β、TNFα和IL-2等炎癥細(xì)胞因子分泌［15-16］。巨噬細(xì)胞中還含有與細(xì)胞焦亡相關(guān)的NLRP3受體和NLRP3炎癥小體。一項研究通過沉默NLRP3受體，發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體表達明顯降低，并進一步通過小干擾RNA干擾NLRP3基因表達，發(fā)現(xiàn)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IL-1β分泌明顯減少［17］；另有研究表明，膽固醇晶體可促進人巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體活化，加速AS發(fā)展［18］；以上研究均證明巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集可通過激活NLRP3信號通路，促進炎癥因子分泌，導(dǎo)致AS發(fā)生發(fā)展。因此，ox-LDL和膽固醇晶體激活的NLRP3炎癥小體可能是促進AS炎癥形成的關(guān)鍵因素。另有多項研究表明，巨噬細(xì)胞焦亡與AS斑塊不穩(wěn)定密切相關(guān)［19-20］。三酰甘油體外處理巨噬細(xì)胞后，可檢測到cleaved-Caspase-1水平明顯上升，且出現(xiàn)細(xì)胞焦亡［21］。ox-LDL作用下，人巨噬細(xì)胞中NLRP3依賴的Caspase-1通路發(fā)生活化，進而促進巨噬細(xì)胞裂解、炎癥因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α大量分泌［20］。本研究通過ox-LDL體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞內(nèi)焦亡蛋白NLRP3和cleaved-Caspase-1水平明顯升高，且巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α mRNA水平明顯升高。葛根素干預(yù)后，ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中焦亡蛋白NLRP3和cleaved-Caspase-1水平明顯降低，且巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α mRNA水平明顯降低，且呈濃度依賴性，提示葛根素分別從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平阻止巨噬細(xì)胞焦亡發(fā)生。

綜上，葛根素作為中藥葛根的有效成分，可有效抑制oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NLRP3/Caspase-1信號通路活化，抑制IL-2、IL-6、TNF-α、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子表達，從而抑制巨噬細(xì)胞焦亡，發(fā)揮抗炎和抗AS作用。細(xì)胞焦亡及其釋放的大量炎癥細(xì)胞因子在AS易損斑塊形成、脫落及破裂等進程中起關(guān)鍵作用，葛根素可靶向抑制NLRP3/Caspase-1細(xì)胞焦亡通路活化，減少炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，起效更快，為心腦血管疾病臨床治療提供了潛在靶點，為其臨床治療提供了新方法和依據(jù)。但葛根素對心血管的保護作用及分子機制仍需進一步研究。