【摘 要】目的：闡明Maresin-1（MaR1）對(duì)慢性社交挫?。╟hronic social defeated stress，CSDS）誘導(dǎo)青少年期（5～8周）小鼠抑郁樣行為的影響，驗(yàn)證其在CSDS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中的作用，為理解抑郁癥的分子機(jī)制和探索生物標(biāo)志物提供參考。方法：利用多種方法來(lái)檢測(cè)CSDS誘導(dǎo)10 d后C57BL/6J小鼠的抑郁樣行為和神經(jīng)炎癥。并每2 d注射1次MaR1（5 μg/kg）治療小鼠，以觀察其對(duì)CSDS誘導(dǎo)的抑郁樣行為和神經(jīng)炎癥的影響。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行PET-CT掃描并對(duì)PET圖像進(jìn)行定量分析；收集小鼠腦組織樣本進(jìn)行免疫熒光染色，采用Image J對(duì)海馬區(qū)域Iba-1細(xì)胞、 TSPO免疫熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；將小鼠海馬體在冰上分離，并立即在液氮中快速冷凍，然后儲(chǔ)存在-80 ℃下進(jìn)行隨后的RNA提取，試劑盒檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1 beta，IL-1β）和IL-4含量。結(jié)果：與對(duì)照組相比，CSDS應(yīng)激后，小鼠表現(xiàn)出低糖水偏好比（P=0.003）低社會(huì)交互比（P=0.000）、更長(zhǎng)的不動(dòng)時(shí)間（P=0.002），在海馬區(qū)域，小膠質(zhì)細(xì)胞活化，表現(xiàn)為SUV 值升高（P=0.020），Iba-1和TSPO的免疫熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P=0.000）和促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α升高（P=0.016、0.036）。而MaR1改善了上述CSDS誘導(dǎo)的抑郁樣行為，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和減少促炎因子的表達(dá)。結(jié)論：MaR1能夠緩解CSDS誘導(dǎo)的青少年期小鼠抑郁樣行為，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。神經(jīng)炎癥是青少年抑郁癥的潛在致病因素，具有抗炎特性的藥物如MaR1有潛力作為臨床相關(guān)的抗抑郁藥，需要進(jìn)一步地研究。

【關(guān)鍵詞】青少年；抑郁癥；小膠質(zhì)細(xì)胞；［18F］DPA-714PET；Maresin-1

【中圖分類號(hào)】R749.4 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-02-20

抑郁癥作為一種嚴(yán)重的、危及生命的精神疾病是青少年中最普遍的精神障礙[1]。全球約有34%的10～19歲青少年有患有抑郁癥的風(fēng)險(xiǎn)，特別是來(lái)自中東、非洲和亞洲的青少年患抑郁癥的風(fēng)險(xiǎn)最高[2]。1項(xiàng)薈萃分析顯示，在中國(guó)約有19.85%的兒童和青少年患有抑郁癥[3]。目前對(duì)于抑郁癥的診斷主要依靠臨床癥狀和量表，然而患有抑郁癥的青少年更容易出現(xiàn)易怒和不穩(wěn)定的情緒[4]，而不是經(jīng)典的抑郁核心癥狀（情緒低落），且使用不同的量表，對(duì)于抑郁的診斷也具有很大的差異[3]，因此為了更加準(zhǔn)確對(duì)青少年抑郁癥的診斷，迫切地需要找到一個(gè)客觀的生物標(biāo)志物。

另一方面，臨床上常用的選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑可能會(huì)導(dǎo)致更多的不良事件，如自殺風(fēng)險(xiǎn)增高[5]。因此尋找一些新的治療靶點(diǎn)也迫在眉睫。事實(shí)上，越來(lái)越多的研究認(rèn)為炎癥在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[6-8]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐巨噬細(xì)胞，被認(rèn)為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和疾病進(jìn)展密切相關(guān)[9-10]。小膠質(zhì)細(xì)胞能夠?qū)ι窠?jīng)炎癥做出反應(yīng)，并通過(guò)釋放炎癥誘導(dǎo)的細(xì)胞因子及其代謝產(chǎn)物從而來(lái)調(diào)節(jié)抑郁癥狀。MaR1是一種抗炎和促分解介質(zhì)，具有再生組織的潛力[11]。1項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，青少年抑郁癥患者的MaR1水平較低，抗抑郁治療后MaR1 水平升高[12]。MaR1 可能在抑郁癥狀的發(fā)展以及藥物治療中起關(guān)鍵作用。

因此，本研究旨在闡明MaR1對(duì)慢性社交挫?。╟hronic social defeated stress，CSDS）誘導(dǎo)青少年期（5～8周）小鼠抑郁樣行為的影響，驗(yàn)證其在CSDS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中的作用，更好地為青少年抑郁癥的治療提供潛在的治療靶點(diǎn)，為理解抑郁癥的分子機(jī)制和探索生物標(biāo)志物提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只雄性CD-1小鼠和60只雄性C57BL/6J小鼠（年齡為4周齡，重15～20 g），均購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。在獲得小鼠后，將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周（1只/籠）。飼養(yǎng)條件包括室內(nèi)溫度為（24±1） ℃；小鼠的晝夜節(jié)律為12 h，即8：00（開(kāi)燈）至20：00（關(guān)燈）；每周更換1次墊料；以及獲得充足的飼料和水。對(duì)這些小鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)程序得到了重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)（K2023-010）的正式批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)流程

建模前，C57BL/6J和CD-1小鼠被分開(kāi)關(guān)在籠子里適應(yīng)1周，并讓后者形成領(lǐng)地意識(shí)。CD-1小鼠僅用于CSDS中。根據(jù)攻擊潛伏期和1 min內(nèi)攻擊次數(shù)等參數(shù)對(duì)攻擊性CD-1小鼠進(jìn)行了3次篩選。

將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（CON組）、CSDS+生理鹽水組（CSDS+NS組）和CSDS+MaR1（5 μg/kg）組（CSDS+MaR1 組）。CON 組和CSDS+NS 組每2 d 腹腔注射1次2 mL生理鹽水；CSDS+MaR1組每?jī)扇兆⑸?次Maresin1藥物。CSDS+NS組和CSDS+MaR1組小鼠每天會(huì)被CD-1鼠攻擊5～10 min。之后，該組小鼠將與CD-1鼠飼養(yǎng)在同一籠盒，籠盒中間用帶有小孔的透明隔板隔開(kāi)，使C57BL/6J小鼠仍然可以看到和聞到CD-1鼠，但不能與CD-1鼠直接接觸。每天移動(dòng)C57BL/6J小鼠的位置，使得其每天被不同的CD-1鼠攻擊，慢性社交挫敗共持續(xù)10 d。

1.3 行為學(xué)測(cè)試

1.3.1 糖水偏好實(shí)驗(yàn)（sucrose preference test，SPT）

進(jìn)行這項(xiàng)測(cè)試是為了評(píng)估小鼠快感缺失[13]。每只小鼠的籠子里都放著2個(gè)形狀、大小、外觀相同的水瓶，一瓶裝有純凈水，另一瓶裝有1%的蔗糖溶液。瓶子隨機(jī)擺放在兩側(cè)。為避免外界干擾，測(cè)試在給小鼠足夠食物和安靜的環(huán)境中進(jìn)行。計(jì)算24 h內(nèi)糖水偏好百分比公示如下：

1.3.2 社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)（social interaction test，SIT）

該測(cè)試的目的是評(píng)估小鼠社交回避行為[14]。測(cè)試分為2個(gè)階段，每個(gè)階段持續(xù)2.5 min。在初始階段，將正方體空?qǐng)鰷y(cè)試箱（大小為50 cm×50 cm×50 cm）底部的其中一側(cè)的中間（范圍為9.5 cm×9.5 cm×6.5 cm）放入1個(gè)沒(méi)有CD-1鼠的網(wǎng)籠，然后將小鼠放在測(cè)試箱中央自由探索。第一階段結(jié)束后將小鼠拿出，并放回原來(lái)籠盒30 s，為了去除氣味，用酒精擦拭網(wǎng)籠和測(cè)試箱。第二階段，放入1個(gè)有CD-1鼠的網(wǎng)籠，將小鼠放在測(cè)試箱中央自由探索。當(dāng)小鼠進(jìn)入互動(dòng)區(qū)（網(wǎng)籠周圍20 cm×30 cm）計(jì)時(shí)并記錄。計(jì)算社交交互比率（social in?teraction ratio，SI），即在有CD-1小鼠的互動(dòng)區(qū)所花費(fèi)的時(shí)間— 466 —與在沒(méi)有CD1小鼠的互動(dòng)區(qū)所花費(fèi)的時(shí)間之比。

1.3.3 懸尾實(shí)驗(yàn)（tail suspension test，TST）

小鼠被懸掛在工作臺(tái)上30厘米處，其頭部距離工作臺(tái)15 cm，并用膠帶封住其尾巴后部的1/3共6 min。測(cè)量實(shí)驗(yàn)的最后4 min的不動(dòng)時(shí)間。根據(jù)小鼠在懸尾試驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間來(lái)評(píng)估與行為絕望一致的抑郁樣反應(yīng)[15]。

1.4 PET-CT掃描

使用[18F]DPA-714對(duì)小鼠大腦進(jìn)行PET-CT掃描。每組隨機(jī)選擇4只小鼠在通過(guò)外側(cè)尾靜脈注射[18F]DPA-714后，使用納米PET 掃描儀（Mediso Ltd.，Budapest，Hungary）進(jìn)行PET-CT掃描。在異氟烷麻醉下，將小鼠置于掃描儀視野的中心進(jìn)行全腦掃描，在PET掃描后0～20 min內(nèi)測(cè)量區(qū)域腦攝取值，以便對(duì)小鼠的攝取值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（standardizeuptake values，SUV）。對(duì)PET圖像進(jìn)行定量分析，計(jì)算公式如下：

1.5 免疫熒光分析

行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠。將腦組織灌注入含有0.01 M磷酸鹽緩沖液和4%多聚甲醛的溶液中進(jìn)行固定，然后在4 ℃下保存并用4%多聚甲醛固定。對(duì)腦組織進(jìn)行切片，厚度為3～5 μm，并將其包埋在石蠟中并干燥。在抗原提取之前，在微波爐中使用EDTA緩沖液（PH=8.0）處理25 min以去除蠟質(zhì)。隨后，在4 ℃下孵育時(shí)加入抗TSPO（1∶2 000，Abcam，UK）和抗Iba-1（1∶1 000，Novus，USA）。經(jīng)過(guò)PBS沖洗后，在37 ℃下與羊抗小鼠IgG（1∶100，Servicebio）和羊抗兔IgG（1∶100，Servicebio）結(jié)合熒光素異硫氰酸酯孵育90 min。然后，在給切片PBS 沖洗之前，使用DAPI溶液復(fù)染10 min。利用配備Fluoview FVX共聚焦掃描頭和激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus SP2 倒置顯微鏡，Leica Microsystems Heidelberg GmbH，Germany），將切片放置于載玻片上，并覆蓋玻片進(jìn)行掃描。通過(guò)Image J程序來(lái)確定海馬切片中GFAF、TSPO和Iba-1的免疫熒光強(qiáng)度。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

行為學(xué)測(cè)試后，將小鼠進(jìn)行大腦切除。將海馬在冰上分離，并立即在液氮中快速冷凍，然后儲(chǔ)存在-80 ℃下進(jìn)行隨后的RNA 提取。使用試劑盒（Tiangen Biotechnology，中國(guó)）從海馬組織中提取總RNA，并使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）測(cè)量濃度。然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Servicebio）將RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，該試劑盒使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（ABI Prism 7500）、SYBR Green qPCR預(yù)混液（High ROX）（Servicebio）和以下引物進(jìn)行擴(kuò)增：IL-1β（上游引物為5’-GCATCCAGCTTCAAATCTCGC-3’，下游引物為5’-TGTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG-3’）；TNF-α（上游引物為5’-GGCAGCCTTGTCCCTTG-3’，下游引物為5’-GCCTCCCTCTCATCAGTTCTA-3’）；IL-4（上游引物為5’-TGTCATCCTGCTCTTCTTTCTCG-3’，下游引物為5’-TTTGGCACATCCATCTCCGT-3’）。使用GAPDH作為參考，通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 9.5.1分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用單因素方差分析（ANOVA）各組間的差異，并采用t 檢驗(yàn)評(píng)估2 組間差異的顯著性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MaR1治療改善CSDS誘導(dǎo)的青少年期小鼠抑郁癥狀

10 d CSDS應(yīng)激后，在小鼠中觀察到抑郁樣行為。具體表現(xiàn)為，對(duì)照組相比，糖水偏好比降低（P=0.003）、在TST中的不動(dòng)時(shí)間增加（P=0.002），社會(huì)交互比率降低（P=0.000），結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，CSDS能夠成功誘導(dǎo)青少年期小鼠的抑郁樣行為。與CSDS+NS組相比，CSDS+MaR1組在TST中的不動(dòng)時(shí)間顯著降低（P=0.002），此外CSDS+MaR1組的糖水偏好比、社會(huì)交互比率均升高（P=0.019、0.004），結(jié)果說(shuō)明MaR1治療成功改善CSDS誘導(dǎo)的青少年期小鼠抑郁癥狀（表1）。

2.2 MaR1 治療降低體內(nèi)青少年期小鼠顱內(nèi)PET-CT 中[18F]DPA-714的SUV值

[18F]DPA-714 PET成像方法用于監(jiān)測(cè)3組小鼠的TSPO水平，以評(píng)估小膠質(zhì)細(xì)胞活化。標(biāo)準(zhǔn)化攝取值（SUV，g/mL）用于監(jiān)測(cè)全腦和不同腦區(qū)對(duì)[18F]DPA-714的攝取。在本研究中，每組各3 只雄性C57BL/6J 小鼠接受了[18F]DPA-714PET（圖1A）。結(jié)果如表2、圖1B所示。CSDS應(yīng)激誘導(dǎo)下，[18F]DPA-714信號(hào)在大腦中明顯增加。用MaR1治療逆轉(zhuǎn)了SUV的增加。具體而言，CSDS誘導(dǎo)下，青少年期小鼠海馬區(qū)域SUV較對(duì)照組增加（P=0.020），而MaR1治療組的小鼠，SUV值較CSDS+NS組有所緩解（P=0.029），這表明MaR1可能具有抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化的作用。

2.3 MaR1治療降低CSDS青少年期小鼠海馬體小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

對(duì)小鼠海馬區(qū)域小鼠腦片進(jìn)行免疫熒光染色，示意圖如圖2。對(duì)不同組間海馬體中小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1表達(dá)的差異進(jìn)行分析，同時(shí)使用Image J分析Iba-1、TSPO的免疫熒光強(qiáng)度。在海馬組織中，CSDS+NS組Iba-1、TSPO免疫熒光強(qiáng)度都明顯高于CON組（P=0.000、0.000）。用MaR1治療后逆轉(zhuǎn)了小膠質(zhì)細(xì)胞活化的趨勢(shì)，CSDS+MaR1組免疫熒光強(qiáng)度明顯低于CSDS+NS組（P=0.038、0.049）（圖3、表3）。

2.4 各組小鼠海馬炎癥因子的變化（IL-1β、TNF-α、IL-4）

每組隨機(jī)挑選3只小鼠，使用qRT-PCR技術(shù)測(cè)量它們體內(nèi)與小膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)的多種細(xì)胞因子的水平。與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子IL-1β 和TNF-α 升高（P=0.016、0.036）。研究結(jié)果表明，MaR1能夠部分逆轉(zhuǎn)CSDS誘導(dǎo)的促炎因子的表達(dá)，但這種差異并不顯著（Pgt;0.05）。與對(duì)照組相比，IL-4則呈下降的趨勢(shì)，MaR1也沒(méi)有逆轉(zhuǎn)此趨勢(shì)（圖4）。

3 討 論

本研究旨在探討MaR1對(duì)CSDS誘導(dǎo)青少年期小鼠抑郁樣行為的影響，驗(yàn)證其在CSDS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中的作用。結(jié)果表明，MaR1 治療改善了CSDS誘導(dǎo)的青少年期小鼠的抑郁樣行為和小鼠顱內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，而活體大腦的全腦細(xì)胞掃描和海馬組織的免疫熒光分析支持這一發(fā)現(xiàn)。

本研究通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估了CSDS誘導(dǎo)青少年期小鼠抑郁行為和抗炎藥物的治療效果。糖水偏好實(shí)驗(yàn)被用作快感缺乏（抑郁癥的核心癥狀）的評(píng)估[16]。CSDS應(yīng)激降低了小鼠的糖水偏好百分比，而MaR1 治療逆轉(zhuǎn)了小鼠的抑郁癥狀。同樣的，MaR1也明顯緩解了CSDS誘導(dǎo)的小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的不動(dòng)時(shí)間和社會(huì)交互比的下降，顯示出該藥物的抗抑郁效果。

越來(lái)越多的研究認(rèn)為神經(jīng)炎癥在包括抑郁癥在內(nèi)的腦部疾病中起著至關(guān)重要的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，當(dāng)被激活后其能夠產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和趨化因子，并導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病[17]。目前，TSPO-PET成像是用于推斷小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的最廣泛使用的體內(nèi)方法，并且TSPO可以作為抑郁癥等應(yīng)激相關(guān)疾病的假定治療效果的直接靶標(biāo)[18]。在1項(xiàng)薈萃分析中發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者的海馬、前額葉皮層、前扣帶皮層等區(qū)域的TSPO-PET信號(hào)明顯增加[19]，這與本研究結(jié)果一致。本課題組前期也在不同的抑郁動(dòng)物模型中觀察到[18F]DPA-714信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化[20-22]，然而先前對(duì)嚙齒動(dòng)物模型的研究主要集中在成年小鼠上，且并沒(méi)有人研究過(guò)青少年期抑郁小鼠模型的神經(jīng)炎癥變化。海馬作為與壓力和抑郁有關(guān)的最重要的區(qū)域之一。本研究觀察到[18F]DPA-714的SUV在青少年抑郁小鼠海馬區(qū)域中明顯增加，表明小膠質(zhì)細(xì)胞在海馬區(qū)域被激活。同樣的，MaR1治療抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，這提示該藥物可能通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活來(lái)減輕小鼠抑郁樣行為。此外，多項(xiàng)研究表明，與健康對(duì)照組相比，青少年抑期郁癥患者外周血中的TNF-α和IL-6水平明顯增加[23-25]，這表明炎癥細(xì)胞因子與青少年期抑郁癥之間存在很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)在CSDS誘導(dǎo)下，青少年期C57BL/6J小鼠的促炎因子IL-1β 和TNF-α 升高。MaR1 治療后，促炎因子的升高有緩解的趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，另外與前人研究不一致的地方[26]，本研究發(fā)現(xiàn)抑郁樣小鼠IL-4水平反而呈下降的趨勢(shì)，這可能是由于樣本量太小所致，有待進(jìn)一步的研究。

此外這項(xiàng)研究還有2個(gè)局限性：①?zèng)]有測(cè)量動(dòng)物大腦或者血液中的MaR1濃度，也沒(méi)有用不同濃度的MaR1進(jìn)行治療；②在本研究中只用了雄性小鼠，沒(méi)有排除性別和性激素的影響?？偠灾?，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MaR1能夠緩解CSDS誘導(dǎo)的青少年期小鼠抑郁樣行為，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。這些結(jié)果表明神經(jīng)炎癥是青少年抑郁癥的潛在致病因素，具有抗炎特性的藥物如MaR1有潛力作為臨床相關(guān)的抗抑郁藥，需要進(jìn)一步的研究。

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（責(zé)任編輯：周一青）