【摘 要】目的：建立有應(yīng)用價(jià)值的腰椎動(dòng)靜力不穩(wěn)的山羊模型，模擬人體局部因素的影響和病理生理的應(yīng)力負(fù)荷對(duì)椎間盤(pán)退變（intervertebral disc degeneration，IVDD）的作用。方法：通過(guò)腰椎動(dòng)靜力不穩(wěn)手術(shù)（lumbar dynamic and static instability，LDSI）破壞山羊脊柱的后柱結(jié)構(gòu)，包括離斷豎脊肌、背闊肌、腰最長(zhǎng)肌、棘肌等破壞腰椎動(dòng)態(tài)力學(xué)穩(wěn)定，離斷腰椎棘突、棘上韌帶、棘間韌帶等破壞腰椎靜態(tài)力學(xué)穩(wěn)定，使腰椎產(chǎn)生動(dòng)態(tài)力和靜態(tài)力的失衡，造成脊柱后柱穩(wěn)定性的喪失。以生物力學(xué)穩(wěn)定性為突破點(diǎn)，而不破壞椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)的完整性，建立腰椎動(dòng)靜力不穩(wěn)的山羊模型，并通過(guò)52周的術(shù)后隨訪，利用腰椎X線片、磁共振以及組織病理學(xué)變化等技術(shù)手術(shù)評(píng)估山羊的椎間盤(pán)高度指數(shù) （disc height index，DHI），Pfirrmann MRI分級(jí)和Masuda組織學(xué)評(píng)分等。結(jié)果：LDSI組山羊腰椎的DHI在術(shù)前0周（0.184±0.015），術(shù)后26周（0.105±0.006）和術(shù)后52周（0.075±0.007）存在差異（0周 vs. 26周，Plt;0.05；26周 vs. 52周，Plt;0.05）。LDSI組山羊腰椎的Pfirrmann分級(jí)在術(shù)前0周（1.167±0.408），術(shù)后26周（2.333±0.516）和術(shù)后52 周（3.667±0.817）存在差異（0 周 vs. 26 周，Plt;0.05；26 周 vs. 52 周，Plt;0.05）。LDSI 組山羊腰椎的Masuda 組織學(xué)評(píng)分在術(shù)前0 周（3.500±0.577），術(shù)后26 周（6.250±0.957）和術(shù)后52 周（8.000±0.816）存在差異（0 周 vs. 26周，Plt;0.05；26周 vs. 52周，Plt;0.05）。結(jié)論：LDSI能夠造成山羊椎間盤(pán)高度降低、終板邊界模糊和含水量降低，在不破壞椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)完整的基礎(chǔ)上模擬了人體長(zhǎng)期反復(fù)勞損而導(dǎo)致的IVDD，更符合人體實(shí)際，有助于其發(fā)病機(jī)制的研究。

【關(guān)鍵詞】椎間盤(pán)退變；山羊模型；腰椎動(dòng)靜力不穩(wěn)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R681.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-02-18

椎間盤(pán)退變（intervertebral disc degeneration，IVDD）是指在一系列復(fù)雜的分子機(jī)制和機(jī)械應(yīng)力作用下的IVD衰老和損傷，可導(dǎo)致腰痛、神經(jīng)受壓甚至殘疾[1-2]。隨著全球人口老齡化加重，IVDD患者急劇增多，嚴(yán)重者通常需要手術(shù)治療，并且手術(shù)治療可能會(huì)加劇鄰近健康椎間盤(pán)的退變，已在世界范圍內(nèi)造成了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3-5]。然而，少見(jiàn)合適的動(dòng)物模型和造模方式能較真實(shí)地模擬人體局部因素的影響和病理生理的應(yīng)力負(fù)荷對(duì)IVDD的作用[6-7]。因此，有必要探索能模擬人類(lèi)長(zhǎng)期反復(fù)勞損而自然誘發(fā)IVDD的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型用于其機(jī)制與治療的研究。

山羊來(lái)源充足，壽命較長(zhǎng)而可供長(zhǎng)期研究，性格溫順而容易圈養(yǎng)，擁有與人類(lèi)脊柱相似的尺寸與構(gòu)造，能獲取大量血、尿以及骨標(biāo)本[8-9]。成年山羊的脊索細(xì)胞基本消失，其髓核的蛋白多糖含量和整個(gè)IVD 的力學(xué)結(jié)構(gòu)與人類(lèi)相似[10]。山羊IVD 的厚度、高度、前后徑、纖維環(huán)的水分含量、膠原含量和膠原纖維的取向角度等與人體IVD 結(jié)構(gòu)均相似[11-12]，可以較真實(shí)反映人體IVDD的客觀規(guī)律，較全面模擬人體IVDD的病理過(guò)程，是一種貼近臨床、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的用于IVDD研究的理想動(dòng)物模型。

當(dāng)前，在大型和小型動(dòng)物模型中都采用了多種誘導(dǎo)IVDD的方法，包括化學(xué)溶核（以酶促誘導(dǎo)髓核降解）、髓核抽吸、纖維環(huán)損傷（撕裂或針刺）或改變機(jī)械負(fù)荷[13-17]。但目前尚無(wú)具有可操作性強(qiáng)、可靠性好、可重復(fù)性強(qiáng)的山羊造模方式在保持IVD不受過(guò)多的外力干擾的同時(shí)，可以成功誘導(dǎo)IVDD。因此，本課題擬以椎間盤(pán)及脊柱相關(guān)結(jié)構(gòu)的生物力學(xué)穩(wěn)定性為突破點(diǎn)，干擾腰椎動(dòng)態(tài)力與靜態(tài)力的平衡，以此建立腰椎動(dòng)靜力不穩(wěn)的山羊IVDD模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

山羊購(gòu)自上海甲干生物科技有限公司，共12只山羊用于本研究（雌性，36月齡）。所有山羊術(shù)前均健康，并通過(guò)了防疫檢查。所有山羊術(shù)前均接受了脊柱X線和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）掃描，以確保不存在IVDD相關(guān)疾病。山羊飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下（22 ℃恒溫，12 h光/暗循環(huán)的通風(fēng)環(huán)境），被允許自由飲水和進(jìn)食。

1.2 手術(shù)及分組

隨機(jī)選取6只山羊作為手術(shù)處理組，進(jìn)行腰椎動(dòng)靜力不穩(wěn)手術(shù)（lumbar dynamic and static instability，LDSI），其余6只為對(duì)照組，進(jìn)行SHAM。術(shù)前禁食禁水24 h。山羊術(shù)前麻醉用藥采用肌肉注射舒泰?50（鹽酸替來(lái)他明鹽酸唑拉西泮復(fù)合劑，10 mg/kg），維持術(shù)中麻醉采用3 mg/kg舒泰?50聯(lián)合吸入式全身麻醉氣體（異氟烷，3%，1 L/min）。所有山羊接受?chē)g(shù)期靜脈注射抗生素（頭孢唑肟鈉，2 mg/kg）。對(duì)于SHAM組山羊，麻醉后置于手術(shù)臺(tái)上，俯臥位，備皮、描繪手術(shù)標(biāo)志并常規(guī)用碘伏消毒手術(shù)區(qū)域。根據(jù)棘突觸診，使用腰后正中線入路，起自L1棘突縱行向尾端制作15 cm的縱向切口。使用電刀燒灼止血，逐層解剖皮下層、腰背筋膜直至棘上韌帶。對(duì)于LDSI組山羊，在上述操作后，繼續(xù)鈍性分離肌筋膜，使用牽開(kāi)器將豎脊肌向外側(cè)牽開(kāi)，暴露腰椎后柱視野后，離斷豎脊肌、背闊肌、腰最長(zhǎng)肌、棘肌、棘上韌帶和棘間韌帶，利用咬骨鉗剪除腰椎棘突。2組山羊完成相應(yīng)手術(shù)后，嚴(yán)密止血，將肌肉、筋膜、皮膚分別逐層縫合。術(shù)中始終保持嚴(yán)格的無(wú)菌操作。定期更換敷料，直至切口部位完全愈合。獸醫(yī)人員每天至少觀察1次動(dòng)物的總體健康狀況和外觀，并仔細(xì)監(jiān)測(cè)疼痛、不適、步態(tài)或姿勢(shì)的跡象。手術(shù)后對(duì)山羊進(jìn)行52周的隨訪。

1.3 X線片分析

術(shù)前0周、術(shù)后26周及術(shù)后52周在全身麻醉下對(duì)山羊進(jìn)行腰椎X線檢查（上海吉米，S320）。IVD高度的變化通過(guò)椎間盤(pán)高度指數(shù)（disc height index，DHI）進(jìn)行評(píng)估[18-19]。在中線上及距中線兩側(cè)椎間盤(pán)寬度的25%處測(cè)量椎間盤(pán)高度和相鄰椎體高度。DHI 表示為從中線到椎間盤(pán)中央50%寬度邊界的3個(gè)測(cè)量值的平均值除以2個(gè)相鄰椎體高度的平均值。DHI的計(jì)算公式[20]為：DHI=2（DH1+DH2+DH3）/（[ PV1+PV2+PV3）+（DV1+DV2+DV3）]。

1.4 MRI分析

術(shù)前、術(shù)后26周及術(shù)后52周在全身麻醉下對(duì)山羊進(jìn)行腰椎MRI檢查（上海聯(lián)影，UMR580）。使用以下設(shè)置獲得正中矢狀面中的T2加權(quán)切片：快速自旋回波序列，重復(fù)時(shí)間為3 200 ms，回波時(shí)間為100 ms，切片厚度為1 ms，間隙為0.3 mm。根據(jù)Pfirrmann MRI分級(jí)系統(tǒng)[21]評(píng)估IVD變性分級(jí)，MRI圖像分為I級(jí)至V級(jí)。

1.5 組織學(xué)分析

兩組分別各自隨機(jī)選擇3只山羊的L3/4、L4/5、L5/6椎間盤(pán)，分別做未脫鈣骨硬組織切片和脫鈣骨組織切片。未脫鈣骨硬組織切片與染色：在4%多聚甲醛中固定120 h后，梯度酒精依次脫水，隨后浸塑、包埋，切成10 μm的切片。每個(gè)切片均用蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）和Masson染液進(jìn)行染色。脫鈣骨組織切片：在4%多聚甲醛中固定120 h后，用10% EDTA脫鈣6個(gè)月，隨后包埋在石蠟中，切成5 μm的切片。每個(gè)切片均用Hamp;E 和Masson 染液進(jìn)行染色，對(duì)IVD 整體結(jié)構(gòu)、髓核、纖維環(huán)以及軟骨終板進(jìn)行綜合分析。使用光學(xué)顯微鏡（Nikon，Japan）觀察圖像，運(yùn)用KoichiMasuda等[15]建立的Masuda組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)和先前發(fā)表的組織學(xué)分級(jí)系統(tǒng)[22-23]分別評(píng)估椎間盤(pán)退變程度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 建立山羊LDSI動(dòng)物模型

術(shù)前，先對(duì)山羊拍攝腰椎側(cè)位X線片（圖1A），以確保不存在IVDD相關(guān)疾病。山羊麻醉后置于手術(shù)臺(tái)上，備皮后根據(jù)山羊肋骨、髂骨和棘突等骨性標(biāo)志描繪手術(shù)標(biāo)志（圖1B）。嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則下，采取腰后正中線入路，起自L1棘突縱行向尾端制作15 cm的縱向切口（圖1C）。使用電刀燒灼止血，逐層解剖皮下層、腰背筋膜直至棘上韌帶，鈍性分離肌筋膜，使用牽開(kāi)器將豎脊肌向外側(cè)牽開(kāi)，暴露腰椎后柱視野（圖1D）。隨后，離斷豎脊肌、背闊肌、腰最長(zhǎng)肌、棘肌、棘上韌帶和棘間韌帶，并利用咬骨鉗剪除腰椎棘突（圖1E）。手術(shù)后2周，再對(duì)山羊拍攝腰椎側(cè)位X 片以確認(rèn)手術(shù)成功（圖1F）。

2.2 LDSI誘發(fā)山羊腰椎間盤(pán)間隙狹窄

為了比較SHAM 組和LDSI組山羊術(shù)前和術(shù)后26周和52 周的椎間盤(pán)退變程度，本研究測(cè)量了各組山羊的L3/4腰椎間盤(pán)的DHI。X線片結(jié)果顯示（圖2A、B），SHAM組山羊腰椎的術(shù)前0 周，術(shù)后26 周和術(shù)后52 周的DHI（0.189±0.014，0.185±0.009，0.178±0.007）并不存在差異（圖2E，F(xiàn)=1.922，Pgt;0.05）。隨著年齡的增長(zhǎng)，椎間盤(pán)只是發(fā)生了緩慢的退變。然而，LDSI組山羊的X線片結(jié)果顯示（圖2C、D），其腰椎的術(shù)前0 周（0.184±0.015），術(shù)后26 周（0.105±0.006）和術(shù)后52周（0.075±0.007）的DHI 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2F，0 周vs. 26 周，F(xiàn)=84.830，Plt;0.001；26 周 vs. 52 周，F(xiàn)=84.830，P=0.032）。在LDSI組山羊中，術(shù)后26周的DHI高于術(shù)前0周，而52周的DHI也高于26周。這些結(jié)果表明，腰椎動(dòng)靜力不穩(wěn)會(huì)加速椎間盤(pán)高度降低和軟骨終板邊界模糊。

2.3 LDSI誘發(fā)山羊腰椎間盤(pán)MRI信號(hào)變化

為了更清晰地展現(xiàn)椎間盤(pán)的變化，本研究進(jìn)一步測(cè)量了SHAM組和LDSI組山羊術(shù)前0周和術(shù)后26周和52周的椎間盤(pán)MRI T2 加權(quán)信號(hào)強(qiáng)度的變化。根據(jù)MRI 結(jié)果顯示（圖3A、B），SHAM組山羊腰椎的術(shù)前0周，術(shù)后26周和術(shù)后52周的Pfirrmann 分級(jí)（1.167±0.408，1.501±0.548，1.833±0.753）并不存在差異（圖3E，F(xiàn)=1.935，Pgt;0.05）。3個(gè)時(shí)間段的椎間盤(pán)信號(hào)均勻，呈明亮的白色高強(qiáng)度信號(hào)，隨著年齡增長(zhǎng)，椎間盤(pán)只有緩慢的信號(hào)變化。然而，LDSI組山羊的MRI 結(jié)果顯示（圖3C、D），其腰椎的術(shù)前0 周（1.167±0.408），術(shù)后26 周（2.333±0.516）和術(shù)后52 周（3.667±0.817）的Pfirrmann分級(jí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3F，0周 vs.26 周，F(xiàn)=25.610，P=0.012；26 周 vs. 52 周，F(xiàn)=25.610，P=0.005）。尤其是術(shù)后52周的LDSI組山羊椎間盤(pán)信號(hào)完全變暗，椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)塌陷（圖3D）。這些結(jié)果表明，腰椎動(dòng)靜力不穩(wěn)會(huì)加速椎間盤(pán)含水量降低和椎間盤(pán)老化，誘發(fā)IVDD。

2.4 LDSI誘發(fā)山羊腰椎間盤(pán)組織病理學(xué)變化

為了進(jìn)一步觀察山羊IVD在微觀組織學(xué)上的病理學(xué)變化，本研究在LDSI術(shù)前0周、術(shù)后26、52周分別對(duì)LDSI組的山羊IVD進(jìn)行了切片分析。如圖4A、B所示，IVD的變化在Hamp;E染色與Masson染色上呈現(xiàn)出一致的結(jié)果。簡(jiǎn)而言之，在LDSI術(shù)后26周，山羊的髓核組織逐漸被混亂的纖維組織所取代，而纖維環(huán)逐漸出現(xiàn)破碎和扭曲，部分軟骨終板消失。隨著時(shí)間的推移，在LDSI術(shù)后52周，山羊的髓核組織體積減小并出現(xiàn)了明顯的結(jié)構(gòu)性空洞，纖維組織非?；靵y，髓核和纖維環(huán)之間的邊界出現(xiàn)了中斷，軟骨終板出現(xiàn)明顯的鈣化。此外，山羊IVD 的Masuda 評(píng)分結(jié)果（圖4C、D）表明，LDSI組山羊腰椎的Masuda組織學(xué)評(píng)分在術(shù)前0周（3.500±0.577），術(shù)后26 周（6.250±0.957）和術(shù)后52 周（8.000±0.816）存在差異（圖3F；0周 vs. 26周，F(xiàn)=32.220，P=0.002；26周 vs. 52周，F(xiàn)=32.220，P=0.031）。山羊IVD的組織學(xué)分級(jí)結(jié)果也符合這一變化。這些結(jié)果表明，腰椎動(dòng)靜力不穩(wěn)會(huì)誘發(fā)IVD椎間盤(pán)髓核基質(zhì)的纖維化、椎間盤(pán)纖維環(huán)組織的崩解以及軟骨終板邊界的破壞，最終導(dǎo)致IVDD。

3 討論

IVDD會(huì)引起多種體征和癥狀，例如腰痛、椎間盤(pán)突出和椎管狹窄，造成高昂的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)成本。目前，IVDD可根據(jù)患者癥狀采取非手術(shù)治療和手術(shù)治療。但這些都只能緩解疼痛，并不能逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展和重建脊柱生物力學(xué)功能[5]。建立合適的臨床前動(dòng)物研究模型是將新興療法從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化為臨床人體應(yīng)用的重要步驟。近年來(lái)，許多學(xué)者通過(guò)不同種類(lèi)動(dòng)物與造模方法建立IVDD動(dòng)物模型，用于退變機(jī)制和治療方法的探索與研究[24]。然而，這些動(dòng)物模型設(shè)計(jì)在動(dòng)物種類(lèi)、相似性、可靠性、可重復(fù)性、可控性與造模周期等方面均有不足之處，未有能較真實(shí)模擬人類(lèi)椎間盤(pán)退變過(guò)程的理想模型。例如，鼠、兔等小型動(dòng)物椎間盤(pán)體積較小，模型制作過(guò)程損傷較大，解剖結(jié)構(gòu)、生理學(xué)特點(diǎn)及脊柱負(fù)荷情況與人類(lèi)差異明顯，相似性較低[25-26]；恒河猴、獼猴等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的倫理復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)成本極高，很難廣泛應(yīng)用[27-28]；沙鼠與狒狒等自發(fā)出現(xiàn)椎間盤(pán)退變傾向的特殊動(dòng)物種屬特異性強(qiáng)，退變率不穩(wěn)定[29-30]。然而，山羊IVD的解剖結(jié)構(gòu)、大小、生物力學(xué)特性和生化成分與人類(lèi)IVD相對(duì)接近[31]，這使得山羊成為更好的模型來(lái)模擬人類(lèi)IVDD的病理生理學(xué)。

脊柱生理功能的維持主要依靠椎體、椎間盤(pán)、小關(guān)節(jié)、韌帶及肌肉等結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，脊柱穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)其正常生理功能的先決條件。目前在大型和小型動(dòng)物模型中采用了多種誘導(dǎo)IVDD的造模方法，但都各有優(yōu)缺。例如，結(jié)構(gòu)損傷模型通過(guò)物理方法損傷纖維環(huán)、髓核或終板，其中纖維環(huán)穿刺法的應(yīng)用較為廣泛。通過(guò)穿刺導(dǎo)致纖維環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的破壞，急性椎間盤(pán)突出，髓核壓力降低引起機(jī)械和生化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終發(fā)展為IVDD[25，32]。盡管纖維環(huán)穿刺法操作簡(jiǎn)單且重復(fù)性好，但退變的程度嚴(yán)重，進(jìn)展較快，不符合人類(lèi)椎間盤(pán)緩慢退變的規(guī)律，并且研究之間的破壞程度差異較大，難以標(biāo)準(zhǔn)化。相比而言，化學(xué)誘導(dǎo)模型通過(guò)將化學(xué)試劑注射到IVD 來(lái)誘導(dǎo)IVDD，主要包括完全弗氏佐劑、軟骨素酶ABC 和木瓜凝乳蛋白酶等[17，33]。化學(xué)試劑可以增加蛋白多糖的分解，從而引起髓核變性，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)紊亂，模擬了人類(lèi)椎間盤(pán)中蛋白多糖的丟失，并且藥物的劑量易于控制。然而注射的化學(xué)藥物影響了生化檢測(cè)與干預(yù)治療的結(jié)果，注射的過(guò)程也造成了結(jié)構(gòu)損傷。此外，機(jī)械壓縮模型通過(guò)對(duì)脊柱施加軸向載荷，可以直接損傷椎間盤(pán)的結(jié)構(gòu)[34]。然而，該方法僅模擬了單一力學(xué)因素，并且過(guò)度載荷容易導(dǎo)致椎體結(jié)構(gòu)與脊髓損傷?；蚯贸Ｐ屯ㄟ^(guò)敲除特定基因?qū)е伦甸g盤(pán)關(guān)鍵物質(zhì)合成代謝障礙，從而影響椎間盤(pán)組成[35]。但由于基因敲除僅證實(shí)了單一基因的作用，并且操作難度高及費(fèi)用較大，不適用于廣泛研究?？偠灾壳吧袩o(wú)具有可操作性高、可靠性好、可重復(fù)性強(qiáng)的大型動(dòng)物造模方式在保持IVD不受過(guò)多的外力干擾的同時(shí)，可以成功誘導(dǎo)IVDD，較好地模擬人體中的IVDD。

綜上所述，本研究中構(gòu)建的腰椎動(dòng)靜力不穩(wěn)山羊模型可以較成功地模擬人類(lèi)IVDD的過(guò)程。該模型在未暴力破壞IVD的條件下，在長(zhǎng)達(dá)1年的隨訪周期內(nèi)緩慢呈現(xiàn)出從輕度到重度的一系列退行性變化，包括椎間盤(pán)高度、骨終板變化、MRI評(píng)分和組織學(xué)分級(jí)等。隨著退變嚴(yán)重程度的增加，山羊IVD的Pfirrmann等級(jí)增加，這也與在老化和退變的人類(lèi)IVD中觀察到的MRI變化一致。在組織學(xué)上，該模型中實(shí)現(xiàn)的退變范圍涵蓋了在人類(lèi)IVDD中觀察到的結(jié)構(gòu)和成分的變化范圍，包括椎間盤(pán)高度逐漸降低、髓核基質(zhì)的纖維化以及椎間盤(pán)纖維環(huán)組織的破壞。該動(dòng)物模型構(gòu)建時(shí)保持了IVD的結(jié)構(gòu)完整性，具有良好的可操作性，與人類(lèi)IVDD相似性高、可靠性好、可重復(fù)性強(qiáng)，較真實(shí)地模擬了人類(lèi)脊柱局部生物載荷對(duì)IVDD的作用。此外，腰椎動(dòng)靜力失衡誘發(fā)IVDD的進(jìn)程相對(duì)較緩，可控性較好，為緩解或逆轉(zhuǎn)退變進(jìn)程的藥物研發(fā)提供了足夠的時(shí)間窗口，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：曾 玲）

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